低 (Tl)。在模板的效率标签内引入错配导致了扩增效率降低（T2)。（c)通过控制模板效率标 签（ET)内的错配程度可调节每一个单一模板的扩增效率。缩写：CCS =共有核心序列；PS =引物组；Tl =与所有引物完全匹配的靶标I ;T1 =与某个引物错配的靶标2 ;ET =效率标 签；EF = PCR效率。
[0141] 图2D示意性地示出了一组三个不同的引物寡核苷酸使一个给定模板退火。在图 2D所示的实施方案中，该组的引物寡核苷酸24a、24b、24c之间的唯一差别是它们的延伸长 度。取决于归属于给定靶序列的特异性ETS，在扩增步骤中不同数量的引物寡核苷酸将进行 聚合酶依赖性延伸。
[0142] 在图2D中所示的具体实例中，其中ETS 8包含4个核苷酸，ETS的最后两个核苷酸 与全长引物寡核苷酸延伸的最后两个核苷酸不互补。因此，只有含有2个核苷酸延伸（即 引物寡核苷酸24b)、一个单核苷酸延伸（未示出）或根本没有延伸（即引物寡核苷酸24a) 的引物寡核苷酸进行了有效的聚合酶依赖性延伸，然而含有三个核苷酸延伸（未示出）或 四个核苷酸延伸（即引物寡核苷酸24c)的引物寡核苷酸却没有。
[0143] 取决于归属于给定靶序列的特异性ETS，模板可归属于不同的模板组，延伸完全匹 配ETS或完全匹配ETS -部分的引物寡核苷酸的数量从模板组到模板组是不同的。
[0144] 缩写：PS =引物寡核苷酸组；T =靶标；ts =靶标序列。图3示意性地示出了下文 讨论的本发明实施例1中所靶向的钙蛋白酶3基因的不同外显子的位置。
[0145] 缩写：Exl7 =外显子17 ;Exl8、19 =外显子18和外显子19 ;Ex22 =外显子22。图 4是用于分离实施例1所述扩增的核酸靶序列的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶的照片。
[0146] 缩写：Pl =标准PCR ;P2 =效率标签PCR ;Exl7 =外显子17 ;Exl8_19 =外显子18 和外显子19 ;Ex22 =外显子22。
[0147] 图5描述了带有效率标签和通用引物序列的不同模板。a)生成具有不同基因组 靶序列的模板，用于执行其两个末端具有通用引物序列和效率标签etPCR。b)该表示出了 不同性质的靶序列以及整个扩增子的性质。引入不同的效率标签来分析其在etPCR中的性 能。C)在etPCR分析之前，不同模板通过凝胶电泳验证冰纯化。
[0148] 缩写：AMP =扩增子；GT =基因组靶标；ETS_A =效率标签序列A ;ETS_B =效率标 签序列B ;UPS_A =通用引物位点A ;UPS_B =通用引物位点B。
[0149] 图6描述由于固有性质引起的PCR效率变化。A)具有共有引物位点（common primer site)的不同模板被用于标准qPCR，使用相同的引物对。利用LinReg软件分析指 数期来测量PCR效率。B)可检测几个模板之间PCR效率的显着差异。C)在我们的一组模 板中，固有PCR效率与扩增子长度强相关，并显示与GC含量（d)无相关性。缩写：nFU=标 准荧光单位；Cy =循环数；S =扩增子大小，以碱基对表示；GC = GC百分比含量。
[0150] 图7表明etPCR可特异性调节PCR效率。效率标签PCR用12个模板进行，并与标 准PCR相比较。a)和具有效率标签（标签5)内无错配的模板未观察到差异。b)将错配引 入到标签较少的引物中可以参与PCR反应，以导致PCR效率降低。c)所有庇护错配的标签 显示效率显著降低，并因此进行扩增的特异性操控。降低程度以表中所示的校正因子来定 义。d)具有相同效率标签的不同模板显示出类似的校正因子。这可以通过选择某些标签进 行限定特异性模板的调节。缩写：nFU =标准焚光单位；Cy =循环数；Pl =标准PCR ;P2 = 效率标签PCR ;CF =校正因子；ET =效率标签。
