高危型人乳头状瘤病毒检测方法及其采用的寡核苷酸序列和寡核苷酸探针的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高危型人乳头状瘤病毒检测方法及其采用的寡核苷酸序列和寡核苷酸探针。
【背景技术】
[0002]人乳头状瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，具有高度的特异性，属于双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。迄今为止，已发现的HPV有100多个型别，各型别与体内特定感染部位和病变有关，其中有40多个型别与人类生殖道疾病有关。HPV感染主要是通过性生活传播，感染后通常没有明显的临床症状，感染的高峰年龄在18?28岁。然而大部分妇女的HPV感染为一过性，经2?3年内一般可自行消失，大约只有10%?15%的35岁以上的妇女有持续感染的情况，HPV持续感染将有患宫颈癌的风险。
[0003]在临床上，根据HPV亚型致病力大小或致癌危险性大小不同，将HPV分为低危型和高危型两大类。低危型主要导致尖锐湿疣和低度宫颈上皮内瘤变CIN IjnHPV6、HPVll、HPV30、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44亚型。高危型除可引起生殖器疣病外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌和CIN Π、CIN ΙΠ，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、即￥52、即￥53、即￥56、!^￥58、!^￥66等。有报道称99.8%的子宫颈癌活检标本中可以检测到HPV-DNA，其中，HPV16和HPV18型致病率最强，约占709LHPV16型感染多见于宫颈鳞癌，而HPV18型感染多见于宫颈腺癌。在妇女的一生中，可反复感染HPV，也可同时感染多种不同型别的HPV。随着年龄的增长，宫颈HPV的感染率明显下降，这可能与机体免疫功能增强以及对病毒的限制或清除有关。
[0004]HPV检测已成为宫颈癌的常用筛查方法，通过HPV的筛查可发现宫颈癌的早期患者，或者具有患宫颈癌的高危人群，有利于宫颈癌的早期发现和早期治疗，对于宫颈癌的预防及治疗，以及降低宫颈癌的发病率和死亡率具有非常重要的意义。
[0005]目前已存在的HPV检测方法主要有细胞学检查(主要包括薄层液基制片技术、巴氏涂片法等)、核酸杂交技术(如荧光原位杂交法、斑点杂交法、s ou then杂交法等)、PCR技术(如实时焚光定量PCR等)、HPV-DNA分型检测、杂交捕获二代、基因芯片技术和SP法。而目前临床上常用的检测方法主要是HPV分型检测、杂交捕获二代(HCn)以及实时荧光定量PCR。然而这些方法都存在一定的不足，比如，HPV分型检测操作较为繁琐；而HC Π虽然特异性和灵敏性均较好，也已广泛认可，但是试剂较昂贵，成本较高，而且发光信号不稳定;而PCR技术也存在标本易污染、假阳性率高等问题。因此，探索一种操作简便、特异性强、灵敏度高、成本低并且适合临床大规模筛查的新方法就显得很有意义。
[0006]随着生命科学的不断发展，近年来的研究也越来越关注纳米技术在生物技术方面的应用，目前纳米生物技术已成为国际生物领域最前沿的研究热点。虽然我国在这方面已取得了一些成果，但由于研究时间较短，今后还要在纳米医用材料、纳米农药、纳米生物传感器等方面进行深入研究，这些纳米技术主要应用的就是纳米粒子。近年来，四种类型的纳米粒子已经得到了广泛的研究和应用:(I)纳米金颗粒；(2)量子点；(3)核壳型荧光纳米颗粒;(4)高分子纳米微球。其中以金纳米颗粒、量子点、核壳型荧光纳米颗粒为代表的纳米粒子在生物芯片、免疫检测分析、基因突变检测、遗传病和肿瘤诊断、药物研究、食品及环境中的检测等领域发挥着重要作用，这方面的研究进展和研究成果引人注目，尤其是新型发光纳米材料--量子点。
