专利名称：一种利用序列标签定量测定核酸的方法
技术领域：
本发明属于分子遗传领域，涉及一种利用序列标签定量测定核酸的方法。
背景技术：
核酸定量分析就是定量测定特定序列核酸的相对含量，基因序列差异和基因表达量 差异分析的实质就是定量测定核酸模板。
基因序列的差异主要包括单核苷酸多态性(SNP)、序列重复(copy number variation, CNV)和序列缺失，其中单核苷酸多态性是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发 生转换、颠换、插入或缺失等变化。基因序列重复和缺失指一段基因的部分序列、 一种 基因的某个外显子序列、某种基因的全部序列、甚至整个一组染色体序列的重复或缺失。 基因表达量差异检测是指比较同一基因转录产物mRNA在不同细胞、不同脏器组织、 不同生理状态下的分布状态和存在量的差异，是进行基因功能解析的重要途径。可以根 据测定结果推定未知基因的功能、解明基因间及蛋白质间的相互作用。
提高分析通量(即一次可以测定的样本数或待测靶标的数)可以减低检测成本和提 高检测效率，而提高方法的多重检测能力又是提高分析通量的重要手段。通常借助生物 分子的多元标记技术来实现多重并行检测。生物分子常用的标记技术为荧光标记。采用 不同颜色的荧光染料可以同时标记多个待测靶标分子，受荧光物质种类和荧光检测波长 范围的限制，目前至多可以同时用四种荧光探针进行标记W，而通常仅用两种荧光染料 分别标记一份内参和待测样本。为了解决高通量分析方面的不足，发展了编码技术。一 种是常用的芯片点阵编码技术(2)，即将编码探针通过微阵列固定在芯片表面，然后再进 行芯片扫描检测；第二种方法是基于混合染料光谱学特征的编码技术(3'4)，即先用两种颜 色的荧光染料按照不同的比例混合制备系列编码微球载体，并在微球表面固定不同的探 针，然后根据不同波长处检测到的荧光强度比值对待测微球进行解码；第三种方法是基 于量子点的编码方法(5'6)，即将不同粒径的量子点按不同比例包埋在聚合物中，得到不同 编码的微球，并在其表面修饰DNA探针卩'8、采用分子量不同的有机分子也可以编码不 同的核酸分子，但需要质谱技术解码，该方法不仅繁琐而且费时、费力，检测时需要通过化学反应释放出标记物才能检测。
目前缺少一种简单、方便、通量高、成本较低、且既能用于测定基因序列差异又能 用于测定基因相对表达量的方法。
参考文献
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发明内容
本发明的目的是提供一种简单、方便、通量高、成本较低、不采用荧光染料标记的 方法而采用序列标签技术建立一种可以在单管中同时检测多个基因序列差异又能测定 基因相对表达量的方法。
本发明的基本原理是首先采用含有序列标签的探针与目的耙标杂交，在酶的作用下 发生连接反应形成含有序列标签的连接产物，采用一对共用引物进行PCR扩增反应，最 后用焦测序技术测定标签序列，可以根据测序测定结果对基因序列差异和基因表达量差 异进行定量分析。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的
一种利用碱基序列标签技术定量测定核酸的方法，包括下列步骤连接反应标记待
4测核酸、扩增反应增加连接反应产物量、测序反应识别和定量连接反应产物上的序列标 签，其特征在于单管中含有一对或多对连接探针，每对连接探针与一种待测核酸存在特 异性互补序列，该对连接探针中的至少一条探针含有特异性的序列标签。
所述的方法，其中序列标签是指具有不同碱基序列的DNA片段。标记在探针上用 以识别不同待测核酸靶标。用于标记的，列标签长度相同，Tm值相同，仅碱基排列顺序 不同。
所述的方法，其中连接反应是指在连接酶的作用下与同一种待测核酸的序列发生互 补的一对相邻的连接探针发生的反应。
所述的方法，其中一对相邻的连接探针是指两条探针与同一种待测核酸分子杂交 后，其中一条连接探针的3'端和另一条连接探针的5'端紧密相邻。
所述的方法，其中连接反应是指在单管中多对相邻的连接探针同时发生的连接反应。
