屈曲病毒蛋白共有序列、编码该屈曲病毒蛋白共有序列的核酸分子和组合物及其使用方法

专利名称：屈曲病毒蛋白共有序列、编码该屈曲病毒蛋白共有序列的核酸分子和组合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及用于个体预防性地和/或治疗性地免疫屈曲病毒的疫苗和方法。
背景技术：
本申请要求美国临时申请第61/042，661号的优先权，该美国临时申请以引用的 方式并入本文。免疫疗法指调节人体免疫应答以达到理想的治疗效果。免疫治疗剂指当施用于个 体时调节个体免疫系统的那些组合物，所述调节足以最终减轻与不期望的免疫应答相关的 症状或足以最终通过增加期望的免疫应答而缓解症状。在一些情况下，免疫疗法是接种方 案的一部分，其中给个体施用疫苗使个体暴露于免疫原(在此类情况下个体对该免疫原产 生免疫应答)，免疫治疗剂增加免疫应答和/或选择性增强预期治疗或预防特定病症、感染 或疾病的免疫应答的一部分(例如细胞免疫部分或体液免疫部分)。可通过递送调节人体免疫应答而诱发改进的免疫应答的制剂来完善疫苗方案。 在 一些接种方案中，其中给个体施用疫苗使个体暴露于免疫原(个体对该免疫原产生免疫应 答)，提供增加免疫应答和/或选择性增强预期治疗或预防特定病症、感染或疾病的免疫应 答的一部分(例如细胞免疫部分或体液免疫部分)的制剂。疫苗可用于使个体免疫靶抗原，所述靶抗原为例如变应原、病原体抗原或与人类 疾病有关的细胞相关的抗原。与人类疾病有关的细胞相关的抗原包括癌症相关肿瘤抗原和 与自身免疫疾病有关的细胞相关的抗原。在设计此类疫苗时，已发现在受接种个体的细胞中产生靶抗原的疫苗有效诱发免 疫系统的细胞免疫部分。特别地，减毒活疫苗、利用无毒载体的重组疫苗以及DNA疫苗各自 使得在受接种个体的细胞中产生抗原，从而形成免疫系统细胞免疫部分的诱发。另一方面， 尽管死疫苗或灭活疫苗以及仅包含蛋白的亚单位疫苗确实诱发有效的体液应答，但它们不 诱发良好的细胞免疫应答。细胞免疫应答通常是对病原体感染提供保护和对治疗病原体感染、癌症或自身免 疫疾病提供有效免疫介导疗法所必要的。因此，通常优选的是在受接种个体的细胞中产生 靶抗原的疫苗，例如减毒活疫苗、利用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗。屈曲病毒(CHIKV)是一种热带非洲和亚洲本土的α病毒，该病毒在那里通过感 染的蚊子(通常是伊蚊属[1])叮咬而传播至人类。屈曲热是由CHIKV引起的疾病，在 1952-1953期间首次在东非以流行病形式被发现[2]。CHIKV对人类的感染可以引起以发 热、头痛、皮疹、不适、恶心、呕吐、肌痛、严重关节痛和偶发神经系统表现(例如急性四肢无 力)为表征的综合征。它还伴有致命的出血性病症。其他症状包括肌肉疼痛和眼窝后疼痛。 屈曲疾病很少致命，但是伴有显著的发病率。屈曲病具有大约1-2周的潜伏期。认为词语 “屈曲”源于当地方言对受伴随该疾病的严重关节疼痛折磨的患者扭曲姿势的描述[1-3]。因为屈曲具有可产生突然令人衰弱的疾病的流行潜能，因此对发展中国家来说屈 曲是潜在的威胁，并且基于其持续蔓延以及由于在新兴的流行区冲突地带的士兵部署而造成的相当多的军事威胁，屈曲对发达国家也是潜在的威胁。CHIKV感染对经济有显著影响，因为该感染的症状使雇员无能力工作，导致流行病区停工，影响当地商业。这种经济影响对 数周或数月不能工作的个体家庭成员是最大的。由于使人衰弱的感染后遗症，特定抗病毒 治疗方法的缺乏和预防该疾病的任何目前可用疫苗的缺乏是管理或控制新CHIKV爆发的 主要障碍。CHIKV通过感染的蚊子叮咬而传播。蚊子在吸食CHIKV感染个体时被感染。猴子 和可能的其他野生动物也可能被感染，但是它们作为CHIKV储库的作用还没有文献记载。 感染的蚊子则可以在它们叮咬时将病毒传播给其他人。埃及伊蚊(黄热蚊)在家用容器中 繁殖并且在白天侵犯性地叮咬人类，是人类CHIKV的主要载体。白纹伊蚊(亚洲虎蚊)也 可以在亚洲人类传播中起作用，在非洲已经发现各种林居蚊类被病毒感染[11-17]。因为 CHIK热流行病通过人类_蚊子-人类传播来维持，流行病周期类似于登革热和城市黄热病 的流行病周期。最近已经报道了印度洋和印度的几个岛屿的CHIK热的大规模爆发。自2004年末以来，屈曲病毒在世界各地(主要在印度洋岛屿)以大规模爆发形式 再现。在2006年初，在冬季较低传播期之后并随着南半球夏季的到来，留尼旺岛遭受了爆 炸性的爆发。报道估计266，000居民(共有770，000人口)感染CHIKV，并且248份死亡证 明书将CHIKV作为可能的死亡病因[10，12]。文献记载了孕妇宫内感染和垂直传播的证据 [12，13，17]。序列分析揭示了地理上集群的病毒谱系的存在。基于部分El序列的种系发 育分析揭示了三个不同的CHIKV种群的存在一个是西非分离株，另一个包括亚洲分离株， 以及一个再分为东非、中非和南非分离株[15，17]。2006年，在从已知发病区返回欧洲、加拿大、加勒比(马丁尼克岛)和南美(法属 圭亚那)的旅行者中也已经报道了 CHIK热病例[5-9]。2005-2006期间，在疾病控制中心 (美国)从CHIK热流行病或地方病的已知区域到达美国的旅行者中根据血清学和病毒学诊 断出了 12例CHIK热[10]的病例。这些感染已经引起公共健康危机并引起了全世界研究者的关注。重要的是，大部 分屈曲病毒感染在数周或数月内完全消退。然而，已经有文献记载了 CHIKV诱发的持续数 年的关节痛病例，并进而发展成为慢性关节问题。感染在较长时间之后消退的事实证明，免 疫系统最终可以集合起来控制该感染。而且，这种清理表型证明在T细胞应答清理中的作 用。早期研究屈曲疫苗，诸如福尔马林灭活疫苗、吐温醚灭活病毒疫苗和减毒活疫苗的尝试 取得了一定成功，然而，这些尝试由于各种原因而没有继续下去[3]。而且，据报道所有这些 疫苗仅产生血清学应答，而没有诱发有用的细胞免疫。最近在印度洋和留尼旺岛的流行病频发表明一种新的载体可能携带病毒，因为在 那里没有发现埃及伊蚊。事实上，相关的亚洲虎蚊(白纹伊蚊)可能是罪魁祸首，已经在世 界卫生界引起对CHIK病毒大范围流行可能的担忧。因此，应该采取步骤来研究控制CHIKV的方法。不幸的是，目前没有针对屈曲病 毒的特定的治疗方法，目前也没有可用的疫苗。最近的研究表明，被膜E1-A226V突变直 接导致白纹伊蚊CHIKV感染性显著增加，并且进一步证实单个氨基酸取代可以影响载体特 异性。该发现提供了该突变病毒如何在缺乏典型昆虫载体的区域引起流行病的合理解释 [18]。还没有研究出针对屈曲热的特定疫苗或特定抗病毒治疗方法。减毒活疫苗试验曾在 2000年进行，但是该项目的资金来源被中断，并且目前没有可用的疫苗。但是，有文献详细记载了与该先前疫苗相关的几个不良事件，因此，必须开发新的疫苗策略[3，5]。