检测核酸序列的方法

专利名称：检测核酸序列的方法
技术领域：
本发明涉及到检测和/或定量包含在待测样品里的革巴核酸或者一个或多个变异的核苷 酸序列的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNPs)是人类基因组变异中最常见的类型。突变也通常是SNPs， 但是一般认为这个术语专指频率低于1%的变异或者指已知的功能性的、致病的变异 (GibsonNJ， 2006，临床化学学报(Clin Chim Acta.) 363(1-2):32-47)。基因分型多态性 和稀有突变的检测有许多应用。稀有变异的检测对病理突变，特别是癌症的早期检测，有 重要意义。例如，对临床样本癌症相关的点突变的检测能够提高对化疗期间微小残留病变 的鉴定，而且能够检测复发病人出现的肿瘤细胞。突变负荷的测定对于评估诱变剂的环境 暴露、监测内源DNA的修复、研究老年人体内突变的累积也很重要。此外更多灵敏、定 量的方法应用于稀有变异的检测，能够引发产前诊断的革命，而且能够鉴定母体血液内的 胎儿细胞。已经引进许多方法，但是没有一种方法被广泛接受。许多检测基因组DNA里 的低频率变异的方法使用聚合酶链式反应(PCR)以扩增突变体和野生型的靶DNA。然 后，使用包括测序、寡核苷酸的连接、限制性酶切、质谱或等位基因特异性寡核苷酸的杂 交在内的多种方法对PCR产物进行分析，以鉴定出野生型DNA背景中的变异。其它方法 则采用等位基因特异性PCR选择性地扩增低频率变异核酸，包括或不包括进一步的选择 步骤。例如，使用一种特异裂解野生型产物的限制性酶消化PCR产物。由于在PCR过程 中缺少等位基因特异引物的全部特异性，现有方法存在产生假阳性的固有缺陷。因此，现 有的所有方法在灵敏度和精确性上受到限制(综述参见Jeffreys AJ和May CA， 2003基因 组研究(GenomeRes.) 13(10):2316-24)。
实时聚合酶链式反应(PCR)可以被用于SNP基因分型。它可在联通管(closed-tube format)里进行操作，而且可以量化。目前有几种方法用于实时PCR，例如使用TaqMan 探针(美国专利5210015和5487972， Lee等，Nucleic Acids Res. 21:3761-6， 1993)，分 子信标(美国专利5925517和6103476，Tyagi和Kramer, Nat. Biotechnol. 14:303-8， 1996)， 自杂交扩增子(蝎状引物)(美国专利6326145，和Whitcombe等，Nat. Biotechnol. 17:804-7，
1999) ， Amplisensor探针(Chen等，Appl. Environ. Microbiol. 64:4210-6， 1998) ， Amplifluor 探针(美国专利611763， Nazarenko等，Nucleic Acids Res. 25:2516-21， 1997)，置换探 针(Li等，Nucleic Acids Res. 30:E5， 2002)， DzyNA-PCR法(Todd等，Clin. Chem. 46:625-30，
2000) ，荧光限制性酶检测(Cairns等，Biochem. Biophys. Res. Comm皿.318:684-卯，2004) 和邻近杂交探针(美国专利6174670， Wittwer等，Biotechniques 22:130-1 ， 134-8， 1997)。然而，由于精确性低，这些方法通常不适于突变检测。
检测稀有变异的所有这些PCR方法背后的共同问题为扩增或不严谨的探针杂交过程 中的失真的复制。这点明显存在于Newton等人描述的受欢迎的突变检测方法中(Nucleic Acids Res. 17:2503-16, 1989;美国专利5595890)。这个系统，即扩增阻滞突变系统(ARMS)， 使用等位基因特异引物用于PCR反应。扩增中的引物错配通常会导致不精确的结果。
EP0663447涉及到一种关于检测多聚核苷酸的方法。在该方法里，使用与部分所述的 多聚核苷酸互补、具有核酸酶抗性的寡核苷酸引物，与已知核苷酸序列的多聚核苷酸杂交， 然后加入至少一种三磷酸脱氧核苷、DNA聚合酶和核酸酶，以合成一条定位于邻近所述 引物的3'末端、与所述多聚核苷酸互补的核苷酸互补链，在互补链的分解之后，所述互补 链的合成和分解重复一至多次，以检测产生的焦磷酸和一磷酸脱氧核苷。
但是，应了解提供精确和灵敏的核酸检测方法将为此项技术作出贡献。
发明的公开
本发明的不同方面以下文中的方面、实施方案和权利要求描述。
一方面，本发明提供了检测和/或定量样品里靶核酸(可以是一个包含至少一个变异 核苷酸的存在或缺失的靶序列)的方法，所述方法包括
(a) 在杂交条件下，使用能够与所述靶核酸的第一区域杂交的第一寡核苷酸引物处 理样品，
(b) 将步骤(a)的混合物置于延伸条件下(例如包括适当的三磷酸核苷和核酸聚合 酶)以延伸任一退火的引物，其中引物的延伸主要取决于靶核酸序列的存在(例如取决于 一个变异核苷酸的存在或缺失)，
(c) 将步骤(b)的混合物置于降解条件下降解第一引物的延伸产物，如果存在的话， 其中包含第一引物在内的第一引物延伸产物的降解取决于所述第一引物的延伸，而且其中 所述第一引物延伸产物的降解产生一个表示靶核酸存在(例如靶核酸中的变异核苷酸)的 可检测信号。
因此，第一引物延伸产物的降解至少包含产物的第一引物部分。
或者，可检测信号的产生或水平与靶核酸序列或靶核酸序列的特异变异核苷酸的存在 和/或数量相关。
因此，简而言之，本方法使用了第一引物(在一个延伸产物内)的选择性降解，该降 解取决于被延伸的引物，而延伸则取决于靶序列或者靶序列上变异核苷酸的存在。第一引 物退火的区域通常是一个包含或邻近疑似变异核苷酸的诊断区域。应理解，上下文中的"取决于"是定量或定性的。因此，在靶序列或者靶序列的特异 变异核苷酸缺少的情况下，第一引物不能延伸；但是，在靶序列或者靶序列的疑似核苷酸 存在的情况下，第一引物会成比例的延伸。
如下所述，在具有5'—3'核酸外切酶活性的聚合酶的作用下，通过第一引物上游的第 二引物的延伸，降解更易达到。这将显著降解第一引物的延伸产物(与靶序列形成稳定的 二聚体)，但不降解退火的、未延伸的第一引物，该第一引物在延伸的条件下从模板上解 离。
如下所述，通过使第一引物退火，而且该第一引物的3'末端核苷酸与靶序列里的特异 核苷酸(如变异核苷酸)互补，延伸的优选进行取决于靶核酸的存在。因此，如果靶序列 的特异核苷酸不存在，第一引物的延伸将被抑制或防止。
下文中描述的不同的实施方案和权利要求的所有组合(包括从属的权利要求)，在作 必要的修正后，适用于上文中描述的本发明的各个方面。
附图的简要描述


图1是一个公开方法的步骤和产物的图。其中第一引物与诊断区域(第一区域)退火， 其3'末端核苷酸与靶序列上的相应核苷酸互补。在包含适当核苷酸的延伸条件下，退火的 第一引物在模板上延伸。第一引物的延伸链在降解条件下被降解，并且产生可检测信号。
图2是本发明的另一个实施方案的图。其中第一引物与诊断区域(第一个区域)退火， 其3'末端核苷酸与靶序列上的相应核苷酸互补。第二引物与第一引物5'上游的第二区域退 火。在包含适当核苷酸的延伸条件下，退火的第一和第二引物在模板上延伸。第一引物的 延伸链在降解条件下被降解，并且产生可检测信号。
图3是检测一个SNP或突变的方法的图。其中第一引物与带有正常或变异核苷酸的 诊断区域(第一区域)退火，其3'末端核苷酸与一个SNP或突变的核苷酸互补。第二引 物与第一引物上游的第二区域退火。在包含适当核苷酸的延伸条件下，匹配的第一、第二
引物在模板上延伸。包含第一引物的第一引物的延伸链在降解条件下被降解，并且产生检 测信号。不匹配的第一引物不能延伸，其从模板上解离，并且不产生可检测信号。