[0151] 图8表明etPCR可调节多重反应中的PCR效率以产生均匀的扩增。序列捕获反应 后，使用IOOng基因组DNA，如材料和方法中所描述，进行标准PCR或etPCR。利用标准PCR， 小模板扩增是最有效的，然而较大的扩增子难以在凝胶电泳上检测。当利用etPCR时，大扩 增子易于被检测并且观察到的图案类似更均匀的扩增。需要注意的是，更大的片段由于其 具有更高的与DNA染料结合的特性，在染色过程中给出更亮的信号。利用生物分析仪对DNA 芯片（b)进行扩增子的定量。这表明，与标准PCR相比，当使用etPCR时，扩增产物的均匀 性显著提高。缩写=大小标记物；Pl =标准PCR ;P2 =效率标签PCR ;C =扩增后扩增子 的浓度，以pmol/1表示；R =丰度最小的靶标的比率。
【具体实施方式】
[0152] 通过下述工作实施例进一步举例说明本发明：
[0153] 实施例1
[0154] 寡核苷酸探针被设计为靶向钙蛋白酶_3基因的三个基因组位置，即外显子17、外 显子18和19以及外显子22,如图3所示。对于每个靶标区域，均合成第一寡核苷酸探针 ("反向寡核苷酸"）和第二寡核苷酸探针（"正向寡核苷酸"）。寡核苷酸探针见下文表1 中。
[0155] 反向寡核苷酸探针（对于各外显子而言，CAPN3_外显子17_反向_ET1、CAPN3_外 显子18-19_反向_ET5和CAPN3_外显子22_反向_ET1)的5'末端被磷酸化，并且包含与 原始靶序列互补的靶序列的一部分、效率标签序列（下划线）、通用反向引物退火序列和其 3'末端的6个硫代磷酸化的核苷酸类似物（由星号表示）。
[0156] 正向寡核苷酸探针（CAPN3_外显子17_正向_ET1、CAPN3_外显子18-19_正向_ ET5和CAPN3_外显子22_正向_ET1)包含其5'末端的6个硫代磷酸化的核苷酸类似物、通 用正向引物退火互补序列、效率标签互补序列（下划线）和与原始靶序列互补的靶序列的 一部分。
[0157] 表 1
[0158]
[0159] 为了使寡核苷酸探针杂交到基因组DNA，将含有200pM寡核苷酸探针的IOyl反 应液和在1倍扩增缓冲液中的1 μ g基因组DNA(Epicentre) -起在95°C下孵育5分钟，在 PCR循环仪中以每分钟1°C的斜率冷却至60°C。在60°C下杂交14小时后，加入2单位的 Stoffel 聚合酶（Applied Biosystems)、10 单位的 Ampligase(Epicentre)和最终浓度为 12 μΜ的dNTP，并在60°C下孵育2小时以上。间隙填充反应之后，将样品用核酸外切酶混合 物（核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶λ)在37°C下消化2小时。核酸外切酶在 80°C下热失活20分钟后，利用etPCR使1 μ 1所得样品进行均匀扩增。
[0160] 对于利用etPCR进行均匀扩增，使用了一组包含通用引物序列的引物寡核苷酸， 如表2所示。
[0161] 表 2
[0162]
[0163] 作为引物寡核苷酸，使用了正向引物寡核苷酸UFP1(7份）、UFP2(1份）、UFP3(1 份）、UFP4 (1份）、UFP5 (1份）的7:1:1:1:1混合物，总浓度为200nM正向引物寡核苷酸和 200nM通用反向引物寡核苷酸I(URPI) qPCR扩增是使用Power SYBR Green混合液（Applied Biosystems)和StepOnePlus热循环仪进行的，PCR程序如下：开始在95°C下变性15分钟， 然后40个扩增循环（95 °C下10秒，60 °C下15秒，72 °C下30秒）。扩增的靶标在1 %琼脂糖 凝胶上分析。
[0164] 如图4所示，琼脂糖凝胶表明本发明的方法相比于标准PCR实现了更均匀丰度的 复制，其几乎未显示外显子18和19的任何扩增。
[0165] 虽然具体的工作实施例是指仅一个末端上ETS被提供用于五个不同的引物寡核 苷酸用于聚合酶介导的延伸的方法，但是应当理解的是，ETS和一组不同的寡核苷酸可另外 用于相对的末端。如果在相对的末端同样使用了 4个核苷酸的ETS和相应的包含五个不同 引物寡核苷酸的一组，可实现25个不同效率等级的扩增。
[0166] 实施例2
[0167] 结果