2005-2007屈曲热爆发的巨大规模凸显出对安全有效的CHIKV疫苗的需求[6]。人 们仍然需要可防止个体受CHIKV感染的疫苗。人们仍然需要有效治疗患有CHIKV感染的个体的治疗方法。发明概述本发明涉及一种包含分离的核酸分子的组合物，所述分离的核酸分子编码CHIKV 蛋白El的共有序列或其免疫原性共有片段。本发明涉及一种包含分离的核酸分子的组合物，所述分离的核酸分子编码CHIKV 蛋白E2的共有序列或其免疫原性片段。本发明涉及一种包含分离的核酸分子的组合物，所述分离的核酸分子编码CHIKV 蛋白衣壳的共有序列或其免疫原性共有片段。本发明涉及一种包含分离的核酸分子的组合物，所述分离的核酸分子编码嵌合基 因，所述嵌合基因包含CHIKV蛋白E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3的共有序列或它们的 同源序列或它们的免疫原性共有片段或它们的免疫原性共有片段的同源序列，这些序列编 码诱发对CHIKV蛋白El、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3各自的免疫应答的免疫原性氨基 酸序列。本发明涉及包含分离的核酸分子的可注射药物组合物，所述分离的核酸分子编码 CHIKV蛋白El的共有序列或其免疫原性共有片段。本发明涉及包含分离的核酸分子的可注射药物组合物，所述分离的核酸分子编码 CHIKV蛋白E2的共有序列或其免疫原性共有片段。本发明涉及包含分离的核酸分子的可注射药物组合物，所述分离的核酸分子编码 CHIKV蛋白衣壳的共有序列或其免疫原性共有片段。本发明涉及包含分离的核酸分子的可注射药物组合物，所述分离的核酸分子编码 嵌合基因，所述嵌合基因包含CHIKV蛋白El、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3的共有序列或 它们的同源序列或它们的免疫原性共有片段或它们的免疫原性共有片段的同源序列，这些 序列编码诱发对CHIKV蛋白El、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3各自的免疫应答的免疫原 性氨基酸序列。本发明还涉及诱发个体中对CHIKV免疫应答的方法，该方法包括为所述个体施用 包含分离的核酸分子的组合物，所述分离的核酸分子编码CHIKV蛋白El的共有序列或其免 疫原性共有片段。本发明还涉及诱发个体中对CHIKV免疫应答的方法，其包括为所述个体施用包含 分离的核酸分子的组合物，所述分离的核酸分子编码CHIKV蛋白E2的共有序列或其免疫原 性共有片段。本发明还涉及诱发个体中对CHIKV免疫应答的方法，其包括为所述个体施用包含 分离的核酸分子的组合物，所述分离的核酸分子编码CHIKV蛋白衣壳的共有序列或其免疫 原性共有片段。 本发明还涉及诱发个体中对CHIKV免疫应答的方法，其包括为所述个体施用包含 分离的核酸分子的组合物，所述分离的核酸分子编码CHIKV蛋白E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV 蛋白E3的共有序列或它们的同源序列或它们的免疫原性共有片段或它们的免疫原性共有片段的同源序列，这些序列编码诱发对CHIKV蛋白E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3各自 的免疫应答的免疫原性氨基酸序列。本发明还涉及重组疫苗，所述重组疫苗包含编码CHIKV蛋白衣壳、CHIKV蛋白E1、 CHIKV蛋白E2的共有序列或它们的免疫原性共有片段的核苷酸序列，或者编码CHIKV蛋白 E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3的共有序列或它们的同源序列或它们的免疫原性共有片 段或它们的免疫原性共有片段的同源序列的分离的核酸分子，所述序列编码诱发对CHIKV 蛋白E1、CHIKV蛋白E2和CHIKV蛋白E3各自的免疫应答的免疫原性氨基酸序列，并且本发 明还涉及诱发个体中对CHIKV的免疫应答的方法，该方法包括向个体施用所述重组疫苗。附图简述

图1 ㈧将IgE-前导CHIKV融合基因克隆到pVaxl载体中的策略示意图。(B) 琼脂糖凝胶照片，显示用Kpnl和Notl双酶切反应所标示的CHIKV质粒(被膜El、E2和衣 壳)的线性特异性条带(泳道4)，所述双酶切反应分别产生1403bp、1355bp和869bp的大 小。图2 =CHIKV构建体的表征。(A)显示合成构建体的S35标记的体外转译。抗原 CHIKV-El、CHIKV-E2和CHIKV-衣壳被转译并分别使用特异性E1、E2和衣壳抗体免疫沉淀并 经12% SDS凝胶电泳，然后进行放射显影分析。抗原电泳在其预测的分子量下进行，证实了 表达。(B) BHK-21细胞中CHIKV-El和CHIKV-衣壳构建体的蛋白质印迹分析(Western blot analysis)。转染后两天，制备转染细胞溶胞产物并且在小鼠中培养的多克隆CHIKV-El抗 血清进行的免疫印迹显示52kDa El蛋白和36kDa衣壳蛋白的表达。图3 抗体ELISA。(A)、(B)和(C) C57BL/6 小鼠如所示用 25 μ g pVaxl 载体或CHIKV 质粒免疫两次，每次间隔2周，1周后处死。收集血清并对CHIKV-El、CHIKV-E2或CHIKV-衣 壳的总IgG制备量进行分析。血清在用2 μ g/ml各CHIKV肽涂布的96孔板上在37°C下培 养lh，并使用抗小鼠IgG-HRP检测抗体。值代表两个复孔的平均值(士S. D.)。图4:通过酶联免疫斑点法(ELISpot)测量的干扰素-Y对被膜El的应答。
C57BL/6小鼠用25 μ g pVaxl载体或pCHIKV-El免疫两次，每次间隔2周，1周后处死。(A) 收获脾细胞并在RlO (阴性对照)或10 μ g/ml四个肽库之一存在下培养过夜，所述肽库由 跨El蛋白长度的9个氨基酸重叠的15肽构成。对CHIKV-El的应答显示为堆叠组平均应 答。(B)收获脾细胞并在RlO (阴性对照)或10 μ g/ml十八个肽库之一存在下培养过夜，所 述肽库由跨基质El蛋白长度的9个氨基酸重叠的15肽构成。斑点形成单位(SFU)通过自 动化ELISpot读取分析仪定量，将原始值标准化为SFU/百万脾细胞。值代表三个复孔的平 均值。图5 通过酶联免疫斑点法(ELISpot)测量的干扰素-Y对CHIKV被膜E2的应答。 C57BL/6小鼠用25 μ g pVaxl载体或pCHIKV_E2免疫两次，每次间隔2周，1周后处死。(A) 收获脾细胞并在RlO(阴性对照)或10μ g/ml四个肽库之一存在下培养过夜，所述肽库由 跨E2蛋白长度的9个氨基酸重叠的15肽构成。对CHIKV-E2的应答显示为堆叠组平均应 答。(B)收获脾细胞并在RlO (阴性对照)或10 μ g/ml十八个肽库之一存在下培养过夜，所 述肽库由跨基质E2蛋白长度的9个氨基酸重叠的15肽构成。斑点形成单位(SFU)通过自 动化ELISpot读取分析仪定量，将原始值标准化为SFU/百万脾细胞。值代表三个复孔的平 均值。
