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【主权项】
1. 一种使多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，其包括以下步骤： 提供一组能使相同核苷酸序列退火的正向引物寡核苷酸，所述组包括具有5'-X-N'-3' 结构的第一正向引物寡核苷酸和具有5' -X-N1-#』'结构的第二正向引物寡核苷酸， 其中X是能使第一引物退火序列退火的核苷酸序列，N1为无或者由一个或多个核苷酸 组成，并且N2由一个或多个核苷酸组成； 提供多个不同的核酸聚合物用作模板，每个模板包括：（i)与核苷酸序列X互补的正向 引物退火序列X'，和（ii)特异性靶序列；以及 利用所述组的正向引物寡核苷酸和一个或多个反向引物寡核苷酸，通过聚合酶依赖性 扩增反应使模板扩增，其特征在于，第一正向引物寡核苷酸的3'末端核苷酸当使模板退火 时与至少两个不同的模板序列完全匹配，并且所述第二正向引物寡核苷酸的3'末端核苷酸 当使模板退火时与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配并且与所述至少两个 不同的模板序列中的至少一个完全匹配。2. 权利要求1所述的方法，其进一步包括提供一组能使相同核苷酸序列退火的反 向引物寡核苷酸的步骤，包括具有5' -Y-M1^'结构的第一反向引物寡核苷酸和具有 5' -Y-M1-M2Ij结构的第二反向引物寡核苷酸， 其中Y是能使反向引物退火序列退火的核苷酸序列，M1为无或者由一个或多个核苷酸 组成，并且M2由一个或多个核苷酸组成； 其中每个模板进一步包括与核苷酸序列Y互补的反向引物退火序列，靶序列位于正向 引物退火序列和反向引物退火序列之间，并且所述聚合酶依赖性扩增反应是利用所述组的 正向引物寡核苷酸和所述组的反向引物寡核苷酸进行的， 其特征在于，所述第一反向引物寡核苷酸的3'末端核苷酸当使模板退火时与至少两个 不同的模板序列完全匹配，并且所述第二反向引物寡核苷酸的3'末端核苷酸当使模板退火 时与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配并且与所述至少两个不同的模板序 列中的至少一个完全匹配。3. 权利要求2所述的方法，其中模板的数量为V，并且每个模板包括 5' -X-etXw-Tw-etY'w_Y' -3' 结构 其中 V是大于1的整数， w是1至V的整数，每个特定的模板分配一个单独的w值， X如权利要求1所定义，etXw是第一效率标签序列， Tw是靶序列或其互补， etY'w是第二效率标签序列的互补序列， Y'是反向引物退火序列。4. 权利要求3所述的方法，其特征在于每个效率标签序列包含2至10个核苷酸，优选 2至7个核苷酸，更优选3至5个核苷酸。5. 权利要求3或4所述的方法，其特征在于每个模板均由下述步骤提供： 提供一种单链原始核酸聚合物，其包含一个待扩增的原始靶序列； 杂交到寡核苷酸探针上的原始靶序列的5'末端，所述寡核苷酸探针序列包含与原始靶 序列5'末端互补的靶序列的一部分、引物退火序列和效率标签序列，并且与另一个寡核苷 酸探针上的原始靶序列的3'末端杂交，另一个寡核苷酸探针序列包含与原始靶序列的3' 末端互补的靶序列的一部分、引物退火互补序列和效率标签互补序列； 通过聚合酶和连接酶合成与原始靶序列互补的链以产生模板；以及 分离所产生的模板。6. 权利要求5所述的方法，其特征在于所产生的模板的末端被保护抗核酸外切酶。7. 权利要求5或6所述的方法，其特征在于所产生的模板包含游离末端、双末端区域中 的一个或多个核苷酸被修饰以形成核酸外切酶保护。8. 权利要求7所述的方法，其特征在于所述一个或多个经修饰的核苷酸是被硫代磷酸 化。9. 权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于分离所产生的模板的步骤是利用 核酸外切酶消化剩余的核酸组分而进行的。10. 核酸聚合物文库，特别是DNA或RNA文库，包含2至9中任一项所定义的多个模板。11. 一种试剂盒，用于实施权利要求1至9中任一项所述的方法，其包含 第一组寡核苷酸探针，第一组中每种寡核苷酸探针的序列包含 -与待扩增的原始靶序列5'末端互补的靶序列的一部分， -效率标签序列，以及 -引物退火序列， 第二组寡核苷酸探针，第二组中每种寡核苷酸探针的序列包含 -引物退火互补序列， -效率标签互补序列，以及 -与原始靶序列的3'末端互补的靶序列的一部分， 第一组中不同的引物寡核苷酸包含一个引物序列，其与第一组中寡核苷酸的引物退火 序列至少基本上互补并且其在引物序列下游延伸的长度上彼此不同，以及 第二组中不同的引物寡核苷酸包含一个引物序列，其与通过合成与包含引物退火互补 序列的模板互补的链而获得的另一个引物退火序列至少基本上互补，第二组中引物寡核苷 酸在引物序列下游延伸的长度上彼此不同。12. 权利要求11所述的试剂盒，还包含聚合酶和连接酶。13. 权利要求1至9中任一项所述的方法在基因探针检测特别是用于鉴别传染性有机 体或突变体基因中的用途。14. 权利要求1至9中任一项所述的方法在分子克隆中的用途。
【专利摘要】本发明涉及使多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，其包括以下步骤：提供多个不同的核酸聚合物用作模板，每个模板包含特异性靶序列和位于所述靶序列下游的引物退火序列，以及利用包含与引物退火序列至少基本上互补的引物序列的引物寡核苷酸通过聚合酶依赖性扩增反应使所述模板进行扩增。该方法的特征在于，对于聚合酶依赖性扩增反应，使用一组引物寡核苷酸，所述组包含至少两个引物寡核苷酸，其能使相同模板的引物退火序列退火并且聚合酶依赖性扩增反应的效率彼此不同。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104919056
【申请号】CN201380067456
【发明人】约亨·金特, 迈克尔·赛恩瑞驰
【申请人】巴塞尔大学医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年10月30日
【公告号】CA2888953A1, EP2728013A1, EP2914744A1, US20150267256, WO2014068020A1