桑树乙烯响应因子及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种桑树乙烯响应因子(mmerf)基因的克隆和其在胁迫条件下的表达。

背景技术：

植物在生长发育过程中会遇到低温、干旱和盐碱等一些非生物性胁迫，它们是目前影响植物生长及作物产量的主要限制因子，植物为了适应周围的环境，当受到低温、干旱、高盐等胁迫时，细胞迅速感知外界胁迫信号并通过一系列信号传递过程，产生应激信号并汇集到细胞核内，最终激活特定转录调控因子，进而引发一系列生理、生化反应，形成高效有序的信号调控网络，从而对胁迫产生应答反应。

作为一种简单的植物气体激素，乙烯在植物的生长发育和逆境胁迫应答中发挥重要作用。乙烯参与调控植物的种子萌发、植株生长、开花、果实成熟、单性花的性别决定、器官衰老与脱落等生理过程，此外乙稀还在植物生物与非生物胁迫应答中发挥重要作用。植物体通过转录水平和转录后水平的协同调控来调节乙烯的生物合成和信号转导途径的开闭，协调乙烯信号途径与其它激素信号途径的交叉作用，完成各种生命活动和抵御各种逆境胁迫。

乙烯响应因子(ethyleneresponsivefactor，erf)是植物特有的一种转录因子，位于乙烯信号通路下游，可调控胁迫相关基因的表达，在植物对环境胁迫的应答方面起到重要的作用。erf不仅能通过结合与病程相关基因启动子中的一来调节它们的表达从而提高植物的抗病性，还能通过识别和其他非一顺式作用元件参与植物的非生物胁迫的应答。

目前，在水稻、小麦、番茄等植物中erf类基因的研究较多，但对桑树中的erf类基因研究还比较少。

我国是桑树的起源中心，种质资源极为丰富。经过桑树种质资源及育种工作者几十年的努力，现在全国已收集保存有近3000份桑树种质资源，其中不少资源都具有果用价值、药用价值、经济价值等。我们用克隆得到的鲁桑品种(morusmulticaulis)育71-1mmerf基因orf序列，通过生物信息学分析其序列特征。同时，利用荧光定量pcr的方法检测了mmerf基因在干旱、高盐、低温、aba胁迫条件下的转录水平的变化规律。通过对该基因的研究，使我们从分子水平了解到桑树mmerf基因在不同胁迫条件下的表达情况。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种桑树乙烯响应因子(mmerf)基因克隆和其在非生物胁迫条件下的表达，可以看桑树中的乙烯响应因子基因在环境胁迫下的表达调控。

对于桑树乙烯响应因子基因，本发明采用的技术方案是，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述桑树乙烯响应因子基因作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。

作为优选，所述植物为桑树，其拉丁文学名为morusmulticaulis。

作为优选，所述的非生物胁迫为干旱、高盐、低温、aba胁迫。

对于桑树乙烯响应因子基因编码的蛋白，本发明采用的技术方案是，其氨基酸序列如seqidn0.2所示。

上述桑树乙烯响应因子基因编码的蛋白作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。

作为优选，所述植物为桑树，其拉丁文学名为morusmulticaulis。

作为优选，所述的非生物胁迫为干旱、高盐、低温、aba胁迫。

本发明的有益效果是：

本发明完善桑树基因组同时探究桑树乙烯响应因子(mmerf)基因在非生物胁迫条件的表达分析，桑树mmerf的克隆将为进一步通过转基因技术培育抗性桑树新品种奠定基础，可有效弥补常规育种技术的不足，从而加速桑树抗性新品种的选育进程。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为荧光定量rt-pcr检测mmerf基因在高盐胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；ck：对照；1d：高盐处理1天；2d：高盐处理2天；4d：高盐处理4天；7d：高盐处理7天；10d：高盐处理10天。

图2为荧光定量rt-pcr检测mmerf基因在干旱胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；ck：对照；1d：干旱处理1天；3d：干旱处理3天；5d：干旱处理5天；10d：干旱处理10天；15d：干旱处理15天。

图3为荧光定量rt-pcr检测mmerf基因在4℃低温胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；ck：对照；12h：干旱处理12小时；1d：干旱处理1天；3d：干旱处理3天；6d：干旱处理6天；10d：干旱处理10天；rn2d：常温复性2天；rn5d：常温复性5天。

图4为荧光定量rt-pcr检测mmerf基因在aba胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；ck：对照；2h：aba处理2小时；6h：aba处理6小时；12h：aba处理12小时；1d：aba处理1天；3d：aba处理3天；5d：aba处理5天。