图6 通过酶联免疫斑点法(ELISpot)测量的干扰素-Y对CHIKV-衣壳的应答。C57BL/6小鼠用25 μ g pVaxl载体或pCHIKV-衣壳免疫两次，每次间隔2周，1周后处死。 (A)收获脾细胞并在RlO (阴性对照)或10 μ g/ml四个肽库之一存在下培养过夜，所述肽库 由跨衣壳蛋白长度的9个氨基酸重叠的15肽构成。对CHIKV-衣壳的应答显示为堆叠组平 均应答。(B)收获脾细胞并在RlO (阴性对照)或10 μ g/ml十八个肽库之一存在下培养过 夜，所述肽库由跨基质衣壳蛋白长度的9个氨基酸重叠的15肽构成。斑点形成单位(SFU) 通过自动化ELISpot读取分析仪定量，将原始值标准化为SFU/百万脾细胞。值代表三个复 孔的平均值。图7是显示患者和健康个体(首次实验的)血清的屈曲病毒的中和抗体滴度的 图，所述滴度使用实施例2所述分析方法测量。优选的具体实施方案 如本文所使用，“免疫原性共有片段”意指CHIKV共有蛋白的片段，该CHIKV共有蛋 白的片段包括足以对两种或多种CHIKV菌株提供交叉防护的共有序列，所述交叉防护在使 用相应的天然序列时没有出现。片段长度一般是10个或更多个氨基酸。一些优选的CHIKV El长度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至 少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至 少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至 少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至 少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至 少240、至少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、至少280、至 少285、至少290、至少295、至少300、至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至 少330、至少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370、至 少375、至少380、至少385、至少390、至少395、至少400、至少405、至少410、至少415、至少 420、至少425或至少430。一些优选的CHIKV El长度是15或更小、20或更小、25或更小、 30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70 或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110 或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更 小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、 185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220 或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更 小、260或更小、265或更小、270或更小、275或更小、280或更小、285或更小、290或更小、 295或更小、300或更小、305或更小、310或更小、315或更小、320或更小、325或更小、330或 更小、335或更小、340或更小、345或更小、350或更小、355或更小、360或更小、365或更小、 370或更小、375或更小、380或更小、385或更小、390或更小、395或更小、400或更小、415 或更小、420或更小、425或更小、430或更小、或者435或更小。一些优选的CHIKV E2长度 是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、 至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、 至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至 少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至 少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、至少280、至少285、至 少290、至少295、至少300、至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至少330、至 少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370、至少375、至少 380、至少385、至少390、至少395、至少400、至少405、至少410、至少415或至少420。一些 优选的CHIKV E2长度是15或更小、20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、 45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85 或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、 125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160 或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更 小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、 235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更小、260或更小、265或更小、270 或更小、275或更小、280或更小、285或更小、290或更小、295或更小、300或更小、305或更 小、310或更小、315或更小、320或更小、325或更小、330或更小、335或更小、340或更小、 345或更小、350或更小、355或更小、360或更小、365或更小、370或更小、375或更小、380 或更小、385或更小、390或更小、395或更小、400或更小、415或更小、422或更小。