图4是不同的第一、第二引物与靶核酸序列退火的图。(A)使用位于第一引物非5' 端的一对相互作用的标记物去标记第一引物。这对相互作用的标记物可以是荧光团和淬灭 剂。(B)第一引物包含与一个互补寡核苷酸杂交的5，尾巴。第一引物和互补寡核苷酸各 自被一对相互作用的标记物中的一个所标记。这对相互作用的标记物可以是荧光团和淬灭 剂。(C)除了第一个5，尾巴，第一个引物包括能够与靶核酸杂交的第二个5，尾巴。第一
9个5'尾巴能够与互补的寡核苷酸杂交。第一引物和互补的寡核苷酸各自被一对相互作用的 标记物中的一个所标记。这对相互作用的标记物可以是荧光团和淬灭剂。(D)第一引物 包含一个区域，该区域能够与第一引物杂交的一个互补寡核苷酸形成一个双链二聚体。第 一引物与靶核酸的杂交强于它与互补寡核苷酸的杂交。第一引物和它的互补物各自被一对 相互作用的标记物中的一个所标记(第一标记和第二标记)， 一旦第一引物与扩增产物杂 交，相互作用的标记物会分离。这两个标记可位于第一引物和互补的寡聚物上的任意位置。 (E)第二引物包含一个区域，该区域能够与第二引物杂交的一个互补寡核苷酸形成一个 双链二聚体。第二引物与靶核酸的杂交强于它与互补寡核苷酸的杂交。第二引物和它的互 补物各自被一对相互作用的标记物中的一个所标记(第一标记和第二标记)， 一旦第二引 物与扩增产物杂交，相互作用的标记物会分离。
图5是本发明一个实施方案的示意图。其中第二类第一引物的与相应正常核苷酸(A， 腺嘌呤)互补的3'末端核苷酸(T，胸腺嘧啶)被修饰，使得整个或部分第一引物能够抗 核酸酶的裂解。第一类第一引物的与突变的核苷酸(C，胞嘧啶)互补的3'末端核苷酸(G， 鸟嘌呤)没有被修饰，其对核酸酶的裂解很敏感。在包含适当核苷酸的延伸条件下，退火 的第一和第二引物在模板上延伸。在与延伸条件相同的降解条件下，第一类第一引物的延 伸链被降解，并且产生可检测信号。既然酶(可以是DNA聚合酶)的5'核酸酶活性不能 裂解第二类第一引物，第二类第一引物的延伸产物会阻滞上游第二引物的延伸，由此抑制 了包含正常核苷酸的靶序列的扩增。
图6是一个实验设计实例的图。扩增产物通过实时PCR和琼脂糖凝胶检测。 本发明的详尽描述
本发明涉及到检测和/或定量靶核酸的方法，涉及到检测靶核酸的存在或缺失的方法， 或者涉及到对一个或更多的耙核酸序列里的一个或更多的变异核苷酸进行定量的方法。本 发明对癌症或者其它疾病突变的诊断检测、SNP基因分型、通过DNA池里的等位基因量 化进行的SNP相关试验特别感兴趣。通过设计一个包含变异核苷酸的对照标准核酸，本 发明可用于病毒载量的量化。通过分析传染病原的DNA或RNA，本发明也可用于检测和 分型传染的病原体。
I.材料
A.样品中的靶核酸
样品意指包含或假定包含核酸的任何物质，其包括从一个或多个个体中分离的组织样 品或液体。本发明的术语"核酸"、"多聚核苷酸"和"寡核苷酸"意指引物、探针、待 检测的低聚物片段、低聚物对照和不被标记的阻滞低聚体，它们属于多聚脱氧核糖核苷酸 (包括2-脱氧核糖)，属于多聚核糖核苷酸(包括D-核糖)，属于任何其它类型的N端糖苷为嘌呤或嘧啶碱基或被修饰的嘌呤或嘧啶碱基的多聚核苷酸。术语"核酸"、"多聚 核苷酸"和"寡聚核苷酸"之间不存在长度上的刻意区别，而且它们可以互相替换使用。 这些术语仅指分子的一级结构。因此，它们包括双链和单链的DNA、双链和单链的RNA。 寡聚核苷酸包含一个大约至少6个核苷酸的序列，优选包含至少10-12个核苷酸的序列， 更优选包含相应的指定核苷酸序列的一个区域的至少15-20个核苷酸。
本发明中，术语"靶序列"或"靶核酸序列"意指待扩增或/和待检测的区域。扩增 和检测的靶序列，可以是任何核酸。耙序列可以是RNA、 cDNA、基因组DNA或致病微 生物或病毒的DNA。靶序列也可以是化学试剂、各种酶类或物理辐射处理过的DNA。 一 个样品里的感兴趣的耙核酸序列可以以单链DNA或RNA，例如cDNA、mRNA、其它RNA， 或以分离的互补链形式存在。靶核酸的互补链的分离可以通过物理、化学或酶的方法实现。
B.引物
本发明中使用的术语"引物"意指自然产生或合成产生的寡核苷酸。当置于一个核酸 链互补的一个引物延伸产物的合成被诱导的条件下，也就是在核苷酸、诸如DNA聚合酶 的聚合因子、适当的温度和缓冲液等存在的条件下，其能够作为合成的起始点。为了扩增 的最大效率，引物优选是单链，但是也可以是双链。引物必须足够长，才能在诱导因子存 在的条件下引导延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物的来 源和使用的方法。
本发明中的术语"互补"与核苷酸有关，意指一个核苷酸与另一个特异的核苷酸碱基 配对。因此，腺苷三磷酸与尿苷三磷酸或胸苷三磷酸互补，鸟苷三磷酸与胞苷三磷酸互补。 应了解，在特定的情况下，胸苷三磷酸和鸟苷三磷酸可以是碱基对，但因为本说明书的目 的，它们不被认为是互补的。应了解，在特定的情况下，胞苷三磷酸和腺苷三磷酸同时可 以是碱基对，但因为本说明书的目的，它们不被认为是互补的。同样的原理适用于胞苷三 磷酸和尿苷三磷酸。
本发明中的引物经过选择，与每个待复制的特异序列的不同链"充分"互补。这表示 引物必须与相应的杂交链充分互补。因此，引物序列不需要反映模板的精确序列。例如， 第一引物包含一个核苷酸序列，该序列的3'末端核苷酸与疑似的变异核苷酸或相应的正常 核苷酸互补。非互补的核苷酸片段可附着在引物的5'端，同时引物序列的其余部分与靶碱 基序列的诊断部分互补。但是， 一般来说，引物是精确互补的。除非如前所述，非互补核 苷酸可出现在预先确定的引物的末端。
但是，应了解，在特定的情况下，甚至在3'末端残基不互补的条件下，引物的延伸产 物也可以被诱导产生。假阳性结果的产生可能是因为退火/温育温度太低(在这种情况下 可提高温度)，可能因为温育/退火的时间过长(在这种情况下可縮短时间)，因为盐浓 度太高(在这种情况下可降低盐浓度)，可能因为酶或三磷酸核苷的浓度太高，可能是pH不正确，或者寡核苷酸引物的长度不正确。可以通过在诊断引物内部有意引入一个或多个 进一步错配的残基，或者必要时，引入缺失或插入，通过进一步的降低杂交过程中引物的 结合，以降低引物的稳定性，由此避免假阳性结果的产生。
本发明中的"第一引物"是一个诊断引物，意指这个引物与靶序列的诊断区域杂交。 如果靶序列中存在一个适当的核苷酸，其就会延伸。随后，第一引物(其在延伸产物里) 被降解。第一引物可以有一个核苷酸序列，其中的末端核苷酸经选择与疑似的变异核苷酸 或者相应的正常核苷酸互补。当第一引物的末端核苷酸与相应的靶核酸序列的诊断部分 (第一区域)的适当核苷酸互补时，第一引物的延伸产物被合成，当第一引物的末端核苷 酸与相应的靶核酸序列诊断部分(第一区域)的适当核苷酸不能互补，延伸产物则不能被 合成。
第一个引物也可以有一个核苷酸序列，其中该序列的非末端核苷酸经选择与疑似的变 异核苷酸或者相应的正常核苷酸互补。当第一引物包含与疑似的变异核苷酸互补的非末端 核苷酸，其又与包含耙核酸序列的诊断部分(第一区域)的适当核苷酸靶序列杂交时，第 一引物的延伸产物可以被合成；当第一引物的非末端核苷酸与相应的靶核酸酸序列的诊断 部分(第一个区域)的适当核苷酸不能互补时，延伸产物则不能被合成。
因此应了解，这里的任何方面或权利要求意指的"末端核苷酸"处，本发明同样用非 末端核苷酸进行了实践。为了达到同样的效果，也就是当相应的引物分别与互补或非互补 的诊断部分退火时，延伸得以被允许或阻止，非末端核苷酸距离末端核苷酸需足够近。通 常这样的非末端核苷酸与末端核苷酸仅相距l、 2、或3个核苷酸。
应了解，对靶核酸第一条链的疑似变异核苷酸来说，与第一条链互补的靶核酸的第二 条链上存在一个相应的互补变异核苷酸。在本发明方法的实际操作里，在一个反应里可包 括耙序列第一条链的第一引物，或者在一个反应里可包括耙序列第一条链的第一个引物和 靶序列第二条链的另一个第一引物。在后一种情况里，耙序列第一条链的第一引物与靶序 列第二条链的第一引物的3'末端核苷酸重叠(互补)。
