专利名称：Spt事件侧翼的植物基因组dna及用于鉴定spt事件的方法
技术领域：
本发明的实施方案涉及植物分子生物学领域。更具体地，本发明的实施方案涉及 含有制种技术(seed production technology) (SPT)事件和位于转基因序列侧翼的植物基 因组DNA的转基因玉米植物。
背景技术：
植物中外源基因的表达已知能被其在植物基因组中的位置所影响，也许是由于 整合位点附近的染色质结构(例如异染色质)或转录调节元件(例如增强子)的接近 (ffeising, et al.，(1988)Ann. Rev. Genet 22:421-477)。同时，位于基因组中不同位置的 转基因的存在以不同方式影响植物的总体表型。因此，通常，为了鉴定以引入的目的基因的 最适表达为特征的事件而必需筛选大量事件。例如，已经在植物和其他生物体中观察到在 事件之间，引入的基因的表达水平可以存在广泛的变化。表达的空间或时间模式中也可以 存在差别，例如，不同植物组织中转基因的相对表达的差别，这可能不符合预期来自引入的 基因构建体中存在的转录调节元件的模式。还观察到转基因插入可以影响内源基因表达。 因此，产生数百至数千的不同事件并且为了具有用于商业目的的所需转基因表达水平和模 式的单一事件而筛选那些事件是常见的。具有所需转基因表达的水平或模式的事件对于使 用常规育种方法通过有性远交将转基因渗入到其他遗传背景中是有用的。这些杂种的子代 保持最初转化体的转基因表达特性。该策略用于确保许多良好适应于局部生长条件的品种 中可靠的基因表达。能够检测植物或种子或这些植物或种子的子代中特定事件的存在或不存在是有 利的，这不仅涉及转基因自身，还涉及其在宿主植物或种子的基因组中的位置。能够为了确 定有性杂交的子代是否含有目的转基因而检测事件的存在是特别有利的。此外，用于检测 特定事件的方法对于以下是有帮助的符合需要源自重组作物植物的食品的上市前许可和 标签的规定，或环境监测、监测田地中作物的性状或监测源自作物收获的产品中的用途，以 及确保各方对规章性或合同性条款的遵守中的用途。事件特异性检测方法可以鉴定插入的 DNA和受体基因组之间独特的接合(junction)。发明概述如本文所述，玉米通过SPT事件的插入已被修饰。相关描述也提供在美国专利申 请公开第US2009/0038(^6号和美国专利申请公开第2006/(^88440号。表12中总结了用 于生成事件E6611. 32. 1. 38的PHPM597的T-DNA中的遗传元件。提供了涉及含有特定外源DNA的转基因玉米植物的组合物和方法，所述特定 外源DNA通过标准玉米转化被引入，在本文被称为“制种技术(SPT)事件”或“事件 E6611. 32. 1. 38”或“E6611. 32. 1. 38”或“事件DP-32138-1”或“DP-32138-1”或“事件 32138” 或“32138”。转化的植物或种子也可以称为“32138”或“32138玉米”。还提供了对于生成 转基因事件有用的构建体，和对于鉴定导致包含SPT事件的转基因植物的特定转基因事件 有用的材料和方法。
还提供了保藏为ATCC专利保藏第PTA-9158号种子和源自其的植物、植物细胞、 植物部分、谷类和植物产品。本申请人在2008年4月15日于美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection(ATCC ), Manassas, VA 20110-2209 USA)进行了 至少2500粒玉米事件32138 (指定为E6611. 32. 1. 38)的种子的保藏，并且该保藏被指定 为ATCC保藏第PTA-9158号。这些保藏会根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布 达佩斯条约的条款保持。进行这些保藏仅仅是作为本领域技术人员的方便，而不是承认 根据35 U. S. C. §112需要保藏。2008年4月15日于ATCC保藏的种子取自由先锋国际 良禾中(Pioneer Hi-Bred International, Inc.), 7250NW 62nd Avenue, Johnston, IA 50131-1000保持的保藏。在该申请未决期间，专利与商标局长(Commissioner of Patents and Trademarks)和局长根据请求所确定的有权人可以获得该保藏。一旦本申请的任何权 利要求被准许，本申请人会根据37C. F. R. § 1.808将使公众可获得所做保藏样品。该玉米 事件32138的种子的保藏会保持在作为公共保藏处的ATCC保藏处，时间为30年或最近的 请求后5年或本专利可实施的年限，以较长的为准，并且如果在该期间中其变为非有活力 的，则会被替换。此外，本申请人已满足37 C.F.R. § § 1.801-1. 809中所有的要求，包括在 保藏时提供样品活力的说明。本申请人无权免除法律对于生物材料的转移或其在商业中的 运输所施加的限制。本申请人不放弃追究对该专利赋予他们的权利或根据植物品种保护法 (Plant Variety Protection Act) (7 USC 2321及以下)适用于事件32138的权利的任何 侵犯。禁止未经许可的种子繁殖。种子可以被监管。