一些优 选的CHIKV衣壳长度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少 45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、 至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至 少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至 少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少 235、至少240、至少245、至少250或至少255。一些优选的CHIKV衣壳长度是15或更小、 20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60 或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100 或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更 小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、 175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210 或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更 小、250或更小、255或更小、或者260或更小。如本段所使用，对优选片段大小的提及旨在 指至少和小于之间范围的所有排列组合，例如范围可以是以“至少”大小所列的任何数值到 以“小于t”大小所列的任何数值，以提供一系列大小，例如20-400、20-30、40-100，等等。 本文使用的术语“基因构建体”指包含编码靶蛋白或免疫调节蛋白的核苷酸序列 的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作连接于调控元件的起始信号和终止信号，所述调 控元件包括能够指导被施用核酸分子的个体细胞中表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。本文使用的术语“可表达形式”指含有可操作连接于编码靶蛋白或免疫调节蛋白 的编码序列的必要调控元件的基因构建体，使得当存在于个体细胞中时，所述编码序列被 表达。本文使用的短语“严格杂交条件”或“严格条件”指核酸分子与另一核酸分子杂交 但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同环境下有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。一般而言，严格条件被选择为在确定的离子强度和PH下 比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5°C。Tm是平衡时与靶序列互补的探针的50%与靶序 列杂交的温度(在确定的离子强度、PH和核酸浓度下)。由于靶序列一般是过量存在的，所 以在Tm下，平衡时探针的50%被占据。通常，严格条件是下述条件即，其中在pH 7.0至 8. 3下，盐浓度小于约1. OM钠离子、通常约0. 01至1. OM钠离子(或其他盐)，并且温度对 于短的探针、引物或寡核苷酸(例如10至50个核苷酸)而言是至少约30°C且对于较长探 针、引物或寡核苷酸而言是至少约60°C。严格条件还可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺) 来实现。 本文使用的“同源”指两个核酸序列之间或两个氨基酸序列之间的序列同源性。足 够同源以使得免疫原性功能的两个核酸序列或两个氨基酸序列是“同源的”。核苷酸和氨基 酸的序列同源性可以使用FASTA、BLAST和空位BLAST (Altschul等，Nuc. Acids Res.，1997， 25，3389，该文献的全文以引用的方式并入本文)和PAUP*4. OblO软件(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)来确定。“相似百分比”用 PAUP*4. OblO 软件 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)来计算。共有序列的平均相似性 与系统进化树中所有序列进行对比计算。简而言之，代表基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool)的 BLAST 算法适合确定序列相似性(Altschul 等，J. Mol. Biol.，1990，215，403-410，该文献的全文以引用的方式并入本文)。进行BLAST分析的软件 可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法 包括首先通过确定查询序列中的长度W的短字来确定高得分序列对(HSP)，该查询序列与 数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值阈值分数T。T被称为相邻字分数 阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字的匹配用作启动寻找含有它们的HSP的检索的 种子。字匹配沿每个序列两个方向延伸至尽可能使累积比对分数可以增加。下述情况下每 个方向的字匹配延伸停止1)累积比对分数从其最大实现值减少数量X ;2)由于一个或多 个负得分残基比对的累积，累积分数到达零或以下；或3)到达任一序列的末端。Blast算法 参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。Blast程序使用下述作为默认值字长(W)为11， BL0SUM62 得分矩阵(参见 Henikoff 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992，89，10915-10919， 该文献的全文以引用的方式并入本文)比对(B)为50，期望值(E)为10，M = 5，N = 4，和 双链对比。BLAST 算法(Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993，90，5873-5787，该文献 的全文以引用的方式并入本文)和空位BLAST进行两个序列之间相似性的统计分析。