具体实施方式

实施例1桑树乙烯响应因子mmerf基因的克隆

1.1设计引物

供试桑树品种为保存于中国农业科学院蚕业研究所国家种质镇江桑树圃的育71-1。利用已获得的包含mmerf基因cdna片段的ests序列，设计引物克隆，并加以验证，引物序列如下：

mmmmerf-f：5′-aggaaaacaaatttctcgtca-3′；

mmmmerf-r：5′-aacgcaagttttcaaggtc-3′

根据已获得的基因orf序列设计进行荧光定量分析的引物，引物序列如下：

qmmerf-f：5′-ttccagggtttcaaggatgac-3′

qmmerf-r：5′-gttgttgagccacgagagaa-3′

根据ncbi上查找的在桑树中稳定表达的β-actin基因(genebank登录号：dq785808)序列设计内参基因的上下游引物，上游引物序列β-actin-f为5′-agcaactgggatgacatggaga-3′，下游引物序列β-actin-r为5′-cgaccactggcgtaaaggga-3′。

1.2桑树乙烯响应因子mmerf基因的克隆

使用takara试剂盒提取桑树嫩叶rna，提取步骤按照试剂盒说明书进行，电泳检测rna条带完整；并按照takara反转录试剂盒说明书将rna反转录成cdna。以合成的cdna第1链为模板，利用mmerf-f/r为引物进行pcr扩增，其中，pcr酶使用takara公司生产的extaq酶，pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火35s，72℃延伸40s，37个循环；72℃复性5min；4℃保存。电泳检测目的片段大小，使用takara公司agarosege1dnapurificationkit试剂盒纯化回收pcr产物，得到桑树mmerf基因片段，纯化方法参照试剂盒说明书。将目的片段用dna连接酶与pmdtm18-t载体连接。连接产物转化到宿主菌e.colitop10菌株感受态细胞，涂布于在含有amp的lb固体平板上。挑取单菌落培养后送样，由生工生物工程(上海)有限公司完成测序，测序结果进行blast分析，获得1500bp的包含完整orf的mmerf基因序列(genbankaccessionnumber：mf188168)，其中，包括140bp的5′-utr，193bp的3′-utr和1167bp的完整orf。

实施例2桑树乙烯响应因子mmerf基因的生物信息学分析

利用在线分析工具psort和smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)，根据已报道的文献对目的基因进行核定位序列的预测及蛋白质结构域的分析，桑树乙烯响应因子mmerf蛋白有一个由64个氨基酸残基组成的ap2/erf结构域，位于蛋白的中部，其中，第14位和第19位氨基酸残基分别为丙氨酸(a)和天冬氨酸(d)，说明它为典型的erf转录因子。

利用dnastar软件和在线分析软件expasy(http:∥prosite.expasy.org/prosite.html/)对桑树乙烯响应因子mmerf基因进行较全面的分析，获得该基因所编码的氨基酸序列seqidno.2，基因编码桑树乙烯响应因子mmerf蛋白质的等电点为5.02，分子质量为43.30kda。

实施例3桑树乙烯响应因子mmerf基因在各种胁迫条件下的表达模式

在供试桑苗的新梢生长至约20cm长时，对桑苗分别进行干旱、高盐、低温、aba胁迫处理。在整个胁迫诱导处理过程中，所有试验用苗的温度，光照强度，光周期以及湿度等非生物条件均保持不变。当桑苗在各种胁迫处理下表现出明显受害症状时，分别取对照和各种胁迫条件下的桑树幼叶，用铝箔纸包裹后迅速投入液氮中，放于-80℃的冰箱中保存。采用荧光定量pcr的方法，以桑树稳定表达的肌动蛋白基因(β-actin)作为内参，测定桑树在胁迫条件下目的基因的表达水平。所有胁迫实验均为3个生物学重复3个技术重复。

高盐胁迫：供试桑苗用浓度为300mm的nacl溶液进行盐胁迫诱导处理。试验桑苗和对照桑苗放置于同一个光照培养箱，温度25℃，每天16小时光照，8小时黑暗。分别于1天、2天、4天、7天和10天时取盐胁迫条件下的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

干旱胁迫：供试桑苗放置于温度25℃光照培养箱，一直不浇水，每天16小时光照，8小时黑暗。分别于1天、3天、5天、10天和15天取桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

低温胁迫：供试桑苗放置于温度4℃光照培养箱，每天16小时光照，8小时黑暗。分别于12小时、1天、3天、6天和10天取桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料，后放置于温度25℃光照培养箱进行常温复性，每天16小时光照，8小时黑暗，复性2天和5天取桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

aba胁迫：供试桑苗用浓度为0.1mol/l的aba溶液进行aba胁迫诱导处理，放置于温度25℃光照培养箱，每天16小时光照，8小时黑暗。分别于2小时、6小时、12小时、1天、3天和5天取桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