第一引物可以是标记的寡核苷酸。本发明中的术语"标记"意指用于提供可检测信号 (优选是可以定量)、并且可以附着在核酸或蛋白上的任一原子或分子。通过荧光、放射 性、颜色测定、重量测定、磁力、酶活等方法，标记可使信号得以检测。
第一引物可以附着在固相载体上。多个第一引物可以排列在固相载体上。固相载体可 以包括能与寡核苷酸偶联的任意固相材料。这包括，但是不限于以下材料，例如丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚还氧乙烯、聚硅酸盐、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、碳氟化合物、 尼龙、硅胶、聚酸酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚正酯、polypropylfirnierate、胶原质、粘多糖 和多聚氨基酸。固态基质可具有任何有用的形式，包括薄胶片或薄膜、珠、瓶子、盘子、 纤维、针织纤维、成型聚合体、颗粒以及微粒。固相载体的优选形式是载玻片。
12在一个实施方案中，感兴趣的靶序列的富集和检测需在同一个反应里进行(图5)。 第一引物可作为阻滞引物和检测引物。对于作为阻滞引物的第一引物来说，其包含能够使 整个或部分阻滞引物抗核酸酶剪切的修饰的核苷酸或修饰的接头。特别是，第二类第一引 物被修饰，其3'末端核苷酸与相应的正常核苷酸互补。优选第一引物的最后的核苷酸或 3'末端和/或5'末端的接头被修饰，使得第一引物能够抗核酸酶的剪切。也有可能阻滞引 物的最后的核苷酸或3'末端和/或5'末端的接头被修饰，使得阻滞引物能够抗核酸酶的剪 切。可采用使引物抗核酸酶剪切的任何类型的修饰。例如硫代磷酸酯接头、甲基磷酸酯接 头、LNA、 PNA、寡聚—2'—OMe—核苷酸或类似物。
第一引物可以包含使它的延伸产物不适合指数扩增的一部分。在一个实施方案中，这 部分可以是一个阻滞的部分。其中所有或部分所述第一引物的复制被阻滞，而且由于缺少 引物结合位点，第一引物延伸链模板产生的引物延伸分子因此不适合作为模板进行进一步 的引物延伸。阻滞的部分可以是一个HEG、非核苷酸接头、核苷酸衍生物、或者是一种 染料。阻滞部分可以位于距离第一引物3'末端小于18个核苷酸处。阻滞部分优选位于距 离第一引物3'末端小于6个核苷酸处。阻滞引物更优选位于距离第一引物3'末端小于3 个核苷酸处。
第二引物能够与第一引物杂交的同一核酸链杂交。与第二引物退火的靶核酸序列部分 被称为第二区域。靶序列的第一和第二区域可以重叠，也可以不重叠。
第二区域位于第一区域的3'端。或者说，第一引物和第二引物均与靶核酸退火，其中 第二引物的3，端邻近第一引物的5'端，或者在第一引物5'端的上游。当两种不同的、非重 叠的寡核苷酸与同一线性的互补核酸序列的不同区域退火、而且一个寡核苷酸的3'端指向 另一个寡核酸的5'端时，前者被称为上游寡核苷酸，后者被称为下游寡核苷酸。本发明中 的第二引物是上游引物。
第三引物能够与第一引物、第二引物杂交的核酸链的互补核酸链杂交。第二和第三引 物可能各自都是带有核酸序列的扩增引物，当它们从互补物上分离后，能够各自与另一个 引物的延伸产物杂交，由此用第一和第三引物的延伸产物作为模板，以合成扩增引物的延 伸产物，因而推动了扩增。
对于特定的核苷酸变异，例如一个点突变，可以用以下方法检测其存在或缺失或者 1)设计第一引物，令其有一个与疑似的变异核苷酸互补的适当的末端核苷酸。由此，第 一引物延伸产物的合成和降解表示疑似核苷酸变异的存在，而第一引物延伸产物不发生合 成和降解，则表示疑似核苷酸变异的缺失；或者2)设计第一引物，令其有一个与相应的 正常核苷酸(另一个等位基因)互补的适当的末端核苷酸。由此，第一引物延伸产物的合 成和降解表示存在正常的核苷酸，而第一引物延伸产物不发生合成，则表示缺失正常的核 苷酸。在这点上，本发明意指的"适当的末端核苷酸"是引物的末端核苷酸，若可能，是使用中合成的起始位置。既然通常聚合因子引导引物3'端的合成，适当的末端核苷酸通常 是3'末端核苷酸。
应了解一个反应里的第一引物优选包含两类，这两类的3'末端核苷酸不同，而且包含
不同的标记。第一类第一引物包含一个适当的末端核苷酸，该末端核苷酸与疑似的变异核 苷酸互补(一个等位基因)，但是第二类第一引物包含一个适当的末端核苷酸，该末端核
苷酸与正常的核苷酸互补(频率更大的等位基因)(the more frequent alle)。当一类第一 引物与含适当变异核苷酸的靶序列的第一区域退火时，第一引物与靶的适当区域匹配，因 此起始引物的延伸。当一类第一引物与靶的第一区域退火、而且此区域感兴趣的核苷酸与 第一引物3'末端核苷酸不互补时，这类第一引物与靶的适当区域不匹配，因此引物的延伸 不能起始。术语"匹配"或"不匹配"意指DNA互补链的成对核苷酸杂交的潜能。匹配 的核苷酸能够有效的杂交，例如经典的A/T和G/C碱基对。
当然，若需要，也可使用多于两类的不同的标记引物。在一个实施方案中，本发明涉 及对同一样品里多于一种疑似的变异核苷酸的存在、缺失进行检测，或对其进行定量。在 这种情况下， 一个反应里包括多于一种的针对不同SNPs或突变而设计的第一引物。
第一引物优选被标记(图4)。更优选的话，第一引物的标记不在5'末端。这样设计 是为了第一引物延伸产物的降解，该降解产生可检测信号。第一引物可以与靶退火，但是 如果其与适当的核苷酸不匹配，它则不能延伸，因此不产生可检测信号。在适当的延伸条 件下，例如温度高于引物退火使用的温度时，退火的、未被延伸的第一引物将从模板上解 离。在一些情况里，例如温度通常有利于引物的退火时，杂交条件可以包含引物延伸和降 解的残留活性。降解的残留活性可以裂解一小部分退火的第一引物，这点会导致第一引物 的其余部分不稳定，进而从模板分子上解离。当标记位于第一引物的中央和靠近第一引物 3'末端时，退火的、不被延伸的第一引物不产生可检测信号。在这点上，第一引物优选在 距离5'末端至少3个核苷酸处被标记。第一引物更优选在距离5'末端至少6个核苷酸被标 记。第一引物最优选在距离5'末端至少9个核苷酸处标记。
第一引物可以包括第一和第二标记。第一标记和第二标记可以是包含荧光团或非荧光 团染料的一对相互作用的标记物。这种相互作用的标记的一个实例是荧光团一淬灭剂。第 一标记和第二标记之间的距离是特定的，这使得两种标记在延伸产物的降解过程中得以分 离。
本发明中使用的"荧光团"意指，在特定的激发能波长下吸收光能，而且在不同的特 定波长下发射出光能的基团。荧光标记包括，但不限于以下例子AlexaFluor染料(Alexa Fluor 350， Alexa Fluor 488， Alexa Fluor 532， Alexa Fluor 546， Alexa Fluor 568， Alexa Fluor 594， AlexaFluor633， Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680) ， AMCA， AMCA-S，氟硼荧 (BODIPY)染料(BODIPYFL， BODIPY R6G, BODIPY TMR， BODIPY TR， BODIPY 530/550， BODIPY 558/568， BODIPY 564/570， BODIPY 576/589， BODIPY 581/591 ， BODIPY