本发明的其他实施方案涉及本文所述的特异侧翼序列，所述侧翼序列可以用于开 发生物样品中E6611. 32. 1. 38的特异性鉴定方法。其他实施方案涉及E6611. 32. 1. 38的左 边界和/或右边界侧翼区，其可以用于特异性引物和探针的开发。本发明的其他实施方案 涉及基于这些特异性引物或探针的使用的生物样品中E6611. 32. 1. 38的存在的鉴定方法。按照本发明的另一实施方案，提供了检测样品中对应于事件E6611.32. 1.38的 DNA的存在的方法。在特定实施方案中，方法包含(a)将包含DNA的样品与DNA引物组接 触，当所述引物组与从包含事件E6611. 32. 1.38的植物中提取的基因组DNA在核酸扩增反 应中使用时，所述引物组产生对于事件E6611. 32. 1. 38是诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩 增反应，从而产生所述扩增子和(c)检测所述扩增子。例如
图11中所示序列的包含新的转基因/侧翼插入区的DNA分子，或与所述DNA 分子同源的或互补的分子是本发明的实施方案。其他实施方案包含DNA序列，所述DNA序列包含SEQ ID NO :1或图11的新的侧 翼和转基因侧翼/插入区。包含足够长度的SEQ ID NO 1或图11的转基因插入物序列的 多核苷酸和足够长度的SEQ ID NO 1或图11的玉米基因组和/或侧翼序列的多核苷酸的 DNA序列是本发明的另外的实施方案，所述DNA序列作为引物序列可用于产生对于包含事 件E6611. 32. 1. 38的植物是诊断性的扩增子产物。本发明的其他实施方案包括包含32138玉米的T-DNA区的DNA序列的转基因部分 的至少11个或更多个核苷酸的DNA序列，或其互补物，以及相似长度的SEQ ID N0:1或图 11所示的侧翼玉米DNA序列，或其互补物。这些DNA序列可以作为DNA引物用于DNA扩增 方法。使用这些引物产生的扩增子对于事件E6611. 32. 1. 38是诊断性的。因此，本发明的实 施方案还包括由DNA引物产生的扩增子，所述DNA引物与单独的32138玉米的转移的T-DNA
5区或其与鉴定出的侧翼序列的组合是同源的或互补的。按照本发明的另一实施方案，提供了检测样品中对应于事件E6611.32. 1.38的 DNA分子的存在的方法，该方法包含(a)将包含从植物中提取的DNA的样品与DNA探针接 触，所述探针包含在严紧杂交条件下与从事件E6611. 32. 1. 38中提取的DNA杂交并且在严 紧杂交条件下不与对照植物DNA杂交的分子；(b)使样品和探针处于严紧杂交条件下，和 (c)检测探针与DNA的杂交。更具体地，本发明的另一实施方案包含检测样品中对应于事件 E6611. 32. 1. 38的DNA分子的存在的方法，该方法由以下组成(a)将包含从玉米植物提取 的DNA的样品与由例如接合序列的对于该事件是独特的序列所组成的DNA探针分子接触， 其中所述DNA探针分子在严紧杂交条件下与从包含玉米事件E6611. 32. 1. 38的植物提取的 DNA杂交并且在严紧杂交条件下不与对照玉米植物DNA杂交；(b)使样品和探针处于严紧杂 交条件下，和(c)检测探针与DNA的杂交。本发明的另一实施方案还涉及用于鉴定生物样品中事件E6611. 32. 1.38的DNA 检测试剂盒。所述试剂盒包含用于PCR鉴定操作步骤中的第一引物和第二引物，所述第 一引物特异性地识别E6611. 32. 1. 38的左或右边界侧翼区，所述第二引物特异性地识别 E6611. 32. 1. 38的外源DNA内的序列。本发明的其他实施方案涉及用于鉴定生物样品中事 件E6611. 32. 1. 38的试剂盒，所述试剂盒包含特异性探针，所述特异性探针具有对应于以 下序列或与以下序列互补的序列与事件E6611. 32. 1. 38的特异区具有80%至100%的序 列同一性的序列。探针的序列对应于包含事件E6611. 32. 1.38的5'或3'侧翼区的部分 的特异区。本发明的其他实施方案涉及为了不同目的使用本发明的实施方案所包括的 方法和试剂盒，所述不同目的例如但不限于以下鉴定植物、植物材料或产品中的事件 E6611.32. 1.38，所述产品例如但不限于包含或源自植物材料的食品或饲料产品(新鲜的 或加工过的)；为了转基因和非转基因材料之间的分离，鉴定转基因植物材料；以及确定包 含玉米事件E6611. 32. 1. 38的植物材料的质量。所述试剂盒还可以含有检测方法的实施所 必需的试剂和材料。在另一方面中，本发明提供用于产生包含事件E6611. 32. 1.38的子代植物的方 法。所述子代植物可以是近交(inbred)或杂交植物。在其他应用中，本发明提供用于实施 对于事件E6611. 32. 1. 38的标记(marker)辅助育种的方法。按照本发明的另一方面，提供 了包含事件E6611. 32. 1. 38的稳定转化的玉米植物。附图概述图1提供了 PHPM597的质粒图谱。质粒大小为52869bp。图2提供了来自质粒PHPM597的T-DNA区的图谱。所使用的探针的位置如图谱 下方盒所示并且标识为以下
权利要求