BLAST 算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，其指示两个核苷酸序列之间偶然发 生匹配的概率。例如，如果测试核酸与其他核酸对比中的最小总和概率小于约1、优选小于 约0. 1、更优选小于约0. 01且最优选小于约0. 001，则认为核酸与另一核酸相似。在一些实施方案中，提供了可以用于免疫个体的CHIKV的DNA疫苗。该疫苗包括 体内体液免疫性和细胞免疫性两者。根据一些实施方案，为了开发有能力诱发对屈曲病毒(CHIKV)的交叉反应性免疫 应答的免疫原，我们设计了针对CHIKV病毒被膜El、E2和核心蛋白衣壳的共有构建体。对 于这些构建体，从1952年至2006年分离的导致人类感染和死亡的屈曲病毒中选择21个序 列。所选择的每个基因的DNA序列来自S27菌株(首次分离株)和各个国家的菌株(包括 留尼旺岛爆发分离株)，以避免抽样偏差。对DNA序列进行比对，为合成序列选择各个位置最常见的核苷酸。推导的氨基酸序列用于指导引入比对空位，以便它们被引入到保持阅读框的密码子之间。共有序列产生之后，IgE前导序列被加至N末端以增强表达和分泌，构建 体通过密码子优化并用更强序列(GCCGCCACC)(图IA-SEQ ID NO 18)替换现有Kozak序列 来优化。为了分析，将多聚组氨酸标签加至El和衣壳的C末端以证实表达。然后在根据之 前对于分析、表达和免疫原性研究[21]所述的细菌和纯化环境下制备这些构建体。图IB 示出了编码被膜El、E2和衣壳DNA的构建体的琼脂糖凝胶电泳。根据另一实施方案，我们设计了针对CHIKV病毒被膜E1、E2和E3各自的嵌合共有 构建体。对于这些构建体，制备E1、E2和E3各自的共有序列，并将各共有序列彼此连接，优 选使用编码蛋白酶切割位点的序列。此外，将IgE前导序列加至N末端以增强表达和分泌。在优选实施方案中，构建体包括与IgE前导序列连接的CHIKV编码序列。然而，在 一些实施方案中，CHIKV编码序列不与IgE前导序列连接，但是可任选地连接不同的前导序 列。SEQ ID NO 1指编码与IgE前导序列连接的CHIKV-El共有蛋白的核苷酸序列。SEQ ID NO 2指编码与IgE前导序列连接的CHIKV-E2共有蛋白的核苷酸序列。SEQ ID NO 3指编码与IgE前导序列连接的CHIKV-衣壳共有蛋白的核苷酸序列。SEQ ID NO 4指对应于SEQ ID NO 1的编码CHIKV-E1共有蛋白但是没有IgE前 导序列的编码序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 5指对应于SEQ ID NO :2的编码CHIKV-E2共有蛋白但是没有IgE前 导序列的编码序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 6指对应于SEQ ID NO 13的编码CHIKV-衣壳共有蛋白但是没有IgE 前导序列的编码序列的核苷酸序列。SEQ ID NO :7指SEQ ID NO :1编码的氨基酸序列，是带有IgE前导序列的CHIKV-E1
共有蛋白。SEQ ID NO :8指SEQ ID NO :2编码的氨基酸序列，是带有IgE前导序列的CHIKV-E2
共有蛋白。SEQ ID NO :9指SEQ ID NO :3编码的氨基酸序列，是带有IgE前导序列的CHIKV-衣
壳共有蛋白。SEQ ID N0:10指SEQ ID NO :4编码的氨基酸序列，是没有IgE前导序列的 CHIKV-El共有蛋白。SEQ ID N0:11指SEQ ID NO :5编码的氨基酸序列，是没有IgE前导序列的 CHIKV-E2共有蛋白。SEQ ID N0:12指SEQ ID NO :6编码的氨基酸序列，是没有IgE前导序列的 CHIKV-衣壳共有蛋白。SEQ ID NO 13指编码共有Env的核苷酸序列，所述共有Env是Kozak序列-IgE前 导序列-CHIKV-E3编码序列-切割位点-CHIKV-E2编码序列-切割位点-CHIKV-El编码序 列-终止信号-终止信号。SEQ ID NO 14指SEQ ID NO 13编码的氨基酸序列，是共有Env蛋白序列，即IgE 前导序列-CHIKV-E3-切割位点-CHIKV-E2-切割位点-CHIKV-El编码序列。SEQ ID NO 15指对应于SEQ ID NO 13的编码共有Env但是没有IgE前导序列的核苷酸序列，即CHIKV-E3编码序列-切割位点-CHIKV-E2编码序列-切割位点-CHIKV-El 编码序列_终止信号_终止信号。SEQ ID NO 16指SEQ ID NO 15编码的氨基酸序列，是没有IgE前导序列的共有 Env蛋白序列，即CHIKV-E3-切割位点-CHIKV-E2-切割位点-CHIKV-El编码序列。SEQ ID NO 17指IgE前导序列的氨基酸序列。SEQ ID NO 18 指优选的 Kozak 序列。当编码共有蛋白的核酸分子被个体细胞摄取时，编码共有蛋白的核苷酸序列在细 胞中表达，由此将蛋白递送给个体。本发明的多个方面提供了递送质粒上共有蛋白编码序 列或者作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分的共有蛋白编码序列的方法。根据本发明一些方面，提供了针对病原体或异常的疾病相关细胞而预防性和/或 治疗性免疫个体的组合物和方法。疫苗可以是任何类型的疫苗，例如减毒活疫苗、重组疫苗 或核酸疫苗或DNA疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含一种、两种或所有三种共有蛋白。在一些实施方案 中，疫苗包含同一核酸分子上两种共有蛋白的编码序列。在一些实施方案中，疫苗包含两种 不同核酸分子上两种共有蛋白的编码序列。在一些实施方案中，疫苗包含同一核酸分子上 三种共有蛋白的编码序列。在一些实施方案中，疫苗包含三种共有蛋白的编码序列，其中两 种共有蛋白的编码序列在同一核酸分子上而第三种共有蛋白的编码序列在第二种核酸分 子上。例如，一种核酸分子包含El和E2的编码序列并且包含衣壳的编码序列；或者一种核 酸分子包含El和衣壳的编码序列并且包含E2的编码序列，或者一种核酸分子包含E2和衣 壳的编码序列并且包含El的编码序列。在一些实施方案中，疫苗包含三种共有蛋白的编码 序列，其中有三种不同的核酸分子，并且每种核酸分子包含不同的编码序列。在一些实施方案中，包括IgE前导序列的共有El的编码序列是SEQ ID NO :1。在 一些实施方案中，无IgE前导序列的共有El的编码序列是SEQ ID NO :4。在一些实施方案 中，含有IgE前导序列的共有El蛋白是SEQ ID NO :7或其片段。