所述的方法，其中连接探针一端含有一段与待测核酸模板互补的序列，另一端含有 一段与待测核酸模板不互补的序列。
所述的方法，其中与待测核酸模板不互补的序列在不含有序列标签的探针中包括一 段PCR引物特异性序列，还可以包含一段内切酶特异性位点序列；与待测核酸模板不 互补的序列在含有序列标签的探针中包括一段PCR引物特异性序列和标签序列，还可 以包含一段内切酶特异性位点序列。所述内切酶是指IIS型内切酶，PCR引物是指用于 扩增与多种核酸对应的连接产物的共用引物。
所述的方法，其中测序反应是指基于生物发光反应测定引物延伸产生的焦磷酸盐的 测序技术(即焦测序反应)。
所述的方法，其中测序反应是指采用dNTP进行的测序反应，或者是采用ddNTP 进行的测序反应。
连接反应的探针浓度为0.1-5 nmol/L。
多种核酸优选2-40种核酸。
扩增反应是指加入内切酶进行恒温酶切反应并在高温失活后再进行变性、退火、延 伸的循环扩增反应。
本发明的有益效果
本发明采用碱基序列标记法代替荧光标记法，不需要激光和荧光染料，也不使用电 泳。多个不同的待测靶标在单管中同时被标记上不同的序列标签，且用于标记的序列标签长度相同，Tm值相同，仅碱基排列顺序不同。与用序列长度差异标记法相比，本法中 的探针长度一致，扩增效率相近，探针价格也低，
采用一对共用引物在单管中同时扩增多个被标记上不同碱基序列的连接产物，与传 统多重PCR技术相比，没有引物间的相互干扰，并且可以采用低浓度的连接探针(fmol 级)来降低多探针对PCR的干扰。
本发明的待测靶标定量检测法具有普遍适用性，即可以通过一次反应可以同时检测 各种基因序列的差异(SNP、 CNV等)，又可以检测多个基因的相对表达量。
本发明可以在单管中同时检测多个(理论上是无限的，实际运用中优选20-40个) 基因序列差异(含SNP、序列重复和缺失)和多个基因(理论上是无限的，实际运用中 优选10-20种)。
本发明提供的方法简单、方便、通量高、成本较低、且既能用于测定基因序列差异 又能用于测定基因相对表达量，有利于临床广泛推广使用。
图l:用序列标签法测定两种待测核酸靶标的示意图。 图2:多个待测靶标的标签序列解码原理。 图3:用序列标签法测定单碱基多态性。
图4:大肠癌组织中6个基因(Beta-actin， C-myc， CD44v6， H-ras， COX-2， RAB5A)
的相对表达量的测定结果。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例l:定量测定两种待测核酸的方法
如图1所示，本发明的测定步骤如下-
(1)采用碱基序列标记法，使得不同的靶标被标记上不同的序列 首先根据待测模板A和B的基因序列1和2，分别设计一对探针3， 4 (对应于靶标 1)和一对探针5， 6 (对应于靶标2)。每条探针由两部分组成， 一部分与模板互补，另 一部分含有与模板不互补的序列。在每对探针中有一条探针的5'端与另一条的3'端紧密 相连，当有模板存在时，在连接酶7的作用下发生连接反应；探针3和5中的X为不与 模板互补序列，与后续PCR反应的引物相同；探针4和6中与模板不互补的序列由三 部分组成，序列Y(如图所示)，序列B和IIS酶切位点序列，其中序列Y与后续PCR 反应的引物互补，序列B为序列标签，不同的靶标含有不同的序列B，为了保持PCR扩增反应的效率，可将序列B分别设计成碱基序列排列不同，但碱基的种类和数目相同。 序列B与待测模板的性质相关，分别用序列Bl和B2标记靶标A和靶标B。 IIS酶切位 点序列用于消除PCR模板的污染。(每对探针的设计参照此方法进行，每对探针与一种 待测核酸存在特异性互补序列，该对探针中的至少一条探针含有特异性的序列标签。在 存在多个序列标签时，各序列标签互不相同)。连接反应完成后，用一对通用引物8和9 (引物8的5'端用biotin修饰，用于制备单链DNA模板)进行PCR扩增反应。PCR产 物的序列Tm值也可以根据具体情况适当调整。