[0007]半导体量子点，简称量子点(QuantumDots，QDs)，是一种在空间三维尺度均属于纳米尺度的零维材料，由于尺寸达到了临界值，结构和性质转变为微观层次而表现出量子特性。半导体量子点通常是由两种或两种以上的ι-νπ、π-νι族或m-v族元素组成，而目前较成熟的量子点是由π-VI或m-V族元素组成，如CdSe、CdS、ZnS等。量子点的研究粒径范围一般在2?20nm，与传统的有机荧光染料相比，量子点主要具备以下优点:①可以较易地通过控制反应的时间来制得不同发射波长的量子点；②量子点光稳定性更高，不易发生光漂白现象，且较易地对其进行表面修饰和连接，而不易发生荧光猝灭;③量子点的生物相容性更好，且对生物体危害小;④量子点可以用小于其发射波长1nm的任意波长的激发光进行激发，从而可以同时标记检测多种物质。鉴于量子点的上述优点，将其运用到生命科学领域吸引了很多科学家的关注，因此对量子点的合成制备、修饰以及在各个领域的应用研究都取得了突破性进展。目前已报道的应用领域有:量子点在生物分子标记方面的应用(如乳腺癌细胞、抗体和DNA等);量子点在生物成像方面的应用(如肝癌细胞、巨噬细胞、Hela细胞的标记成像、胚胎干细胞、淋巴管等的成像);量子点在生物检测方面的应用(如癌胚抗原、免疫球蛋白、大肠杆菌、蛋白质、DNA等)。
[0008]磁性纳米粒子是一种具有磁导向性、低毒性、生物相容性好等特性的纳米级材料。由于磁性纳米材料的优良特性，在磁性材料的制备和应用上也做了较多的研究，尤其是在应用方面，受到了广大研究者的普遍关注。已报道的磁性纳米粒子在生物领域的应用主要有:细胞分离和免疫分析、医学检测和诊断、药物载体等，但今后的重点仍然是将磁性纳米材料用于医学方面的检测治疗，尤其是对各种肿瘤的诊疗。基于20世纪70年代提出的“基因治疗”的概念，对在基因水平上用磁性纳米材料治疗肿瘤的研究也将不断得到发展。
【发明内容】
[0009]本发明的目的之一在于解决上述问题，提供一种操作简便、特异性强、灵敏度高、成本低、适合临床大规模筛查的高危型人乳头状瘤病毒检测方法。
[0010]本发明的目的之二在于提供一种上述检测方法采用的寡核苷酸序列。
[0011 ]本发明的目的之三在于提供一种上述检测方法采用的寡核苷酸探针。
[0012]实现本发明上述目的之一的技术方案是:一种高危型人乳头状瘤病毒检测方法，具有以下步骤:
Si:设计并合成特异性寡核苷酸序列；
所述特异性寡核苷酸序列为下述Seql和Seq3、或者为下述Seq2和Seq4;
Seql:5 ’-CATCTGCAAAAAAATA-B1tin-3 ’；
Seq2:5 ’-TCAACATCCCAAAA-B1tin-3 ’；
Seq3: 5 ’-NH2-GTCACTAGGCCGCCA-B1tin-3 ’ ；
Seq4: 5 ’-NH2-AAAACTTTTCCTTTA-B1tin-3 ’ ； 上述Seql和Seq2为捕获DNA序列;上述Seq3和Seq4为显示DNA序列；
52:分别制备CdTe量子点、硅纳米粒子以及磁性纳米粒子；
53:将步骤SI中的显示DNA序列分别与CdTe量子点和硅纳米粒子结合得到显示探针;将步骤SI中的捕获DNA序列与磁性纳米粒子结合得到捕获探针;将待测样品先后与捕获探针以及显示探针混合，根据混合液的荧光强度判断待测样品中是否含有高危型人乳头状瘤病毒。
[0013]上述步骤S2中所述的CdTe量子点为亲和素化的CdTe量子点。
[0014]上述步骤S2中所述的CdTe量子点的平均粒径为3?5nm。
[0015]上述步骤S2中所述的娃纳米粒子为戊二醛交联的氨基化娃纳米粒子。
[0016]上述步骤S3中所述的娃纳米粒子的平均粒径为90?110nm。
[0017]上述步骤S2中所述的磁性纳米粒子为亲和素化的氨基化Fe304磁性纳米粒子。
[0018]上述步骤S2中所述的磁性纳米粒子的平均粒径为45?50nm。
[0019]上述步骤S3中显示DNA序列的生物素化端与CdTe量子点结合，氨基化端通过戊二醛交联剂与娃纳米粒子结合。
[0020]上述步骤S3中娃纳米粒子的浓度为0.lmg/mL?0.]^/1111^，优选111^/1111^?1011^/1111^，更优选4mg/mL。
[OO21 ] 上述步骤S3中捕获探针的浓度为1yg/mL?1mg/mL，优选0.lmg/mL?lmg/mL，更优选 0.5mg/mL0
[0022]实现本发明上述目