不同非生物胁迫下桑树乙烯响应因子mmerf基因相对表达量变化显示：高盐胁迫条件下，mmerf基因相对表达量均比正常生长条件下低，总体的趋势是先缓慢下降，在处理4天时降到最小值(对照的0.52倍)，然后再缓慢上升，最后到第10天上升到对照的0.85倍(图1)。干旱胁迫条件下，mmerf基因相对表达量整体趋势表现上调，随着干旱处理时间的延长，mmerf基因相对表达量逐渐升高，在第15天时达到最大值，为对照的3.69倍(图2)。低温胁迫条件下，mmerf基因的相对表达量整体趋势表现明显上调，持续处理1天后上调到较高值(对照的2.53倍)，然后缓慢下降后急速上升到这几个阶段的最大值(对照的3.89倍)，经常温复性2天，表达量回落，继续复性5天后，表达量恢复到接近对照值(图3)。aba胁迫条件下，mmerf基因相对表达量整体趋势表现下调，随着aba胁迫处理时间的延长，mmerf基因相对表达量先是逐渐下降，在第12小时降到最小值，为对照的0.33倍，后缓慢升高，到第5天保持在对照的0.78倍左右(图4)。mmerf基因在各种胁迫条件下都有明显的波动状态，这表明mmerf可能发挥其功能，在非生物胁迫条件下，诱发mmerf基因的表达，使植物积极响应外界胁迫。通过荧光定量pcr分析，利用mmerf基因在干旱胁迫、高盐胁迫、低温胁迫和aba胁迫条件下总体表达的升降情况、在不同的胁迫时间内相对基因表达量指标，以及mmerf基因在植物中的保守性，可以以此标识植物是否处于高盐、低温、干旱或aba胁迫等生长环境。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

sequencelisting

<110>安徽省农业科学院蚕桑研究所

<120>桑树乙烯响应因子mmerf及其应用

<130>no

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1500

<212>dna

<213>mmerf

<400>1

aggaaaacaaatttctcgtcaacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactttcttctc60

tgaaaaatctcaaaccttttttcttgattctctgcaagaggtgttttggatccgggttgt120

ttgttgtgcagtgaaggagaatgtgtggaggtgctattatctccgacttcatctcgacgc180

cgcggtccacgcgtctgaccgcggactacctctggccggatctgaagaaatccggctccg240

gcaagcgcttctgcaagcctgtgagatcggtgatcgtcgacatcgacgatgacttcgagg300

ctgatttccagggtttcaaggatgactccgacgtcgacaacgacgacgacgttatagatg360

tcaagcctttcgctttctctgctcgcaagcccaccttctctcgtggctcaacaactgtga420

aatataccgaatctgatgggcaagctgagaaatctgcaaagagaaagagaaagaaccagt480

ataggggaattcggcagcgcccatggggtaagtgggctgctgagatccgcgaccctagga540

aaggtgtccgggtttggctcggaactttcaacactgctgaagaagctgcaagagcttatg600

atgctgaggcacgacgaatccgtggtaagaaagccaaggtgaatttcccagatgaaactc660

cgcgtgctttgcctaaacatcctgttaaggaaagtcctaagagatcactgcccaaggaaa720

attcgaactccaccgagtcgaatttgaacaatcaaagtttcaattttgtgaataactctg780

atctggactactacaatgctatgggttttctggaagagaaaccgctgactaatcaatatg840

agcatgtggagactctccctgctaaagcggatgttggactcaaatccaatgctccagctg900

ctactactccgctgtatttcagttctgatcagggtagcaattcatttgagtgttccgact960

ttgggttgggagaacatggctcaaagactccagaaatttcttctgttttctcagccactt1020

cagaaaatgatgactcgctatttcttgaggatactaacccaacaaagaagctgaagtctg1080

actcagagaatgcggtgcttcctgaagaaaatcatgcaaagactctgtcagaggagcttt1140

cggctttcgagtctcagatgaagttctttcagatgccatatcttgagggaagctgggatg1200

cgttattggacaccttcctcgctggcgattcaactcaggatggtggaaactctatcaatc1260

tttggagttttgatgacttctccaccgtgtctggcgaagccttctaagccaattccccag1320

ctttcctaattaatgtaaataaggctacatgaattgtttatctgcataaggattgcacaa1380

acagatgaacatgcacaagccttgtatggagagtgattcgaggtagctaatatcggtgta1440

tggcgagtatatagatattaggttttacttcttaccttgaagaccttgaaaacttgcgtt1500

<210>2

<211>388

<212>蛋白质1

<213>mmerf蛋白

<400>1

mcggaiisdfistprstrltadylwpdlkksgsgkrfckpvrsvivdidddfeadfqgfk60

ddsdvdndddvidvkpfafsarkptfsrgsttvkytesdgqaeksakrkrknqyrgirqr120

pwgkwaaeirdprkgvrvwlgtfntaeeaaraydaearrirgkkakvnfpdetpralpkh180

pvkespkrslpkensnstesnlnnqsfnfvnnsdldyynamgfleekpltnqyehvetlp240

akadvglksnapaattplyfssdqgsnsfecsdfglgehgsktpeissvfsatsenddsl300

fledtnptkklksdsenavlpeenhaktlseelsafesqmkffqmpylegswdalldtfl360

agdstqdggnsinlwsfddfstvsgeaf388