在一些实施方案中，共有 El蛋白是SEQ ID N0:10或其片段。在一些实施方案中，含有IgE前导序列的共有El蛋白 80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO :7。在一些实施方案中，无IgE前导序列的 共有El蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO :10。在一些实施方案中，包 括IgE前导序列的共有E2的编码序列是SEQ ID NO :2。在一些实施方案中，无IgE前导序 列的共有E2的编码序列是SEQ ID NO :5。在一些实施方案中，含有IgE前导序列的共有E2 蛋白是SEQ ID NO :8或其片段。在一些实施方案中，共有E2蛋白是SEQ ID N0:11或其片 段。在一些实施方案中，含有IgE前导序列的共有E2蛋白80%、90%、95%、98%或99%同 源于SEQ ID NO :7。在一些实施方案中，无IgE前导序列的共有El蛋白80%、90%、95%、 98%或99%同源于SEQ ID NO :11。在一些实施方案中，包括IgE前导序列的共有衣壳的编 码序列是SEQ ID NO :3。在一些实施方案中，无IgE前导序列的共有El的编码序列是SEQ ID NO :6。在一些实施方案中，含有IgE前导序列的共有El蛋白是SEQ ID NO :9或其片段。 在一些实施方案中，共有El蛋白是SEQ ID N0:12或其片段。在一些实施方案中，含有IgE 前导序列的共有El蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO :9。在一些实施方 案中，无IgE前导序列的共有El蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO :12。 多种基因可以在单一核酸分子上或在多种核酸分子上。例如，一种核酸分子包含El和E2的编码序列并且包含衣壳的编码序列；或者一种核酸分子包含El和衣壳的编码序 列并且包含E2的编码序列，或者一种核酸分子包含E2和衣壳的编码序列并且包含El的编 码序列。在一些实施方案中，疫苗包含三种共有蛋白的编码序列，其中存在三种不同的核酸 分子并且每种核酸分子包含不同的编码序列。疫苗可以包含E1、E2和衣壳的两种或多种共 有序列的组合。 在一些实施方案中，疫苗包含共有CHIKV Env,共有CHIKV Env包含连接在一起作 为单一嵌合基因的E1、E2和E3。在一些实施方案中，个体共有序列通过编码蛋白酶切割位 点的序列彼此连接。在一些实施方案中，嵌合基因包含El、E2和E3各自的片段，使得嵌合 基因在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合基因包 含SEQ ID NO :13或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和 E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合基因包含至少85%同源于SEQ ID NO: 13的 核酸序列或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自 的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合基因包含至少90%同源于SEQ ID N0:13的核酸序 列或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫 应答。在一些实施方案中，嵌合基因包含至少95%同源于SEQ ID NO :13的核酸序列或其 片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。 在一些实施方案中，嵌合基因包含至少98%同源于SEQ ID NO: 13或的核酸序列其片段，该 片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对El、E2和E3各自的免疫应答。在一些 实施方案中，嵌合基因包含至少99%同源于SEQ ID NO: 13的核酸序列或其片段，该片段包 含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对El、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方 案中，嵌合基因包含SEQ ID NO :15或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表 达形成对El、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合基因包含至少85%同源 于SEQ ID NO :15的核酸序列或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成 对El、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合基因包含至少90%同源于SEQ ID NO 15的核酸序列或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、 E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合基因包含至少95%同源于SEQ ID NO: 15的核酸序列或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3 各自的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合基因包含至少98%同源于SEQ ID NO: 15的核 酸序列或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的 免疫应答。在一些实施方案中，嵌合基因包含至少99%同源于SEQ ID N0:15的核酸序列 或其片段，该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应 答。在一些实施方案中，疫苗包含共有CHIKV Env，其编码连接在一起的El、E2和E3 的共有氨基酸序列。在一些实施方案中，个体共有序列通过编码蛋白酶切割位点的序列彼 此连接。