植物抗热基因htt3及其应用
【专利说明】植物抗热基因 HTT3及其应用
[0001] 本发明是申请号为CN 201110443047. 1的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术以及植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物抗热基因 及其应用。
【背景技术】
[0003] 温度逆境是影响蔬菜生产和限制其地域分布的主要因子之一。由于"温室效应"日 益加剧，高温天气出现越来越频繁，尤其是近年来我国长江流域夏季的持续高温，严重制约 粮食作物和果蔬类植物的生长和发育，农业生产面临严峻挑战。近50年中国长江流域共发 生重大水稻热害事件6次。最近一次发生在2003年，保守估计全流域受害面积达3 X IO7公 顷，损失稻谷达5. 18 X 107吨[1]。20世纪80年代末，我国南方柑桔产区曾遭受3次大范围 的高温热潮，给果蔬生产造成了巨大的损失。逆境胁迫可以引起植物体内一系列的生理生 化反应：细胞膜透性增大，胞质外渗量增加；膜脂过氧化程度加剧，MDA积累；活性氧含量增 加。植物体内启动抗氧化酶和非酶抗氧化物质发生应答性反应，以阻止、降低或修复由高温 造成的损伤 [2,3]。由此可见，逆境下的植物并不是被动承受伤害，而是主动的调节适应。正 是对这种逆境的不断适应过程，使植物在长期的进化过程中形成了完善的和复杂抗逆系统 以适应不良环境。因此，对植物抗热机理进行更深入的研宄，是认识植物与环境关系和培育 新的抗性品种的重要途径之一，在理论和应用方面都有重要意义。
[0004] 对植物抗热性的研宄已成为目前一项重要的研宄课题。受到种质资源的限制，传 统育种方法很难在短期内显著改良非耐热作物的抗热性，所以通过重组耐热物种的抗热基 因来实现提高非耐热作物的抗热性是现在研宄的重要方向。植物体受到高温等不良环境 胁迫时，体内自身的免疫系统会及时作出应急反应，产生一系列的应急反应，其中热激因子 (Heat Shock factor，HsF)是胁迫诱导过程中的主要转录因子，通过转录激活其下游革巴基 因的表达，产生各种各样的酶类，增加了膜脂饱和度，提高了可溶性蛋白和一些保护性细胞 组分的含量，保护机体蛋白质免遭损伤或修复已受损伤的蛋白质，对植物起保护作用，从而 使植物获得耐热性，提高生物体的应激能力和在逆境中的存活率 [2'3'4'5]。由于热激因子与 植物抗热性紧密联系在一起，因此热激蛋白及其下游基因的表达调控是当今分子生物学、 蛋白质生物化学和植物抗逆生理的一个重要研宄内容。很遗憾的是，对于其靶基因在植物 体内是如何启动并进行抗热生理响应的机制研宄尚不清楚。
[0005] 近年来分子生物学研宄发展迅速，尤其是基因芯片技术在作物分子育种上的应用 也越来越广泛 [6'7]。其快速、敏感、高效、定量地分析基因的表达变化，满足了对植物抗热基 因进行大通量的筛选需求。因此，本领域有必要以基因技术为平台，筛选在植物中具有抗热 能力的基因，进行植物品种改良，提高植物耐热性，为丰富和平衡我国农作物市场提供抗热 种质资源。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一类植物抗热基因及其应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种HTT多肽（Heat induced Ia-siR255Jargets)或 编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高植物耐热性。
[0008] 在一个优选例中，所述HTT多肽选自：
[0009] (a)具有SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:ll、SEQ ID NO:15、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的多肽；或
[0010] (b)将 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:15、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列经过一个或多个（如1-50 个；较佳地1-40个；较佳地1-30个；较佳地1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个）氨基 酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐热性功能的由（a)衍生的多肽；
[0011] (C)与 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列具有40% (较佳地50% ; 更佳地60 % ;更佳地70 % ;更佳地80 % ;更佳地90 % ;更佳地95 % ;更佳地98 % )以上相 同性，且具有提高植物耐热性功能的由（a)衍生的多肽。
[0012] 在另一优选例中，所述的编码HTT多肽的多核苷酸选自：具有SEQ ID N0:1，或 SEQ ID NO: 2,或 SEQ ID NO: 3,或 SEQ ID NO: 6,或 SEQ ID NO: 7,或 SEQ ID NO: 9、或 SEQ ID NO: 10、或 SEQ ID NO: 14,或 SEQ ID NO: 16,或 SEQ ID NO: 18、或 SEQ ID NO: 20 所示核苷酸 序列的多核苷酸。