1630/650， BODIPY 650/665)，羧基罗丹明6G，羧基-X-罗丹明(ROX) ， Cascade Blue, CascadeYellow，花青染料(Cy3， Cy5， Cy3.5' Cy5.5)，磺酰，Dapoxyl， 二烷基氨基香 豆素(Dialkylaminocoumarin) ， 4'， 5'-二氯-2',7'-二甲氧基-荧光素，DM-NERF，伊红，赤 藓红，荧光素，FAM，羟基香豆素，IRDye (IRD 40， IRD 700， IRD 800) ， JOE，丽丝 胺罗丹明B， MarinaBlue，甲氧基香豆素，萘荧光素(Naphthofluorescein)，俄勒冈绿488, 俄勒冈绿500，俄勒冈绿514，太平洋蓝(Pacific Blue) ， PyMPO，芘，罗丹明6G，罗丹 明绿，罗丹明红，对甲氨基酚绿(Rhodol Green) 2'， 4', 5', 7'-四溴砜-荧光素(2'， 4', 5'， 7'-Tetra-bromosulfone-fluorescein)，四甲基罗丹明(TMR)，羧基四甲基罗丹明(TAMRA)， 德克萨斯红和德克萨斯红-X。
本发明中的术语"淬灭剂"包括当位于荧光标记附近时，能够吸收激发的荧光标记的
能量，而且能够分散此能量而不发射可见光的任何基团。淬灭剂包括，但不限于以下 DABCYL (4- (4'-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸)，琥珀酰亚胺酯，二芳基罗丹明羧酸 (diarylrhodaminecarboxylicacid)，琥珀酰亚胺酯(QSY-7)，和4'， 5'-二硝基荧光素羧 酸，琥珀酰亚胺酯(QSY-33)，quencherl，或者"黑洞淬灭剂"(BHQ-l,BHQ-2和BHQ-3)。
本发明公开的方法的第一引物包含一个与靶序列互补的3'序列，该序列通常被用于引 导延伸反应。这部分引物被称为第一引物的3'引导部分。第一引物可包括引导部分的5' 额外序列，该额外序列可与靶序列互补，也可不互补。这个额外序列被称为尾巴。在一个 实施方案里，第一引物包含一个与靶序列不互补的第一尾巴。第一尾巴可以包含非核酸或 一个核苷酸序列。第一尾巴可是双链的，其中与第一尾巴互补的寡核苷酸可以与第一尾巴 序列退火。第一引物优选在它的非尾巴序列处被加上第一标记，其中与第一尾巴互补的寡 核苷酸在5'末端或靠近5'末端处被加上第二标记(图4B)。此外，第一标记和第二标记 可以是上述定义的相互作用的荧光团或非荧光团染料。
在另一个实施方案中，第一引物可进一步包含一个非核酸的第二尾巴或者一个与第一 尾巴连接、与耙核酸序列充分互补的核苷酸序列。第二尾巴可以包括一个序列，该序列能 够与邻近区域退火，该区域的3'端能够与第一引物的引导部分退火(图4C)。
第一引物可包含一个区域，该区域能与一个与第一引物杂交的互补寡核苷酸组成双链 二聚体。第一引物与靶核酸的杂交强于它与互补寡核苷酸的杂交。第一引物和第一引物的 互补寡核苷酸，各自被相互作用的标记物中的一个所标记(第一标记和第二标记)。 一旦 第一引物与扩增产物杂交，第一和第二标记分离。互补寡核苷酸的3'端优选被阻滞。标记 可以位于第一引物和互补的寡核苷酸的任意位置。标记优选可不位于第一引物的5'末端 (图4D)。
第二引物可包含一个区域，该区域能够与一个与第二引物杂交的互补寡核苷酸组成双 链二聚体。第二引物与耙核酸的杂交强于它与互补寡核苷酸的杂交。第二引物和第二引物 的互补寡核苷酸，各自被相互作用的标记物中的一个所标记(第一标记和第二标记)。一旦第二引物与扩增产物杂交，第一和第二标记分离。标记可以位于第二引物和互补的寡核 苷酸的任意位置。标记可以位于第二引物的5'端(图4E)。
B. 三磷酸核苷
本发明中的术语"三磷酸核苷"意指DNA或RNA中的核苷，因此包括结合了腺嘌 呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷。糖基可以是脱氧核糖或核糖。 通常，脱氧核苷被用于与DNA聚合酶结合。但是，应了解可以使用能够与腺嘌呤、胞嘧 啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶等常用碱基中的一个配对的其它被修饰的碱基。这种被修 饰的碱基的例子包括8-氮鸟嘌呤和次黄嘌呤。
本发明中的术语"核苷"意指DNA或RNA中存在的核苷酸，因此包括以腺嘌呤、 胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶作为碱基，以脱氧核糖或核糖作为糖基的核苷酸。然 而应当认为，能与某种常规碱基(腺嘌呤、胞喷啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)进行碱 基配对的其他修饰的碱基，也可以用于本发明所用的引物中。这类修饰的碱基包括如8-氮鸟嘌呤和次黄嘌呤。
应了解本发明所使用的方法为检测邻近一部分靶碱基序列的疑似变异核苷酸的存在 或缺失，变异核苷酸不包括所有的四种不同的核苷酸。因而，第一引物的延伸产物和必要 时其它引物的延伸产物可以在仅由适当的相应的三磷酸核苷存在的条件下形成，而不需要 四种不同的三磷酸核苷。
在一个实施方案中，至少一种三磷酸核苷被标记，由此，第一引物延伸产物的降解产 生可检测信号。标记的核苷酸的例子包括，但不限于，氨甲基香豆素乙酸盐-dUTP,生物 素-dUTP，地高辛-dUTP，四甲基罗丹明-dUTP，荧光素-dUTP，对甲氨基酚绿-X-dUTP， Cy5-dCTP和TR770-dATP。
C. 酶类
公开的方法利用一个核酸聚合酶以延伸引物和一个核酸酶活性以降解引物延伸产物。 核酸酶活性优选是核酸外切酶活性。核酸外切酶活性最优选是5'—3'核酸外切酶活性。其 中，提供这样核酸酶活性的合适的酶的例子包括X核酸外切酶、T7核酸外切酶、T叫DNA 聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶。可以使用任何核酸聚合酶。引物的延伸和降解优选由同 一个酶提供，TaqDNA聚合酶是一个侯选酶。这同一个酶优选也用于扩增。特别优选的是， DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。
II方法
公开的方法包括与靶核酸模板退火的第一引物的延伸，和随后的第一引物延伸产物的降解，因此该方法产生可检测信号。本方法的关键因素是退火的第一引物的延伸能力，这 决定了能否产生可检测信号。由于不同的原因，例如如果第一引物的3'末端核苷酸和与 它退火的靶序列的变异(或正常)核苷酸不互补，靶模板上退火的第一引物则不能延伸。 因此，设计了两类第一引物，其中，第一类第一引物针对变异的核苷酸，第二类针对正常 的核苷酸。两类第一引物可以被不同地标记，由此可以获得不同等位基因的精确分型，或 者获得一个特异核苷酸的存在或缺失。
本发明不同于前述的美国专利5487972方法。首先，美国专利5487972方法使用探 针杂交作为产生信号的唯一方法，其中探针与靶退火，从而产生信号。可以预期探针能够 不适当的退火，因此产生一个假阳性信号。因此，美国专利5487972方法不适用于精确 的检测稀有突变或者靶序列的变异核苷酸的定量。相反，本发明的方法使用第一引物的精 确聚合，其中引物的延伸对于产生检测信号和定量信号是必需的。与美国专利5487972方 法不同，在本发明方法中，引物/探针与靶序列的杂交不产生检测信号。第二，美国专利 5487972方法使用5'末端标记的探针，但是本发明使用的引物优选不在5'末端标记。如上 简述，在美国专利5487972方法中，信号的产生与探针的杂交相关。本方法使用了一个完 全不同的方法，其中探针(引物)的简单退火不产生检测信号；而第一引物的延伸对检测 信号的产生是必需的。第一引物5'末端不被标记，这排除了退火的、未被延伸的第一引物 的残留的降解活性所产生的假阳性信号。第三，美国专利5487972方法使用的是3'末端被 阻滞的探针，但是本发明方法使用的是能够延伸的引物。第四，可以通过本发明方法获得 变异的靶核酸和正常的核酸之间的正确比例(也就是定量数据)，但是，美国专利5487972 方法不能获得这样的定量数据。最后，本发明方法使用结合入引物延伸产物中的标记的三 磷酸核苷， 一旦引物延伸产物被降解，则产生检测信号。