(2)基于焦磷酸盐实时生物发光测序技术对扩增产物进行碱基序列解码 通过上述方法在单管中用一对引物同时扩增多个基因靶标，并且每种靶标都标记有 不同的碱基序列B，如何将这些扩增产物进行解码是个关键。本发明采用焦磷酸盐实时 生物发光测定技术对扩增产物进行碱基序列解码，即先用链亲和素修饰的微球制备单链 DNA 11和12，再加入测序引物13与之退火，引物13可以与序列B中的部分序列对应， 即采用引物13的序列和引物13的延伸序列共同对待测耙标的标签序列进行解码。测序 时分别依次加入不同的dNTP进行焦测序反应，得到图中相对于靶标A和B的图谱，其 峰高即为两待测靶标的相对含量。
通过设计不同的探针可以实现基因序列差异和基因表达量的测定。具体方法如下 SNP (单碱基多态性)测定SNP通常有两种等位基因(分别来自于父方和母方)， 每种类型对应于一种模板，即两种模板(待测靶标)只有一个碱基序列不同，可以将这 两种模板分别对应于图1中的Target A和Target B。若将图1中探针中的序列B用于标 记等位基因的类型，若待测模板为纯合子，则只有一个峰出现，若为杂合子时，出现强 度相等的两个峰。也可以将序列B中设计一段用于标记基因组上不同位置SNP位点的 标签序列，以实现多个SNP位点的同时标记。
CNV(拷贝数变化)测定测定基因拷贝数变化时，必须以一段序列为参照基准(即 没有拷贝数的变化)来测定未知模板的实际拷贝数。可以将图r中的Target A作为参照， TargetB为待测靶标。若将图1中探针上的序列Bl和B2用于标记基因组上不同的待测 靶标，测定结果中两峰的相对高度即为两待测基因片段拷贝数的变化情况。
基因表达量测定当测定多个基因在某一组织中的表达量时，必须一种看家基因为 参照基准，该类基因在各种组织中的表达量基本不变，可以看作恒定量。测定时，可以 将图1中的TargetA作为参照(看家基因)，TargetB为靶标(待测基因)。若将图1中 探针上的序列Bl和B2用于标记基因种类，测定结果中两峰的相对高度即为标记基因的相对表达量(即模板量)。
实施例2:对多个待测耙标的序列标签同时进行解码的方法
方法原理采用不同颜色的染料对不同的待测靶标进行标记时，受染料种类和波长 范围的限制，不能同时标记4个以上的靶标，本发明通过序列标签可以达到同时标记10
个以上的靶标。如图2所示，以6个不同靶标的同时测得为例，用三个碱基序列标记6
种不同的靶标，在测序图谱中， 一种靶标与一个序列峰相对应。由于测定序列会逐步延
伸，必须使用隔离碱基，否则四种不同的碱基只能标记三种靶标，如CA、 GA禾BTA。 我们将四种碱基中的两种用于标记(C和G)，另外两种(A和T)用于隔离，这样实现 了多个靶标的同时测定。
在图2中，用CAT， GAT， TCT， TGT， TAC， TAG分别标记六种耙标，当加入 dCTP时，只有与靶标1对应的标签序列出峰(图2中左边五角星)；同样加入dGTP时， 只有与靶标2对应的标签序列出峰(图2中左边十字星)；然后加入dTTP (隔离用)， 除靶标1和2外，其余四种耙标均发生了延伸，图2中可以明显看出T的峰；再加入加 入dCTP时，只有与靶标3对应的标签序列出峰(图2中中间五角星)；同样加入dGTP 时，只有与靶标4对应的标签序列出峰(图2中中间十字星)；然后加入dATP(隔离用)， 除靶标3和4外，其余四种靶标均发生了延伸，图2中可以明显看出A的峰；再加入加 入dCTP时，只有与靶标5对应的标签序列出峰(图2中右边五角星)；同样加入dGTP 时,只有与靶标6对应的标签序列出峰(图2中右边十字星)。这样，通过一次焦测序 就实现了多个靶标的同时测定。
以此类推，采用6个碱基的序列就可以标记12种不同的靶标。理论上可以测定无 限多个。
实施例3:与糖尿病相关的多重单碱基多态性的测定 1.实验材料