1.用于鉴定生物样品中事件E6611.32. 1.38的方法，其包括使用特异性识别SEQ ID NO :1的T-DNA插入物内的序列的探针或第一引物和特异性识别SEQ ID NO=I的任一侧翼 序列内的序列的另一探针或第二引物检测E6611. 32. 1. 38特异区。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括使用利用至少两条引物的聚合酶链式反应，从 所述生物样品中存在的核酸扩增DNA片段，其中所述第一引物识别SEQ ID NO :1的T-DNA 插入物内的序列，并且第二引物识别SEQ ID NO 1的任一侧翼序列内的序列。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一引物选自SEQID N0S:7、9、10、11、12、13和 14，并且所述第二引物选自 SEQ ID NOS :6、8、15、16、17、18 和 19。
4.检测生物样品中事件E6611.32. 1. 38或其子代的存在的方法，其包括(a)从所述生物样品提取DNA样品；(b)提供DNA引物对，其中所述引物中的一条识别SEQID NO 1的任一侧翼序列内的 序列，并且所述引物中的另一条识别SEQ ID NO 1的T-DNA插入物内的序列；(c)提供DNA扩增反应条件；(d)进行DNA扩增反应，从而产生DNA扩增子分子；和(e)检测所述DNA扩增子分子，其中所述DNA扩增子分子在所述DNA扩增反应中的检出 表明事件E6611. 32. 1. 38的存在。
5.分离的DNA分子，其包含通过权利要求4所述方法产生的任一扩增子。
6.检测样品中对应于E6611.32. 1. 38事件的DNA的存在的方法，所述方法包括(a)将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严紧杂交条件下与 来自事件E6611. 32. 1. 38的DNA杂交并且在所述严紧杂交条件下不与非E6611. 32. 1. 38植 物DNA杂交；(b)使所述样品和探针处于严紧杂交条件；和(c)检测所述探针与所述DNA的杂交，其中杂交的检出表明E6611.32. 1. 38事件的存在。
7.分离的DNA核苷酸引物序列，其包含选自SEQID NOS :2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19的序列或其互补物。
8.分离的DNA分子，其包含由SEQID NO 6和7 ；或SEQ ID NO 8和9 ；或SEQ ID NO 14和15的引物对扩增的接合(junction)序列。
9.用于筛选种子的事件E6611.32. 1. 38的存在的方法，其包括使用特异性引物或探针 的E6611. 32. 1. 38特异区的检测，所述引物或探针特异性识别事件E6611. 32. 1. 38的接合 (junction)序列。
10.分离的DNA序列对，每一所述DNA序列包含至少10个核苷酸并且当在DNA扩增程 序中共同使用时，会产生对于事件E6611. 32. 1. 38是诊断性的扩增子。
11.如权利要求10所述的分离的DNA序列对，其中所述对的第一成员选自SEQID NOS 7、9、10、11、12、13 和 14，并且所述对的第二成员选自 SEQ ID NOS :6、8、15、16、17、18 和 19。
12.如权利要求5所述的扩增子，其中所述扩增子具有SEQID而25、观或32的序列。
13.包含事件E6611.32. 1. 38的植物。
14.由权利要求13所述植物产生的种子。
15.转基因植物、细胞、组织、种子或其含有DNA的部分，其代表性种子已经以登录号PTA-9158保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。
16.植物或其含有DNA的部分，所述植物或其含有DNA的部分包含SEQID NO :1的核 苷酸2115至11996的DNA插入物。
17.植物或其含有DNA的部分，所述植物或其含有DNA的部分包含SEQID N0:1的核 苷酸2071至2170的DNA。
18.植物或其含有DNA的部分，所述植物或其含有DNA的部分包含SEQID NO=I的核 苷酸 11951 至 12050 的 DNA。
全文摘要
提供了涉及包含制种技术的转基因植物的组合物和方法。具体地，提供了具有赋予制种技术的E6611.32.1.38事件的玉米植物。在已述染色体位置携带E6611.32.1.38事件的植物包含所述的基因组/转基因接合。位于整合的E6611.32.1.38事件侧翼的植物基因组DNA可以用于设计会特异性针对E6611.32.1.38事件的测定法。E6611.32.1.38事件的基因组插入位点的表征为增强的育种效率做准备并且使利用分子标记在育种群体及其子代中追踪转基因插入物成为可能。提供了用于玉米E6611.32.1.38事件的鉴定、检测和使用的多种方法和组合物。
文档编号C12N15/82GK102119216SQ200980113123
公开日2011年7月6日 申请日期2009年2月16日 优先权日2008年2月14日
发明者乔舒亚·K·永, 仲晓燕, 埃兰·克罗盖, 大卫·洪德莱德, 尼娜·迪耶特里希, 肯特·布灵克 申请人:先锋国际良种公司, 纳幕尔杜邦公司