本发明提供了检测耙核酸、或者检测一个个体的待测样品里包含的一个或更多的靶核 酸里的至少一个变异的核苷酸的存在或缺失的方法，根据一个对照或多个对照，所述方法 包括
(a) 用靶核酸序列的第一区域的第一寡核苷酸引物处理样品，以形成二聚体的混合 物，所述二聚体包括在杂交条件下与靶核酸退火的第一寡核苷酸引物。其中所述第一引物 的核苷酸序列与靶核酸的所述第一区域充分互补，其中该第一区域包含一个疑似的变异核 苷酸；
(b) 将步骤(a)的混合物置于包括适当的三磷酸核苷和核酸聚合酶的延伸条件下， 以延伸退火的第一引物。若能延伸，以合成第一引物的延伸产物。
(c) 如果存在的话，在降解的条件下降解第一引物的延伸产物(包括第一引物)， 因此产生可检测信号，这表示靶核酸或靶核酸里变异核苷酸的存在。可检测信号的水平或 者与靶核酸序列的量相关，或者与靶核酸序列中特异的变异核苷酸的量相关。
第一个寡核苷酸引物在杂交条件下与靶核酸退火，以形成二聚体的混合物。杂交条件 包括适当的缓冲液和温度。当步骤(b)里的退火的第一引物在延伸条件下不能延伸时， 不能产生第一引物的延伸产物。从而，在步骤(c)里，第一引物的延伸产物在降解条件
17下不降解，因此不产生可检测信号，这表示耙核酸或靶核酸里特异的变异核苷酸的缺失。 当步骤(b)里的一部分退火的第一引物在延伸条件下延伸时，这部分延伸的第一引物与 靶序列中特异的核苷酸的数量有关。特异的核苷酸可是一个SNP或者是一个突变的核苷 酸。第一引物可以包含一个与SNP或突变的核苷酸互补的3'末端核苷酸。从而，在步骤 (c)里，第一引物的延伸产物在降解条件下发生降解，因此产生可检测信号，这表示了靶核 酸或者靶核酸里特异的变异核苷酸的数量。
第一引物延伸产物的降解优选以模板依赖的方式发生。许多酶类可以用模板依赖的方 式剪切引物的延伸产物，例如T7核酸外切酶，或者有5'—3'核酸酶活性的TaqDNA聚合 酶。提供引物延伸和降解的酶优选是同一种酶，例如TaqDNA聚合酶。
在另一个实施方案中，步骤(a)包含使用靶核酸序列第一区域的第一寡核苷酸引物 和同一条靶核酸链的第二区域的第二寡核苷酸引物处理样品，以形成二聚体混合物，所述 二聚体包括在杂交条件下与耙核酸退火的第一和第二寡核苷酸引物。其中，第一引物的核 苷酸序列与耙核酸第一区域充分互补，所述第二引物的核苷酸序列与耙核酸的所述第二区 域充分互补。而且其中的二聚体包含与第一引物和第二引物退火的靶序列，其中第二引物 的3'端邻近或在第一引物5'端的上游，或者说，靶核酸的第二区域位于靶核酸第一区域的 5，端。
在这个实施方案中，步骤(b)进一步包含了正在延伸的退火的第一和第二引物，若 能延伸，其在延伸条件下合成第一和第二引物的延伸产物。延伸条件包含适当的三磷酸核 苷和一个核酸聚合酶。在步骤(c)里，第一引物的延伸产物在第二引物的延伸过程中发 生降解。
还有一种实施方案，步骤(a)进一步包含了使用至少两类靶核酸序列第一区域的第 一寡核苷酸引物处理样品，以形成二聚体混合物，所述的二聚体包括在杂交条件下与靶核 酸退火的第一寡核苷酸引物。第一引物的核苷酸序列与靶核酸的第一区域充分互补，其中 第一类第一引物的3'末端核苷酸与疑似的变异核苷酸互补，而且第二类第一引物的3'末端 核苷酸与相应的正常核苷酸互补。在步骤(b)里，当第一类第一引物与靶核酸序列中包 含疑似的变异核苷酸的第一区域退火时，可合成第一类第一引物的延伸产物；当第一类第 一引物与耙核酸序列中包含相应的正常核苷酸的第一区域退火时，则不能合成延伸产物。 当第二类第一引物与靶核酸序列中包含正常核苷酸的第一区域退火时，可合成第二类第一 引物的延伸产物；当第二类第一引物与靶核酸序列中包含相应的变异核苷酸的第一区域退 火，则不能合成延伸产物。
如果第二类第一引物包含使其抗核酸酶剪切的修饰的核苷酸或接头，它可以作为阻滞 引物。当修饰过的第二类第一引物与靶核酸序列中包含正常核苷酸的第一区域退火时，延 伸产物被合成。因为酶的5'核酸外切酶活性不能剪切第二类第一引物，第二类第一引物的 延伸产物阻滞了上游的第二引物的延伸，从而抑制了包含正常核苷酸的靶序列的扩增。因此，这个反应富集了包含变异核苷酸的耙序列。
在优选的实施方案中，步骤(a)、步骤(b)和步骤(C)是部分PCR反应，其包含:
i) 在变性的条件下处理样品，使得引物的延伸产物从模板上分离，其中延伸产物在模 板上形成；
ii) 将适当的三磷酸核苷、 一个核酸聚合酶、 一个第一引物(或两类第一引物)、 一个 第二引物和一个第三引物， 一起或者按顺序与上述产生的单链接触。若可能，用上述产生 的单链作为模板以合成更多的延伸产物。其中，在第二引物延伸的过程中，第一引物的延 伸产物在所述具有5'— 3，核酸酶活性的核酸聚合酶的作用下发生降解。其中所述的第三 引物包含一个与第二引物的延伸产物充分互补的序列。
iii) 重复足够多次上述步骤，产生带有检测标记的可检测的变化。
应了解，前述的PCR反应可以包含靶序列第一条链的一个第一引物和与靶序列的第 一条链互补的第二条链的另一个第一引物。使用耙序列两条链的第一引物，可以增加检测 信号，并且提高特异性。
在本发明描述的每一种方法里，提供的样品疑似包含靶核酸或感兴趣的特异变异核苷 酸。样品里包含的耙核酸可以是双链基因组DNA或者必需时是cDNA，然后用任何合适 的包括物理的、化学的、或酶学的为本领域的技术人员所知的变性方法变性DNA或cDNA。 一个分离双链的优选的物理方法包括对核酸加热直到其完全变性(〉99%)。典型的热变 性包括的温度范围大约为80°C至105°C，时间长度范围为几秒至几分钟。作为变性之外 的另一种选择，靶核酸可以以一种单链的形式，例如单链RNA或DNA病毒，存在于样 品里。
在能够使引物与单链核酸结合的杂交条件下，变性的核酸链然后与包括第一引物、第 二引物或第三引物的寡核苷酸引物温育。第一引物的延伸产物随后被降解，因此其不能作 为模板。但是，可选择第二和第三引物。因为它们在二聚体序列上的相对位置，使得一个 引物合成的延伸产物从它的互补的模板上分离后，可作为另一个引物延伸的模板。理论上， 第一引物的延伸产物可完全被降解。实际上可能有些遗漏，其中可能有一小部分第一引物 的延伸产物不被降解，而且被整合入一个双链片段中。但是，这种遗漏不影响本发明的精 确性。
同样应了解，尽管本发明建立在延伸依赖的降解的基础上(例如，由此第一引物的延 伸产物在降解的条件下不发生显著的降解，因此实际操作中不产生可检测信号)，但是原 则上，甚至未延伸的引物的一些微量降解可以发生。但是，所述情况不影响本发明的精确 性。
在本发明的实际操作里，在第二引物的延伸阻滞第一引物的结合位点前，第一引物必 须首先或同时与互补核酸退火。可使用多种技术达到这个目的。可以对第一引物定位，使其5'末端距离第二引物的3'末端足够远，因此给第一引物更多的时间退火。也可使用一个 第一引物，其熔解温度高于第二引物的熔解温度。熔解温度(Tm)的定义是使一半的DNA 二聚体解离为单链的温度，其表示二聚体的稳定性。例如，第一引物可被设计得长于第二 引物。第一引物的核苷酸组成可被选择具有更高的G/C含量，因此，其热稳定性高于第二 引物。同样，可向第一个引物内整合入修饰的核苷酸。相比自然产生的核酸里典型存在的 碱基，修饰的核苷酸包含的类碱基可形成更稳定的碱基对。
利用两类第一引物和第二、第三引物的热稳定性不同，热循环参数也可不同。例如， 进行过热循环里的变性步骤后，可引入一个允许第一引物结合、但不允许第二和第三引物 结合的中间温度，然后升温到延伸温度(例如72。C )，因此，匹配的第一引物得以延伸， 不匹配的第一引物逐渐消失。中间温度和延伸温度的循环数可尽可能重复多次，使得匹配 的第一引物在尽可能多的靶模板上延伸。然后，可降低温度，从而允许第二和第三引物的 退火和延伸。
因为第一引物的延伸产物不应当被用作复制的模板， 一个整合入第一引物的阻滞部分 将阻滞部分或整个第一引物的复制。原则上，包含在第一引物里的阻滞部分可是任何不被 聚合酶识别为适当模板的实体。