试剂基因组DNA，由病人血样中提取；Ampligase (EPICENTRE); Taq DNA聚 合酶(TaKaRaBiotechnology Co.， Ltd); dNTPs(Promega， Madison, USA);引物LDR-Pl: 5，-cat ctgttc cct ccc tgt c-3'; LDR-P2: 5，-biotin-ccc cac ttc ttg ttc tct cat-3' (Invitrogen Inc., Shanghai, PAGE级)；琼脂糖(OXOID Ltd., Hampshire, England);凝胶电泳加样液 和溴化乙锭(EB)均为Sangong生物公司产品。Dynabeads M-280-streptavidin (Dynal AS,Oslo,Norway), lxB&W缓冲液(10mmol/LTris-HCl， 1 mmol/LEDTA， 1.0mol/LNaCl， pH7.5 )， 0.1 mol/L NaOH， lx退火缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA ， pH8.0)， lmol/LHC1.
仪器洁净工作台(VD-650-U型，苏州安泰空际技术有限公司)；离心机(PMC-860 型，CAPSULEFUGE公司)；PCR扩增仪(PTC-225型，MJ Research公司)；高压电源 电泳仪(Power PAC1000， BIO-RAD，美国)；电泳槽(实验室组装)；凝胶电泳成像 仪(ChemilmagerTm型，AIpaHa Innoteach公司，美国)。焦测序仪(实验室组装)。
2. 实验步骤
连接反应lOnl反应体系中含有基因组DNA模板(四种与糖尿病相关的SNP位点， 分别是PPAR基因的C1431T位点，PPAR基因的C2821T位点，PPARG基因的Pro 12Ala 位点，SUR1基因的Argl273Arg位点，每个位点有三个典型基因型DNA模板) (100~500ng)，探针混合物(探针分别与这12个待测核酸模板对应，共4*3=12对，每种 50 fmol ，制备方法参见实施例1), Ampligase 1U， 20mM Tris-HCl (pH8.3) ， 25 mM KC1, 10mM MgC12,0.5mMNAD, 0.01% Triton X-IOO。反应条件为98°C预变性5min;然后 95。C变性lmin,60'C退火、连接4min ,进行10个循环。
聚合酶链反应25pl反应体系中含有引物(200nM)， Tris-HCl (pH8.3) (10mM), KCl (50mM)， MgC12 (1.5mM)， dNTPs (0.2mM), rTaq酶(0.75U)。反应条件为 95'C预变性5min;然后以95'C30s、 60°C lmin，进行35个循环。
焦测序首先制备单链，第一步，取1/10PCR体积的磁性微球，用磁铁吸弃上清， 用B&W缓冲液洗涤2次，悬浮于适量B&W缓冲液中；将PCR产物与磁性微球混合， 置37'C中振摇lh;吸弃上清，水洗涤2次，加入20nL的0.1mol/L的NaOH混匀，放置 5min;吸弃上清，再用0.1 mol/LNaOH洗涤一次后用B&W缓冲液洗涤2次；加入lOpL 的lx退火缓冲液和lOpmol的退火引物，95'C预退火30s，然后55'C退火3min。在测 序模板中加入测序反应液，依次加入dGTP、 dCTP禾f] dTTP进行测序反应。
3. 实验结果
在一管中同时测定了四种与糖尿病相关的SNP位点，图3是测定三个典型基因组 DNA样本的部分结果，即PPAR基因的C1431T位点的测定结果。当测定图谱中只有代 表野生型的峰出现时，表明待测样本PPAR基因的C1431T为野生型；当测定图谱中除 有代表野生型的峰外，还有代表突变型的峰出现，表明待测样本PPAR基因的C1431T 位点为杂合子；当测定图谱中只有代表突变型的峰时，表明待测样本PPAR基因的
9C1431T为突变型。
实施例4:序列标签法用于基因表达量差异的测定
本实施例采用本发明的序列标签法考察大肠癌组织中5个基因(C-myc, CD44v6， H-ras, COX-2, RAB5A)的表达情况，以看家基因beta-actin为参照。连接探针中的序 列标签如图2中所示。
首先，将测定6个基因的连接探针的5'端用磷酸化酶(T4 polynucleotide kinase) 磷酸化(37度30 min),然后在70度的水浴中10 min灭活。加入混合探针(6对)(5fino1 每种)进行连接反应。用连接后的模板(模板稀释10倍)做PCR扩增，将扩增产物(制 备单链，进行焦测序，结果如图4所示，各基因的相对检测结果在图1中以方框标出， 每一个方框有两个峰，第二个峰为dNTP的背景信号，实际测定结果必须扣除该背景。 结果表明六种肿瘤相关基因在大肠癌中均有表达，COX-2基因的表达量最高，但所有基 因的表达量均比看家基因低。<110>周国华
