一种可用于电化学实时pcr的芯片及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物芯片研究领域，特别涉及一种可用于电化学实时PCR的芯片及其制作方法。
【背景技术】
[0002]聚合酶链式反应(Polymerase Chain React1n，简称PCR)，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于病原体检测、产前诊断、肿瘤基因检测、疗效评估、食品安全检测、食品转基因检测等医疗、食品、卫生领域。
[0003]PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。而且凝胶电泳需要开盖检测，极易造成PCR产物的污染。
[0004]实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)，在PCR扩增过程中，通过添加荧光物质，对PCR进程进行实时检测，有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。荧光定量PCR仪由基本PCR部分、荧光检测部分和上位计算机部分等组成，其中荧光检测部分包括激励光源、光电倍增管、信号采集与处理等部分，因此设计复杂、机体庞大、成本较高，难以基层推广使用。
[0005]电化学芯片为PCR检测提供了一种有效方法，无需使用特定光源，不必进行光电转化倍增等步骤，因此简单易行，易于实现仪器小型化和便携化。电化学芯片研究已开展多年，但目前大部分电化学芯片都是在PCR扩增完成之后，将扩增产物加入到芯片中，根据阴阳性样本给出的不同电信号进行判断，一方面操作繁琐，不能实现实时监测，另一方面PCR产物的开盖操作大大增加了污染的可能性。因此电化学芯片虽然具备一系列优点，但尚未实现大规模使用。
[0006]电化学实时PCR近年来在文献中已有报道，Thibaut等利用在反应体系中加入杂交指示剂，实时监测PCR扩增过程中循环方波伏安曲线，在有模板存在的情况下，随着PCR扩增的进行，循环方波伏安曲线的峰值电流逐渐降低(ThibautDefgver et al.Real-TimeElectrochemical PCR with a DNA Intercalating Redox Probe.Ana1.Chem.,2011,83
(5)，pp 1815-1821)。该方法不涉及引物/探针的修饰，对反应电极的设计和加工没有特殊要求。
[0007]为了增加电化学实时PCR的特异性，可考虑通过在引物/探针上引入电化学活性官能团，实时监测PCR体系的扩增情况。但是，现有技术中还没有可进行电化学实时PCR的芯片。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种设计合理、加工精密的芯片，用于电化学实时PCR检测，并提供一种该芯片的制备方法，要求制备简单，成本低廉，可批量化生产。
[0009]本发明的技术方案如下:
[0010]一种用于电化学实时PCR的芯片，包括基底、基底正面的绝缘层，以及位于绝缘层上的三电极，所述三电极是工作电极(WE)、辅助电极(CE)和参比电极(RE)，其特征在于，所述工作电极表面覆盖有绝缘薄膜，在绝缘薄膜中排布有微阵列电极，各微阵列电极的下面连接工作电极，而侧面通过绝缘薄膜彼此隔开。
[0011]从上述芯片的表面看，微阵列电极的阵列排布可以是平行排布、交叉排布、圆形排布等;所述微阵列电极上表面的形状可以为圆形、矩形、环形、正多边形等形式。
[0012]优选的，所述微阵列电极的上表面至少有一维尺寸在I?ΙΟΟμπι范围内(对于圆形而言，所述一维尺寸即指其直径大小)；从上表面看，所述微阵列电极的一维尺寸与相邻微阵列电极的间距之比为1:1?1:20。
[0013]所述基底可以是硅、玻璃、聚合物等材料的基片，优选为硅片。
[0014]所述基底正面的绝缘层材料可以是二氧化硅(S12)、三氧化二铝(Al2O3)、二氧化锆(ZrO2)等。
[0015]三电极和微阵列电极的材料可以为金、银、铂、铬、碳等。三电极形貌可以是平面式也可以是圆柱式，所述平面式的形状可以是圆形、环形、正多边形等。
[0016]本发明芯片，可通过串联或并联方式联用，同时进行数个PCR反应，大大提高检测通量。
[0017]本发明还提供了上述用于电化学实时PCR的芯片的制作方法，包括如下步骤:
[0018]I)清洗基底并干燥，然后在基底上生长绝缘层；
[0019]2)在绝缘层上制作三电极、电极引线和引线接口，所述三电极包括工作电极(WE)、辅助电极(CE)和参比电极(RE);
[0020]3)在工作电极表面生长绝缘薄膜；
[0021]4)通过光刻工艺和腐蚀工艺将微阵列电极的掩膜版图形转移到步骤3)生长的绝缘薄膜上；
[0022]5)在工作电极上腐蚀掉绝缘薄膜的区域生成微阵列电极。
[0023]上述步骤I)基底可以是硅、玻璃、聚合物等材料的基片，优选为硅片。可以采用有机溶剂和水对基底进行超声清洗，去除基底表面的有机杂质；可以使用无机酸和双氧水的混合液加热煮沸基底，然后用去离子水冲洗，去除基底表面的无机杂质。清洗后的基底用氮气吹干，之后于真空干燥箱内烘干。
[0024]步骤I)在基底上生长的绝缘层材料和生长厚度依据绝缘性能和成本而定。绝缘层材料可选自二氧化硅(S12),三氧化二铝(Al2O3),二氧化锆(ZrO2)等;生长绝缘层的方法包括物理气相沉积法、化学气相沉积法、热氧化法等，优选热氧化法。
[0025]步骤2)通过光刻工艺和蒸镀工艺，在绝缘层上制作电极、电极引线以及引线接口。首先通过光刻工艺在绝缘层上光刻出需要的图形，光刻胶作为掩膜，可以使用正胶，也可以使用负胶;然后通过蒸镀工艺，在图形区蒸镀金属，形成电极，最后剥离掉掩膜。对于硅片，由于金属电极与二氧化硅的粘附性不好，可以先蒸镀一层钛或锆的金属缓冲层，起到粘附缓冲作用，之后将电极对应的金属蒸镀到金属缓冲层上。
[0026]电极材料可以为金、银、铂、铬、碳等，电极材料可以和电极引线以及引线接口的材料一致，也可以不同。三电极形貌可以是平面式，也可以是圆柱式，其中平面式的形状可以是圆形、环形、弧形、正多边形等，如图2所示，其中工作电极(WE)为圆形，辅助电极(CE)和参比电极(RE)为弧形，设置在圆形工作电极的外围。
[0027]步骤3)在工作电极表面生长的绝缘薄膜用以微阵列电极的绝缘。生长该绝缘薄膜的方法为化学气相沉积法，采用该方法形成的薄膜颗粒较小且厚度均匀。该绝缘薄膜的材料可选自 S12、Al2O3、ZrO2 等。
[0028]步骤4)在工作电极表面的绝缘薄膜上涂覆一层光刻胶，通过光刻工艺光刻出需要的图形，然后通过湿法腐蚀将掩膜图形转移到绝缘薄膜上，湿法腐蚀到电极截止。
[0029]步骤5)通过蒸镀或溅射工艺，在工作电极上湿法腐蚀掉绝缘薄膜的区域生成微阵列电极，微阵列中的每个微凸台都是一个微电极，成为一个独立反应单元，用于电化学实时PCR