在足量的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP, dGTP， dCTP,和dTTP)或上述讨论的它 们的类似物存在的条件下，在包含适当的盐、金属阳离子和pH缓冲系统的反应介质中， 模板依赖的寡核苷酸引物的延伸被聚合因子催化。适当的聚合因子是己知的催化引物合成 和模板依赖的DNA合成的酶类，而且优选该酶有5'3'核酸酶活性。已知的DNA聚合酶包 括大肠杆菌DNA聚合酶、极端嗜热菌(Thermus thermophilus) (Tth) DNA聚合酶、嗜 热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus ) DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA 聚合酶和Thermus aquaticus (Taq) DNA聚合酶。使用这些DNA聚合酶催化DNA合成的 反应条件为本领域所熟知。
在包含适当的盐、金属阳离子和pH缓冲系统的反应介质存在的条件下，模板依赖的 延伸产物的降解被5'核酸外切酶活性所催化。优选的话，降解条件和延伸条件一致，而且 用于引物延伸的DNA聚合酶提供5'核酸外切酶活性。优选Taq DNA聚合酶用作聚合因 子和降解因子。
可通过多种方法完成对引物的延伸和第一引物延伸产物的降解的检测或确认，而且该 检测或确认取决于使用的标记的来源。在一个优选方法里，实时PCR被用于监测反应的 每个循环的信号的产生。在一个实施方案中，至少一个三磷酸核苷被标记，由此第一引物 延伸产物的生成和/或降解会产生可检测信号。在一个优选实施方案中，第一引物被标记。 第一引物可包含一个定位在非5'端的标记。第一引物优选包含一对定位在非5'端的相互 作用的标记物。第一引物可被设计为第一和第二标记是FRET或者接触淬灭的关系。第一 引物延伸产物一旦降解，会产生在PCR扩增的每个循环被监测到的检测信号。可通过被标记的第一引物的延伸产物的降解，建立起荧光信号的检测和靶核酸序列或者耙序列里突变核苷酸的数量之间的相关性。
为了提供一个对照，反应里可包括一个通用探针，该探针与变异核苷酸定位的诊断区域外的区域杂交。通用探针将给出可测定包括野生型和突变的耙序列在内的所有扩增产物的信号。通用探针产生的实时监测将反映加入反应容器中的初始材料的数量。针对变异核苷酸的第一引物产生的检测信号可被使用通用探针所产生的检测信号均一化，因此提供精确的定量数据。但是，也可通过终点检测信号推断出数据，因为我们意外地发现，标记的第一引物产生的终点荧光信号与样品里存在的变异核苷酸的数量有很好的关联。这可能因为当反应到达平台期时，不同反应容器里的扩增产物的数量是相同或相近的，而且可能因为在扩增中可维持变异核苷酸和野生型核苷酸的比例。应了解，为此，不需要作为实时检测监测一个反应的每个循环。可改为在终点采样，这点可很好的适用于某些应用和某些情况。例如，在没有实时检测仪器的情况下，可使用一个荧光读取器记录下终点的数据和起始点的数据。
分析生物样品的突变的存在和/或数量，或者分析多位点核酸序列的多态性的方法可在一个反应容器里操作进行。与一个实施方案一致，针对每个突变或多态性的多个第一引物和多个第二引物、第三引物可包含在一个反应中，其被设计用于扩增携带每个突变或多态性的每一个区域。
本发明方法里使用的试剂可被包装为诊断试剂盒。诊断试剂盒包括针对靶核酸序列的每个诊断区域的第一引物。其中第一类第一引物的3'末端核苷酸与疑似的变异核苷酸互补，而第二类第一引物的3'末端核苷酸与相应的正常核苷酸互补。由此使用中，当所述第
一引物的末端核苷酸与靶核酸相应的核苷酸互补时，第一引物的延伸产物被合成。随后第一引物的延伸产物被降解，因此产生可检测信号。当所述第一引物的末端核苷酸与靶核酸序列相应的核苷酸不互补时，延伸产物则不被合成。试剂盒还包括用于扩增包含与第一引物退火的诊断区域在内的一段靶序列的相应的第二和第三引物。所述试剂盒还可以包含扩
增和检测分析所需的其它经适当包装的试剂和材料，例如缓冲液、dNTP和/或聚合因子，以及操作方法的说明书。
因此，本发明的特定试剂盒为针对本发明所述方法的应用而经适当调整的试剂盒，例如包括适当的被标记的第一引物(能够降解的)、第二引物(扩增引物)的混合物，而且包括本发明所述的任意操作方法的说明书。试剂盒还包括一个具有5'—3'核酸外切酶活性的聚合酶等等。
在此将根据下述非限制性的实施例对本发明进行进一步的描述。本领域的技术人员将能据此想出本发明的其他实施方案。
鉴于本发明所引用的所有的参考文献的公开内容可能被本领域的技术人员用以实现
21本发明，特此将其明确引入本发明中以供参考。
实施例
实施例1
其后实验使用的所有引物均由EUROGENTEC, UK合成。引物被设计为从包含一段正常的BRAF基因片段和一段突变的BRAF基因片段(携带V599E突变)的质粒中扩增一段BRAF基因的靶DNA序列。基因片段包含以下序列
ggaaagcatctcacctcatcctaacacatttcaagccccaaaaatcttaaaagcaggttatataggctaaatagaactaatcattgttttagacatacttattgactctaagaggaaagatgaagtactatgttttaaagaatattatattacagaattatagaaattagatctcttacctaaactcttcataatgcttgctctgataggaaaatgagatctactgttttcctttacttactacacctcagatatatttcttcatgaagacctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacagtgaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgtctggatccattttgtggatggtaagaattgaggctatttttccactgattaaatttttggccctgagatgctgctgagttactagaaagtcattgaaggtctcaactatagtattttcatagttcccagtattcac引物的位置和方向如图6A所示。弓l物的序列为BrafF2，GGAAAGCATCTCACCTCATCCTAACAC; BraffindR，GACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAG; BrafFam ，
GGACCCACTCCA1CGAGA2TTCA (1是dT-Fam,2是dT-BHQl)。除非另外说明，所有的核酸序列均按5'端至3'端书写。
引物稀释至终浓度为10 ^M。用以下成分和条件进行扩增10xPCR缓冲液(ThermoPol反应缓冲液，NEB) 2.5 |il， 10mMdNTPs0.5 pl，每个引物0.5 pl (若加入)，TaqDNA聚合酶(5L[4il) 0.25^1，质粒DNA 0.5 ^ (105分子)，补水至终体积为25 pl。在Bio-Rad Chromo 4实时PCR仪上进行反应94 °C 1 min; 94°C 9 sec 40个循环，57°C 15sec， 72。C15sec， 57。C15sec， 72°C 15 sec (在此步骤读取荧光)。反应中加入的引物如下所述
管号123456
BrafF2++++++
BraffindR++++--
BrafFam--++++
正常DNA-+-+-+
突变DNA+_+-+-
PCR反应后，将扩增的DNA产物上样，进行琼脂糖凝胶。结果如图6B所示。实时PCR结果表明，阳性信号仅在4号管内被检测到，其中的引物被设计用于检测正常的DNA。
实施例2
扩增的引物和探针为JKR3ccF2，
22GATGCTCTGAGAAAGGCATTAGA; JKFamdR，
GTTTTACTTACTCTCGTCTCCAC6GAA，在该引物里，位置11的"T"是BHQ-l(dT)，"6，，是Fam-dR。