在一些实施方案中，嵌合基因编码El、E2和E3各自的片段，其中由此编码的氨基 酸序列具有免疫原性并且诱发对El、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，共有 蛋白CHIKV Env包含SEQ ID NO :14或其片段，该片段包含足够序列，其中由此编码的氨基 酸序列具有免疫原性并且诱发对El、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，CHIKV Erw共有蛋白包含至少85%同源于SEQ ID NO 14的氨基酸序列或其片段，其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中， CHIKV Env共有蛋白包含至少90%同源于SEQ ID NO :14的氨基酸序列或其片段，其中由此 编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对El、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方 案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少95%同源于SEQ ID NO 14的氨基酸序列或其片段，其 中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对El、E2和E3各自的免疫应答。在一些 实施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少98%同源于SEQ ID NO 14的氨基酸序列或其 片段，其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对El、E2和E3各自的免疫应答。 在一些实施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少99%同源于SEQ ID N0:14的氨基酸序列 或其片段，其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对El、E2和E3各自的免疫应 答。在一些实施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少85%同源于SEQ ID NO: 16的氨基酸 序列或其片段，其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对El、E2和E3各自的免 疫应答。在一些实施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少90%同源于SEQ ID N0:16的 氨基酸序列或其片段，其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对El、E2和E3各 自的免疫应答。在一些实施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少95%同源于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或其片段，其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和 E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少98%同源于SEQ ID NO 16的氨基酸序列或其片段，其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对El、 E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中，CHIKV Env共有蛋白包含至少99%同源于 SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或其片段，其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发 针对El、E2和E3各自的免疫应答。核酸分子可以使用几种已知技术中的任何一种来递送，所述已知技术包括DNA注 射(还称为DNA接种)、重组载体(例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘病
) oDNA 疫苗描述于美国专利号 5，593，972，5，739，118，5，817，637，5，830，876， 5，962，428，5，981，505，5，580，859，5，703，055，5，676，594 和其中引用的优先申请，这些文
献均以引用的方式并入本文。除了那些申请中描述的递送方案以外，递送DNA的可选方法 还描述于美国专利号4，945，050和5，036，006，这两个文献均以引用的方式并入本文。施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、经皮、通过吸入或栓剂或至粘膜组织(例如通过灌洗至阴道、直肠、尿道、口腔 和舌下组织)。优选的施用途径包括至粘膜组织、肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建 体可以通过包括但不限于下述的工具施用传统注射器、无针头注射装置或“微弹轰击基因 枪”。另一施用途径涉及使用电穿孔来递送基因构建体，描述于美国专利号5，273，525， 5，439，440,5，702，359,5，810，762,5，993，434,6，014，584,6，055，453,6，068，650, 6，110，161,6，120，493,6，135，990,6，181，964,6，216，034,6，233，482,6，241，701, 6，347，247,6，418，341,6，451，002,6，516，223,6，567，694,6，569，149,6，610，044, 6，654，636,6, 678，556,6, 697，669,6, 763，264,6, 778，853,6, 865，416,6, 939，862 和 6，958，060，这些文献据此以引用的方式并入。优选用于促进DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括描述于下述文献中的那些Draghia-Akli等的美国专利号7，245，963，Smith等提交的美国专利公布 2005/0052630，这两个文献的内容全文据此以引用的方式并入。还优选的是在2007年10 月17日提交的共同待审和共同拥有的美国专利申请序号11/874072中提供的促进DNA疫 苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法，该美国专利申请根据35 USC 119(e)要求2006年10 月17日提交的美国临时申请序号60/852，149和2007年10月10日提交的美国临时申请 序号60/978，982的权益，所有申请的全文据此以引用的方式并入。