多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，以及一种用于实施所述方法 的试剂盒和一种核酸聚合物文库，特别是DNA或RNA文库。本发明还涉及该方法在基因探 针检测以及分子克隆中的用途。
【背景技术】
[0002] 特异性核酸聚合物的检测是诊断医学和分子生物学研宄的一个重要工具。基因探 针检测目前例如在鉴别传染性有机体（Organism)例如细菌和病毒、在探测正常基因的表 达以及在鉴别突变基因例如癌基因中、在组织移植前的组织分型兼容性中、在法医学中匹 配组织或血液样品中、以及在研宄来自不同物种的基因的同源性中发挥着作用。
[0003] 理想情况下，基因探针检测应该是敏感的、特异性的并且易于自动化。对灵敏 度（即低检测限）的要求已通过聚合酶链式反应（PCR)以及允许研宄人员在分析之前 对特异性靶序列进行指数扩增的其他扩增技术的发展而被大大提高。PCR技术为例如 US-B-4, 683, 202中所描述的。
[0004] 在过去几年中，通过开发新技术的而取得了进展，该新技术有望降低成本并加速 新分子诊断的开发。DNA分析仪在序列分析能力上变得日益增强。DNA重测序微阵列（Chee 等人，1996 ;Patil等人，2001)和高通量平行测序仪（Margulies等人，2005 ;Shendure等 人，2005)目前用于低复杂度基因组的全基因组分析到低至单一核苷酸分离。然而，人类基 因组仍然太大以至于如不通过特异性序列定向扩增来降低复杂度而无法实现。为了匹配这 些仪器的通量，需要更有效的技术来解决扩增瓶颈。对于全基因组测序成本一小部分的人 类外显子的全面重测序，靶序列的富集因此成为了关键。最近开发了几种序列捕获方法，例 如分子倒置探针技术（Dahl等人，2007 ;Dahl等人，2005 ;Porreca等人，2007);利用微阵列 技术的方法（Okou等人，2007 ;Hodges等人，2007 ;Albert等人，2007);利用RNA寡聚捕获 探针在溶液中杂交的技术（Gnirke等人，2009)、或者利用小液滴的乳液PCR的微流体技术 (Tewhey 等人，2009 年）。
[0005] 理论上，目前最有力和最快速的扩增技术是PCR并已被广泛用于分子诊断。为了 提高检测通量并能更有效地利用宝贵的DNA样本，通过将许多特异性引物对结合到个体 PCR中以进行几个革巴标的同时扩增（Chamberlain等人，1988 ;Shigemori等人，2005)。然 而，这是一个与PCR相关的至关重要的问题是当大量的特异性引物对被加入到相同的反应 物中时，正确和不正确的扩增子均产生。此外，即使当可避免引物二聚体并且实现特异性扩 增时，由于扩增子长度和序列属性（GC含量）而使靶标具有不同的PCR效率。在后来的阶 段，在许多扩增子丢失从而有利于高效扩增的扩增子和赝品的情况下，这影响了产品的均 匀性。为了优化多重PCR，需要凭经验确定用于每组引物组合的引物、缓冲液dNTP、酶和氯 化镁的浓度。这是个耗时的工艺，该工艺需要进行所生产的每个批次的检测。即使经过详 尽的优化实验，也不能保证多重PCR成功。
[0006] 即使在多重化情形下精心设计引物，PCR通常也仅限于10-20次同时反应，之后收 率和均匀性由于不相关的扩增产物的累积而降低（
2005 ;Broude等人，2001)。 因此，每当需要分析许多基因组序列时，通常进行大量的单独的PCR。因此，多重PCR的主要 挑战是要克服两个主要问题：导致非特异性扩增（例如引物二聚体）的引物不相容性以及 不同靶标的扩增效率的差异性。
[0007] 考虑到现有技术水平的方法的缺点，因此本发明待解决的问题是提供一种简单、 快速和便宜的用于同时扩增多个不同的核酸靶序列的方法，特别是DNA和/或RNA靶序列。 在此方面，所述方法应允许几乎所有靶序列以比传统方法特别是标准PCR更均匀的丰度扩 增。本发明提供了一种新颖的多重化技术，解决这两个基本的问题，从而允许在一个单一反 应中进行多个靶标的均匀扩增。
【发明内容】
[0008] 方法论原则