[0168] 作为模型，我们选择了人类抗肌萎缩蛋白基因，这是最大的（不是外显子比较 (exon wise)，而是覆盖率比较（coverage wise))已知的由79个外显子组成的人类基因。 自从Chamberlain首次报道了多重PCR以来，抗肌萎缩蛋白基因也已被其他研宄者用作多 重PCR模型。为了建立我们的新技术，我们利用ExonPrimer设计了 78个不同的靶标，涵盖 了所有79个外显子。为了能通过凝胶电泳进行快速分析，当在凝胶上解析时，我们选择了 易于辨别的12个不同大小的靶标（图5)。所选择靶标的大小在范围为153bp至725bp之 间（图5)。
[0169] 为了证明etPCR控制PCR效率的能力，我们首先通过PCR为12个靶标中每一个生 成了包含效率标签和共同引发序列（common priming sequence)的单一模板（图5)。将凝 胶纯化的模板进行定量PCR以分析PC R效率（图6a)。我们首先利用通用引物（universe primer pair)对进行标准qPCR。因为所有模板均具有相同的引物结合位点并且在相同条 件进行qPCR，预计PCR效率的差别是由于固有模板属性例如长度、GC含量和二级结构引起 的。12个靶标的固有PCR效率范围为76%至87% (100%对应一个PCR循环中的复制）（图 6b)。我们分析了扩增长度和GC含量对PCR扩增效率的影响。正如预期的那样，我们发现 大小和PCR效率之间的相关性（图6c)。与此相反，我们发现效率和分析样本中GC含量之 间没有强相关性（图6d)。低于20%或高于80%的GC含量据报道显著影响PCR效率。在 我们的研宄中，12个模板的GC含量范围为34 %至51 %，说明在我们的研宄中PCR性能只受 轻微的影响。
[0170] 然后我们研宄了 etPCR是否能通过使用一组仅长度不同的五个通用正向引物而 影响相同模板的PCR效率。所述靶标具有不同的效率标签，如所预期的那样，与通用引物整 个组匹配的标签（TAG 5)当进行etPCR时对效率没有影响（图7a)。然而，含有效率标签 和错配子的靶标的扩增与etPCR以及正常PCR显著不同（图7b、c)。为了调查不同标签在 采用相同的定量方式时是否会影响不同靶标的PCR效率，我们计算出一个校正因子。校正 因子是相同模板的etPCR和正常PCR的效率的比值。该校正因子与标签的类型显著相关并 且与模板的内在性质无关（图7d)。因此，这允许根据具体情况调整每一个单一靶标的PCR 效率。
[0171] 我们想知道这些效率标签是否可用于调节多重反应中的扩增效率以获得均匀扩 增。设计靶向寡核苷酸并且如材料和方法中所述进行捕获反应。根据扩增子的大小选择效 率标签以校正大小依赖性扩增偏向性。使用我们的新的捕获技术，我们能从少量的基因组 DNA (200ng)中捕获靶标，并成功地通过PCR将其扩增（图8a)。利用常规PCR进行扩增，观 察到强的偏向性，正如我们之前单一模板的PCR效率测量法所预期的。小的扩增子出现次 数过高而最大的扩增子通过常规的凝胶电泳几乎检测不到。当使用etPCR时，每个特异性 靶标的这种偏向性被显著校正。扩增产物用生物分析仪2100的DNA芯片技术来定量（图 8b)。量化数据显示显著校正了扩增偏向性，并形成了类似的均匀扩增（图8d)。这表明新 的etPCR技术以均匀方式扩增多个模板的能力是基于允许以非常经济有效的方式进行序 列分析。
[0172] 讨论
[0173] 我们已经开发了效率标签PCR (etPCR)，是一种新的用于多重PCR的方法， 该方法能够由基因组DNA同时均匀地扩增多个靶标。靶标选择策略仅仅是加成反应 (addition-only reaction)，并且每个样品可以在单一管中进行，使它易于自动化。etPCR 的应用是多种多样的：基因检测的分子诊断、产前检查、癌症表征以及传染病有机体和它们 的电阻（resistances)的诊断。此外，它可应用于法医学应用，食品和饲料、环境和水的检 测中遗传修饰生物（GMO)或合成生物学的检测。
[0174] 在这项研宄中，我们着重于etPCR在遗传紊乱例如Duch