〈120〉 一种利用序列标签定量测定核酸的方法 <歸2
<210〉 1 〈211〉 19 〈212>画 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223>上游引物 <400> 1
catctgttcc ctccctgtc 19
<210〉 2 <211> 21 <212〉 DNA <213>人工序列 〈220〉
<223〉下游引物 <400> 2
ccccacttct tgttctctca t 2权利要求
1. 一种利用序列标签技术定量测定核酸的方法，包括下列步骤连接反应标记待测核酸、扩增反应增加连接反应产物量、测序反应识别和定量连接反应产物上的序列标签，其特征在于单管中含有一对或多对连接探针，每对连接探针与一种待测核酸存在特异性互补序列，该对连接探针中的至少一条探针含有特异性的序列标签。
2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于序列标签是指具有不同碱基序列的DNA 片段。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于连接反应是指在连接酶的作用下与同 一种待测核酸的序列发生互补的一对相邻的连接探针发生的反应。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于一对相邻的连接探针是指两条探针与同 一种待测核酸分子杂交后，其中一条连接探针的3'端和另一条连接探针的5'端紧密相 邻。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于连接反应是指在单管中多对相邻的连接 探针同时发生的连接反应。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于连接探针一端含有一段与待测核酸模板 互补的序列，另一端含有一段与待测核酸模板不互补的序列。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于与待测核酸模板不互补的序列在不含 有序列标签的探针中包括一段PCR引物特异性序列，还可以包含一段内切酶特异性位 点序列；与待测核酸模板不互补的序列在含有序列标签的探针中包括一段PCR引物特 异性序列和标签序列，还可以包含一段内切酶特异性位点序列。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于内切酶是指IIS型内切酶；PCR引物是 指用于扩增与多种核酸对应的连接产物的共用引物。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于测序反应是指基于生物发光反应测定引 物延伸产生的焦磷酸盐的测序技术。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于测序反应是指采用dNTP进行的测序 反应，或者是采用ddNTP进行的测序反应。
全文摘要
本发明属于分子遗传学领域，公开了一种利用序列标签定量测定核酸的方法，包括下列步骤连接反应标记待测核酸、扩增反应增加连接反应产物量、测序反应识别和定量连接反应产物上的序列标签，其特征在于单管中含有一对或多对连接探针，每对连接探针与一种待测核酸存在特异性互补序列，该对连接探针中的至少一条探针含有特异性的序列标签。本发明不经过荧光染料的标记而直接采用碱基序列标记法就可以实现多个核酸的定量测定，方法简单、方便、通量高、成本较低、既能用于测定基因序列差异又能用于测定基因相对表达量，有利于临床广泛推广使用。
文档编号C12Q1/68GK101519698SQ200910126690
公开日2009年9月2日 申请日期2009年3月9日 优先权日2008年3月10日
发明者周国华 申请人:周国华