引物稀释到终浓度为10 ^M。用以下成分和条件进行扩增10xPCR缓冲液 (NEBthermo缓冲液)3pl，甜菜碱5^1， 10 mM dNTPs 0.5 nl，引物JKR3 1.25W，引物JKR3ccF20.5 pl， JKFamdR lpl， Taq DNA聚合酶(若加入)(5，) 0.25 |al，质粒DNA 0.5 pl (105分子)，补水至终体积为25 pl。在Stratagene MX3005实时PCR仪上进行反应94 °C 1 min;95°C 15 sec40个循环，61。C18sec， 54。C18sec， 72。C18sec, 60。C20sec， 72。C25sec，72°C 30 sec (在每个温度收集数据)。质粒模板为包含V617F的突变DNA和野生型DNA的混合物。本方法包括使用实时PCR扩增靶核酸序列；包括使用一个波长为492nm，能被Fam吸收的光照射生物样品；包括检测所述荧光团发射的荧光和监测所述荧光基团发射的温度依赖的荧光。
变性的JKR3ccF2引物的延伸产物在退火条件下形成茎-环结构。R3引物由于其茎环结构则不能退火。富集引物JKFamdR与环状部分退火，而且如果它与突变的核苷酸退火，其能够被延伸。引物JKFamdR的延伸打开了茎环结构，因此允许R3引物得以退火和延伸。因为Taq聚合酶的5'—3'核酸外切酶活性，R3引物的延伸降解了富集引物的延伸产物。如果聚合酶具有链置换活性，富集引物的延伸产物也可被置换。如果富集引物与野生型DNA退火，该野生型DNA包含的一个核苷酸与引物的末端核苷酸不匹配，富集引物则不被延伸，由此茎环结构是完整的。这会导致包含突变核苷酸的DNA的富集。富集引物包含Fam和BHQ标记。富集引物延伸产物的降解产生荧光信号。该反应允许靶核酸的富集和检测在同一管里进行。
实施例3
扩增的引物和探针为JKR3Hex， AACAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGA (5'末端用HEX标记)；JKR3Dab， CCTTTCTCAGAGCATCTGTT (3'末端用DABCYL标记)；JKF7， GTATGATGAGCAAGCTTTCTCACAA。
引物稀释至终浓度为10 ^M。用以下成分和条件进行扩增10xPCR缓冲液(NEBthermo缓冲液)3.5ixl，甜菜碱5 pl， 10 mM dNTPs 0.5 pl，引物JKF7 0.5^1，引物JKR3Hex0.75 pl， JKR3Dab 1.25|al， JKFamdR 1^1， Taq DNA聚合酶(若加入)(5，) 0.25^1，质粒DNA 0.5 ^ (105分子)，补水至终体积为25 pl。在Stratagene MX3005实时PCR仪上进行反应95°C 15 sec， 54。C 15 see, 68°C 15 see, 59。C 15 sec， 50°C 15 sec， 63。C 25 sec ,50个循环(每个温度收集数据)。质粒模板为包含V617F的突变DNA和野生型DNA的混合物。靶核酸序列的扩增通过实时PCR方法实现。引物JKFamdR是作为检测引物的第一引物。引物JKR3Hex是作为扩增引物之一的第二引物。引物JKF7是作为扩增引物之一的第三引物。寡核苷酸JKR3Dab是一个与JKR3Hex互补的互补寡核苷酸。当两个寡核苷酸互相杂交时，JKR3Hex和JKR3Dab上的标记是接触淬灭的关系。当靶存在时，因为引物JKR3Hex包含与靶序列互补的额外的核苷酸，其优选与靶序列杂交，而不是与互补的寡核苷酸JAR3Dab杂交。Hex信号表示靶序列被成功的复制，其可作为一个对照。Fam信号表示靶序列中存在变异的核苷酸，而且Fam信号的水平与靶序列中变异核苷酸的量相关。除了这里设计的探针，能够结合到扩增产物上的任何探针均可作为证明靶序列成功扩增的对照。
实施例4
设计一个是第一引物，也是阻滞引物的引物BrafFamWTB，其序列为GGA*C*C*C*A*C*T*CCA*T*C*G*AGA6TTC*A (此处"*"表示硫代磷酸酯接头，"6"是dR-生物素)。硫代磷酸酯接头修饰使得引物能够抗核酸酶的剪切。当此引物用于反应中，它的延伸链不被降解，因此阻滞了上游引物引导的延伸。
2权利要求
1.一种对靶核酸的存在、不存在、数量或者包含在样品里的一个或多个靶核酸中的至少一个变异核苷酸进行检测的方法，所述方法包括(a)使用与靶核酸序列第一区域互补的第一寡核苷酸引物处理样品，以形成二聚体的混合物，所述二聚体包括在杂交条件下与靶核酸退火的第一寡核苷酸引物，其中所述第一引物的核苷酸序列与靶核酸的所述第一区域充分互补，而且其中所述第一区域是包含疑似变异核苷酸的诊断区域；(b)将步骤(a)的混合物置于包含适当的三磷酸核苷酸和核酸聚合酶的延伸条件下，延伸退火的第一引物，若能延伸，合成第一引物的延伸产物；以及(c)若第一引物延伸，在降解的条件下降解第一引物的延伸产物，从而生成表示靶核酸的存在和/或数量、或者靶核酸里变异核苷酸的可检测信号。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)里，退火的第一引物在延伸的条件下不能延伸，由此第一引物的延伸产物不能产生，由此在步骤(c)里，第一引物的延伸产物在降解的条件下不发生降解，因此不产生可检测信号，这表示靶核酸或者靶核酸里变异核苷酸的不存在。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一引物的3'末端核苷酸与疑似的变异核苷酸互补，其中当第一引物与包含疑似变异核苷酸的靶区退火时，退火的第一引物能够延伸，其中当第一引物与包含正常核苷酸的靶区域退火时，退火的第一引物不能延伸。
4. 根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述的疑似变异核苷酸是SNP或者突变的核苷酸。
5. 根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述的降解以模板依赖的降解方式进行。
6. 根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中所述的降解条件包括核酸酶活性。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述的核酸酶活性是核酸外切酶活性。
8. 根据权利要求6所述的方法，其中所述的核酸酶活性是5'—3'核酸外切酶活性。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述的5'—3'核酸外切酶活性由DNA聚合酶提供。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述的DNA聚合酶与步骤(b)中使用的酶相同。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中所述的DNA聚合酶是TaqDNA聚合酶。
12. 根据权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中至少一种所述的三磷酸 核苷被标记，由此第一引物延伸产物的降解产生可检测信号。
13. 根据权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中第一引物含有标记，由 此第 一 引物延伸产物的降解产生可检测的信号。