[0009] 效率标签PCR
[0010] 该方法的原理基于这样的事实：在引物/模板杂合体的3引物末端（prime end) 的单一错配显著地抑制了 PCR扩增。虽然单一 3引物错配（prime mismatch)可能使引物 退火，但是通过聚合酶进行的延伸步骤被抑制（图2a)。效率标签PCR(etPCR)利用调节每 个单一靶标的PCR效率这一事实。代替使用一个单一引物对，etPCR利用两组引物，每一组 由具有共有的核心序列（common core sequence)的相似引物组成，能使革巴标退火，但其长 度不同，从而导致在3引物末端差异（图2b)。在这样的etPCR反应中，其中模板与整个互 补序列完全匹配，所有引物均可被用于通过聚合酶来合成新链。这样形成的扩增具有与正 常PCR相符合的效率。在错配被引入到模板的引物位点的3引物部分的情况下，所有引物 将仍能够结合，然而只有一些引物将允许通过聚合酶延伸。因此，参加扩增反应的引物的一 部分将取决于靶标的3引物引物位点的错配的数量。这样PCR的效率可以通过模板中引入 特定错配进行调节。在一组5引物的情形下，可能通过引入多达4个错配来调节5个不同 等级的效率（图2C)。可使用的不同效率等级的数量是根据标签的规模来确定（等级=标 签的长度+1)。引入两个标签，在模板的每侧一个，乘以不同等级的可能性（等级=[正向 标签的长度+1] X [反向标签的长度+1])。使用模板两端4个碱基的效率标签将效率调整 至25个不同的细微差别。这种效率标签PCR为多模板扩增带来了新的机遇。通过使用适 当的标签来调整每个单一模板的PCR效率将导致所有模板均匀扩增。此外，利用用于所有 模板的含有共有序列（Common Sequence)的通用引物对（uninversal pair of primer)消 除了引物二聚体的问题。EtPCR只需要由模板组成的文库，侧翼为效率标签和共用引物序列 (common priming sequence)〇
[0011] 序列捕获：由基因组DNA制备效率标签模板文库（优选实施方案）
[0012] 从DNA源例如基因组DNA或cDNA选择感兴趣的区域（即某些基因外显子），我们 开发了一种新的序列捕获方法。该方法导致感兴趣区域的单链复制，所述感兴趣区的侧翼 为效率标签和共有引发序列（common priming sequence)，以利用etPCR进一步均勾扩增， 如上文所述。特异性序列的靶向是通过感兴趣区域侧翼的寡核苷酸的杂交步骤来实现的。 所述寡核苷酸由四个不同部分组成：靶标特异性序列、效率标签、共有引发序列和在它们外 侧（outer end)的由硫代磷酸化组成的"核酸外切酶区块"（图1)。用侧翼寡核苷酸杂交 后，由感兴趣区域组成的缺口将通过聚合酶反应来填补。合成链和寡核苷酸之间的缺口将 通过一个连接反应被封闭。在随后的扩增之前，未结合的寡核苷酸将通过核酸外切酶消化 而除去。靶向区域的新合成的DNA片段将受到保护而免受核酸外切酶消化，因为该区域两 面中的每一面将以硫代磷酸化为侧翼，作为"核酸外切酶区块"。然而，个体寡核苷酸将被加 入的核酸外切酶消化，因为在它们末端的一个上面仅包含一个核酸外切酶区块。这导致新 合成的DNA单链由所需的基因组区域组成，其侧翼为效率标签和可用于etPCR的通用引发 序列（universal priming sequences)。这种序列捕获与新颖的etPCR技术相结合可进行 任何来源DNA的均匀多重扩增，消除了引物不相容性和非均匀扩增，即多重PCR的两个基本 问题。
[0013] 本发明涉及下述实施方案（1)至（15)。
[0014] (1)使多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，其包括以下步骤：
[0015] 提供一组能使相同核苷酸序列退火的正向引物寡核苷酸，所述组包括具有 5' -X-N1I'结构的第一正向引物寡核苷酸和具有5' -X-N1-N2I'结构的第二正向引物寡核 苷酸，