下面是使用电穿孔技术的实施方案的一个实例，并且在上述专利参考文献中更详 细地讨论电穿孔装置可被配置为向所需的哺乳动物组织递送能量脉冲，该能量脉冲产生 类似于使用者预设电流输入的恒定电流。电穿孔装置包括电穿孔组件和电极部件或手柄部 件。电穿孔组件可包括并并入电穿孔装置的各种元件的一种或多种，包括控制器、电流波 形发生器、阻抗测试仪、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通讯端口、记忆组件、电源和 电源开关。电穿孔组件能够作为电穿孔装置的一个元件起作用，其他元件是与所述电穿孔 组件联通的分开元件(或组件)。在一些实施方案中，电穿孔组件能够起到电穿孔装置中不 止一个元件的作用，其还可以与电穿孔装置中与所述电穿孔组件分开的其他元件联通。使 用电穿孔技术递送疫苗不受作为一个机电装置或机械装置的部分而存在的电穿孔装置的 元件所限制，因为所述元件能够起到一个装置或起到与分开元件彼此联通的作用。电穿孔 组件能够递送在所需组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极部件包括 具有空间排列的多个电极的电极阵列，其中电极部件接收来自电穿孔组件的能量脉冲并通 过电极将其递送至所需的组织。多个电极的至少一个在能量脉冲递送中是中性的并且测量 所需组织中的阻抗并且将阻抗联通至电穿孔组件。反馈机制可以接收测量的阻抗并且可以 调节电穿孔组件递送的能量脉冲以保持恒定电流。在一些实施方案中，多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方案中， 多个电极可以通过以编程顺序控制电极来以分散模式递送能量脉冲，所述编程顺序由使用 者输入至电穿孔组件。在一些实施方案中，编程顺序包括顺序递送的多个脉冲，其中所述多 个脉冲的每一个脉冲由至少两个活性电极(带有一个测量阻抗的中性电极)递送，并且其 中所述多个脉冲的下一个脉冲由至少两个活性电极(带有一个测量阻抗的中性电极)的不 同的一个递送。在一些实施方案中，反馈机制通过硬件或软件进行。优选地，反馈机制通过模拟闭 环电路进行。优选地，该反馈每隔50 y s、20 y s、10 y s或1 y s发生，但是优选为实时反馈 或即时反馈(即，通过采用现有技术测定响应时间确定为基本上是即时的)。在一些实施方 案中，中性电极测量所需组织中的阻抗并将阻抗联通至反馈机制，并且反馈机制响应阻抗 并调节能量脉冲以保持恒定电流为类似于预设电流的值。在一些实施方案中，反馈机制在 能量脉冲递送过程中连续并即时保持恒定电流。当被细胞摄取时，基因构建体可以作为功能性染色体外分子保持存在于细胞中。 DNA可以以质粒形式被引入细胞，DNA在细胞中短暂存在。可选地，RNA可以被施用至细胞。 还考虑提供作为线性微型染色体的基因构建体，包括着丝粒、端粒和复制起点。基因构建体 可以构成被施用于受试者的减毒活微生物或重组微生物载体中遗传物质的部分。基因构建 体可以是重组病毒疫苗的基因组的部分，其中遗传物质保持在染色体外。基因构建体包括 核酸分子基因表达所必要的调控元件。所述元件包括启动子、起始密码子、终止密码子和多聚腺苷酸化信号。此外，增强子通常是编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达所 需要的。必要的是，这些元件与编码所需蛋白的序列可操作连接，并且所述调控元件在它们 被施用的个体中是可操作的。一般认为起始密码子和终止密码子是编码所需蛋白的核苷酸序列的部分。然而， 必要的是，这些元件在基因构建体被施用的个体中是功能性的。起始密码子和终止密码子 必须与编码序列在框内。所使用的启动子和多聚腺苷酸化信号必须在个体细胞内是功能性的。可用于实施本发明、特别是产生人类基因疫苗的启动子的实例包括但不限于来自 猿猴病毒40 (SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(MV)(例如BIV 长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒、ALV(禽白血病病毒)、巨细胞病毒(CMV)(例 如CMV立即早期启动子)、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子以及来自人类基因 的启动子，所述人类基因例如人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红素、人类肌肉肌酸和 人类金属硫蛋白。可用于实施本发明、特别是产生人类基因疫苗的多聚腺苷酸化信号的实例包括但 不限于SV40多聚腺苷酸化信号、小牛生长激素多聚腺苷酸化(bgh-PolyA)信号和LTR多聚 腺苷酸化信号。特别地，使用在PCEP4质粒(Invitrogen,San Diego Calif.)中称为SV40 多聚腺苷酸化信号的SV40多聚腺苷酸化信号。除了 DNA表达所需的调控元件，DNA分子中还可以包括其他元件。此类其他元件 包括增强子。增强子可以选自下述组，包括但不限于人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血 红素、人类肌肉肌酸和病毒增强子(例如来自CMV、RSV和EBV的那些)。基因构建体可以具有哺乳动物复制起点以在染色体外保持构建体并在细胞内产 生多个构建体拷贝。来自 Invitrogen(San Diego, Calif.)的质粒 pVAXl、pCEP4 和 pREP4 含有EB病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其产生高拷贝的无整合游离型复制。在有关免疫应用的一些优选实施方案中，递送的核酸分子包括编码共有蛋白的核 苷酸序列并且另外包括进一步增强对此类靶蛋白的免疫应答的蛋白基因。此类基因的实例 是编码其他细胞因子和淋巴因子的那些基因，所述细胞因子和淋巴因子例如a-干扰素、
干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、 11-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-28，其包括信号序列缺失并任选包括来自IgE信号肽 的 IL-15。用于本方法的组合物可以进一步包含一种或多种下述蛋白和/或编码此类蛋白 的核酸分子，如在对应于美国
发明者D·B·韦纳, K·穆图玛尼 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会