14. 根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)包括使用与靶 核酸序列第一区域互补的第一寡核苷酸引物和与靶核酸序列第二区域互补的第二寡核苷 酸引物处理样品，从而形成二聚体混合物，所述二聚体包括在杂交条件下与靶核酸退火的 第一和第二寡核苷酸引物；其中所述第一引物的核苷酸序列与靶核酸的所述第一区域充分互补， 而且其中所述第二引物的核苷酸序列与靶核酸的所述第二区域充分互补， 而且其中靶核酸的第二区域位于靶核酸第一区域的5'端。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)进一步包括退火的第一引物和第二 引物的延伸，若能延伸，在延伸条件下合成第一和第二引物的延伸产物，延伸条件包括适 当的三磷酸核苷和一个核酸聚合酶，其中在步骤(c)里因为第二引物的延伸导致第一引 物的延伸产物降解。
16. 根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)进一步包括使 用与靶核酸序列第一区域互补的至少两类第一寡核苷酸引物处理样品，从而形成二聚体混 合物，所述二聚体包含在杂交条件下与耙核酸退火的第一寡核苷酸引物，其中所述的第一引物的核苷酸序列与靶核酸的所述第一区域充分互补， 而且其中所述的第一引物的第一类型的3'末端核苷酸与疑似的变异核苷酸互补， 而且其中所述的第一引物的第二类型的3'末端核苷酸与相应的正常核苷酸互补， 由此在步骤(b)里，当所述的第一引物的第一类型与包含靶核酸序列里的疑似变异 核苷酸的第一区域退火时，第一引物的第一类型的延伸产物被合成，但是当所述的第一引 物的第一类型与包含靶核酸序列里相应的正常核苷酸的第一区域退火时，延伸产物则不能 被合成，而且由此在步骤(b)里，当所述的第一引物的第二类型与包含靶核酸序列里的正常 核苷酸的第一区域退火时，第一引物的第二类型的延伸产物被合成，但是当所述的第一引 物的第二类型与包含靶核酸序列里相应的变异核苷酸的第一区域退火时，延伸产物则不能 被合成。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述第一引物的第一类型和第二类型是可以降解的。
18. 根据权利要求16所述的方法，其中所述的第一引物的第二类型是不可降解的，其中第一引物的第二类型包含修饰的 核苷酸或修饰的接头或者非核苷酸，由此第一引物的第二类型的延伸产物阻滞了第二引物 起始的延伸，因此富集了包含疑似变异核苷酸的靶核酸。
19. 根据权利要求1至18中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)、步骤(b) 和步骤(c)是PCR反应的部分，包括在变性的条件下处理样品，使得引物延伸产物从形成它的模板上分离； 将上述产生的单链与适当的三磷酸核苷、有5'—3'核酸酶活性的核酸聚合酶、 一种或更多种第一引物、第二引物、第三引物， 一并或按顺序混合，其中一种或每种第一引物被标记，由此第一引物延伸产物的降解产生可检测信号，由此若可能，使用上述产生的单链作为模板以合成更多的延伸产物， 而且其中通过所述的有5'—3'核酸酶活性的核酸聚合酶，第一引物延伸产物的降解在第二引物的延伸过程中可发生，而且其中所述的第三引物包含与第二引物的延伸产物充分互补的序列； 在靶核酸或靶核酸里的变异核苷酸存在的情况下，重复上述步骤足够多次，第一引物或每个第一引物的降解导致可检测信号。
20. 根据权利要求13或19所述的方法，其中所述的第一引物不在5'末端处被标记。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述的第一引物在距离5'末端至少3个核苷 酸处被标记。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述的第一引物在距离5'末端至少6个核苷 酸处被标记。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述的第一引物在距离5'末端至少9个核苷 酸处被标记。
24. 根据权利要求13或19所述的方法，其中所述的第一引物包含相互作用的第一标 记和第二标记。
25. 根据权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述的第一引物包含 (a)与靶核酸序列的第一区域互补的启始部分，而且进一步包含(b)非核酸或核酸的第一尾巴，位于5'端的与靶核酸序列不互补。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述的第一引物进一步包含非核酸或核酸的第二尾巴，与所述的第一尾巴连接，而且所述第二尾巴序列与第一引物启始部分的互补区 域邻近的靶核酸序列充分互补。
27. 根据权利要求25或26所述的方法，其中所述的第一引物在第一尾巴处包含双链 部分，其中与第一尾巴互补的尾巴互补寡核苷酸与第一尾巴序列退火，其中所述的第一引物被第一标记所标记，而且所述的尾巴互补寡核苷酸被第二标记所 标记，而且其中所述的第一标记和第二标记是一对相互作用的标记物。
28. 根据权利要求1至27中任一权利要求所述的方法，其中所述的第一引物包含能 够与第一引物杂交的第一互补寡核苷酸形成双链二聚体的区域，其中第一引物与靶核酸杂交的亲和性大于它与第一互补寡核苷酸的杂交， 而且其中第一引物和第一互补寡核苷酸各自被一对相互作用的由第一标记和第二标记组成的标记物中的一个所标记，使得一旦靶核酸扩增，第一引物与靶核酸的扩增产物的杂交优先于它与第一互补寡核苷酸的杂交，相互作用的标记物因此分离。
29. 根据权利要求16至19中任一权利要求的方法，其中所述的第二引物包含能够与 第二引物杂交的第二互补寡核苷酸形成双链二聚体的区域，其中第二引物与靶核酸杂交的亲和性大于它与第二互补寡核苷酸的杂交， 而且其中引物与它的互补寡核苷酸各自被一对相互作用的由第一标记和第二标记组成的标记物中的一个所标记，使得一旦靶核酸扩增，引物与靶核酸扩增产物的杂交优先于它与互补核苷酸的杂交，相互作用的标记物因此分离。
30. 根据权利要求19所述的方法，其中所述的第三引物包含能够与第三引物杂交的 第三互补寡核苷酸形成双链二聚体的区域，其中第三引物与耙核酸杂交的亲和性大于它与第三互补寡核苷酸的杂交， 而且其中引物与它的互补寡核苷酸各自被一对相互作用的由第一标记和第二标记组成的标记对中的一个所标记，使得一旦靶核酸扩增，引物与靶核酸扩增产物的杂交优先于它与互补核苷酸的杂交，相互作用的标记物因此分离。
31. 根据权利要求24或权利要求27至30中任一权利要求所述的方法，其中所述的 第一标记和第二标记各自是荧光团和淬灭剂。
32. 根据权利要求17所述的方法，如果两类第一引物可被延伸，其中所述的两类第 一引物分别含有可产生能够区别的信号的不同标记，在第一引物延伸产物降解的过程中， 产生不同的信号。
33. —种检测样品里包含的至少一个或更多的核酸的存在或缺失的试剂盒，其包括(a)与靶核酸序列的诊断区域互补的第一引物，或者针对靶核酸序列的一个或更多的诊断区域的每一个而设计的第一和第二类第一引物，其中第一类第一引物的3'末端核苷酸与疑似的变异核苷酸互补，和/或第二类第一引物的3'末端核苷酸与相应的正常核苷酸互补，由此使用中，当第一引物的所述末端核苷酸与靶核酸相应的核苷酸互补时，第一引物的延伸产物被合成，而且随后第一引物延伸产物被降解，因此产生可检测信号，而且由此当第一引物所述的末端核苷酸与靶核酸相应的核苷酸不能互补时，延伸产物不能被合成；而且试剂盒还包括相应的用以扩增包含与第一引物退火的诊断区域在内的靶序列的 第二引物和第三引物。
全文摘要
本发明提供了可对靶核酸的存在、不存在、或数量进行检测的方法和试剂盒，或者使用合适的引物，本发明提供了可对包含在样品里的一个或更多的靶核酸里的至少一个变异核苷酸进行检测的方法和试剂盒。在目标存在的条件下，本发明基于引物延伸依赖的降解的体系，而且该降解产生可检测的信号。
文档编号C12Q1/68GK101680030SQ200880012889
公开日2010年3月24日 申请日期2008年2月29日 优先权日2007年3月1日
发明者富国良 申请人:奥西泰克有限公司