[0016] 其中X是能使第一引物退火序列X'退火的核苷酸序列，N1为无或者由一个或多个 核苷酸组成，并且N 2由一个或多个核苷酸组成；
[0017] 提供多个不同的核酸聚合物作为模板，每个模板包括：（i)正向引物退火序列X'， 其与核苷酸序列X互补，和（ii)特异性靶序列；以及
[0018] 利用所述组的正向引物寡核苷酸和一个或多个反向引物寡核苷酸，通过聚合酶依 赖性扩增反应使模板扩增，其特征在于，第一正向引物寡核苷酸的3'末端核苷酸当使模板 退火时，与至少两个不同的模板序列完全匹配；并且所述第二正向引物寡核苷酸的3'末端 核苷酸当使模板退火时，与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配并且与所述至 少两个不同的模板序列中的至少一个完全匹配。
[0019] (2) (1)的方法，其进一步包括提供一组能使相同核苷酸序列退火的反向引物寡核 苷酸的步骤，其包括具有5' -Y-M1^'结构的第一反向引物寡核苷酸，和具有5' -Y-M1-M2Ij 结构的第二反向引物寡核苷酸，
[0020] 其中Y是能使反向引物退火序列退火的核苷酸序列，M1为无或者由一个或多个核 苷酸组成，并且M 2由一个或多个核苷酸组成；
[0021] 其中每个模板进一步包括反向引物退火序列，其与核苷酸序列Y互补，靶序列位 于正向引物退火序列和反向引物退火序列之间，并且所述聚合酶依赖性扩增反应是利用所 述组的正向引物寡核苷酸和所述组的反向引物寡核苷酸进行的，
[0022] 其特征在于，所述第一反向引物寡核苷酸的3'末端核苷酸当使模板退火时与至少 两个不同的模板序列完全匹配，并且所述第二反向引物寡核苷酸的3'末端核苷酸当退火时 至模板时与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配并且与所述至少两个不同的 模板序列中的至少一个完全匹配。
[0023] (3)⑵的方法，其中模板的数量为V，并且每个模板包括5'-X-etXw-r-et Y'w-Y'-3' 结构
[0024] 其中
[0025] V是大于1的整数，
[0026] w是1至v的整数，每个特定的模板分配一个单独的w值，
[0027] X如权利要求1所定义，
[0028] etXw是第一效率标签序列，
[0029] Γ是靶序列或其互补序列，
[0030] etY' w是第二效率标签序列的互补序列，
[0031] Y'是反向引物退火序列。
[0032] (4) (3)的方法，其特征在于每个效率标签序列包含1至10个核苷酸，优选2至7 个核苷酸，最优选3至5个核苷酸。
[0033] (5) (3)或（4)的方法，其特征在于模板由随后的步骤提供：
[0034] 提供一种单链原始核酸聚合物，其包含一个待扩增的原始祀序列（primal target sequence)；
[0035] 与寡核苷酸探针上的原始靶序列的5'末端杂交，所述寡核苷酸探针序列包含与原 始靶序列的5'末端互补的靶序列的一部分、引物退火序列和效率标签序列，并且与另一个 寡核苷酸探针上的原始靶序列的3'末端杂交，另一个寡核苷酸探针序列包含与原始靶序列 的3'末端互补的靶序列的一部分、引物退火互补序列和效率标签互补序列；
[0036] 通过聚合酶和连接酶合成与原始靶序列互补的链以产生模板；以及
[0037] 分离所产生的模板。
[0038] (6) (5)的方法，其特征在于所产生的模板的末端被保护以抗核酸外切酶。
[0039] (7) (5)或(6)的方法，其特征在于所产生的模板包含游离末端、两个末端区域中 的一个或多个经修饰的核苷酸以形成核酸外切酶保护。
[0040] (8) (7)的方法，其特征在于所述一个或多个经修饰的核苷酸被硫代磷酸化。
[0041] (9) (5)至（8)中任一项所述的方法，其特征在于分离所产生的模板的步骤是利用 核酸外切酶消化剩余的核酸组分而进行的。
[0042] (10)核酸聚合物文库，特别是DNA或RNA文库，包含⑵至（9)中任一项所定义的 多个模板。
[0043] (11) 一种试剂盒，用于实施⑴至（9)中任一项所述的方法，其包含：
[0044