[0013] 在另一优选例中，所述的植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠 耳芥属植物；更佳地选自白菜（Brassica.rapa)或拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，选自下组：
[0015] (a)具有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的多核苷酸；或
[0016] (b)将SEQ ID N0:23所示的核苷酸序列中第11-14位核苷酸经过一个或多个（如 1-8个；较佳的1-6个，更佳的1-5个，如2、3、4个）核苷酸的取代、缺失或添加而形成的， 且具有拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的功能的多核苷酸；或
[0017] (C)将SEQ ID NO: 24所示的核苷酸序列中第236-239位核苷酸经过一个或多个 (如1-8个；较佳的1-6个，更佳的1-5个，如2、3、4个）核苷酸的取代、缺失或添加而形成 的，且具有拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的功能的多核苷酸；或
[0018] (d)与上述（a)、（b)、（c)中所述核苷酸互补的核苷酸序列。
[0019] 在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于提高植物耐热性。
[0020] 在一个优选例中，所述植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠耳 芥属植物；更佳地选自白菜（Brassica.rapa)或拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种提高植物耐热性的方法，所述方法包括：提高植物 中HTT多肽的表达或活性；或
[0022] 降低植物中ta_siR255的表达或活性；或
[0023] 提高植物中ta_siR255的靶基因的表达。
[0024] 在一个优选例中，所述的方法包括：将编码HTT多肽的多核苷酸转入植物中；或
[0025] 将所述的多核苷酸转入植物中。
[0026] 在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
[0027] (i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码HTT多肽的多核苷酸 或所述的多核苷酸；
[0028] (ii)将植物细胞、组织或器官与步骤（i)中的农杆菌接触，从而使所述编码HTT多 肽的多核苷酸或所述的多核苷酸转入植物。
[0029] 在另一优选例中，所述方法还包括：
[0030] (iii)选择出转入了所述编码HTT多肽的多核苷酸或所述的多核苷酸的植物细 胞、组织、器官；以及
[0031] (iv)将步骤（c)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。
[0032] 在另一优选例中，所述植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠耳 芥属植物；更佳地选自白菜（Brassica.rapa)或拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0033] 在本发明的另一方面，提供一种耐热的植物，其是由前述方法制备获得的转基因 植物。
[0034] 在本发明的另一方面，提供一种HTT多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用作 鉴定植物的耐热性的分子标记物。
[0035] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0036] 图认-(：、！11'1'1、！111'2、！111'3、六七4629760 和六衍651670 的表达分析。其中，。1^表示 野生型植株。
[0037] 图1D、HTT1、HTT2、HTT3、At4G29760和AtlG51670以及其它候选基因的聚类关系 分析。
[0038] 图2、HTT1、HTT2和HTT3的序列特征分析。
[0039] A、HTT1、HTT2 和 HTT3 的 mRNA 上均存在 ta-siR255 的结合位点。
[0040] B、MM255过表达载体的构建示意图。
[0041] C、HTTL 1、HTT2 和 HTT3 启动子上均存在 nnGAAnnTTCnnGAAnn 和 AGGGG 基序。
[0042] 图3、HTT1、HTT2和HTT3过量表达的转基因株系热处理实验。
[0043] A-C过量表达的转基因株系热处理后的植株生长情况，各自的左图表示植物生长 情况，右图为左图中各分区所代表的植株的示意图。
[0044] D-G、定量RT-PCR分析mRNA在对照植株以及过表达植株中的积累量。
[0045] 图4A、Ta-siR255前体TASla、TASlb、TASlc在热处理前后的响应。
[0046] 图4B、Ta_siR255在热处理前后的响应。
[0047] 图5A、HTTl和HTT2过表达株系热处理后植株存活率。
[0048] 图5B、HTT3过表达株系热处理后植株存活率。
[0049] 图5C、MM255过表达株系热处理后三个株系存活率。
[0050] 图6、拟南芥中HTT多肽与白菜中相应多肽的同源性预测和分析。
【具体实施方