嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及可用于借助于反义效应修饰靶基因的表达的嵌合单链多核苷酸和双 链反义试剂。嵌合单链反义多核苷酸包括中心核苷酸区域，所述中心核苷酸区域的侧翼为 第一 5'-侧翼区域和第一 3'-侧翼区域的修饰的核苷酸，第一 5'-侧翼区域和第一 3'-侧 翼区域它们自身的侧翼为第二5' -侧翼区域和/或第二3' -侧翼区域的核苷酸，所述第二 5' _侧翼区域和/或第二3' -侧翼区域的核苷酸对蛋白质具有低亲和力和/或比天然的 DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送嵌合多核苷酸时，在细胞内消 失。双链反义试剂包括嵌合单链多核苷酸。双链反义试剂还包括互补链。嵌合单链多核苷 酸和双链反义试剂可用于修饰细胞内的RNA转录水平或蛋白质水平。
【背景技术】
[0002] 近年来，寡核苷酸已经成为称为核酸药物的药物产品的持续研发中感兴趣的对 象，且具体地，从靶基因的高选择性和低毒性的观点来看，利用反义方法的核酸药物的研发 正在积极地进行中。反义方法包括通过向细胞内引入与靶基因的mRNA(有义链）的部分序 列互补的寡核苷酸（反义寡核苷酸（AS0))，选择性地修饰或抑制由靶基因编码的蛋白质的 表达的方法。类似地，反义方法还革G向miRNA并起作用以修饰这样的miRNA的活性。
[0003] 如图1所示（上部），当将包括RNA的寡核苷酸作为AS0引入细胞时，AS0结合到 靶基因的转录产物（mRNA)，且形成部分双链。众所周知，这种双链起遮蔽物的作用，以预防 被核糖体翻译，并因此抑制由靶基因编码的蛋白质的表达。
[0004] 另一方面，当将包括DNA的寡核苷酸作为AS0引入细胞时，形成部分DNA-RNA异源 双链体。因为RNA酶H识别这种结构，且从而分解靶基因的mRNA，抑制由靶基因编码的蛋白 质的表达（图1，下部）。在很多情况下，与利用RNAAS0的情况相比，当DNA被用作AS0时 (RNA酶H-依赖的途径）时，基因表达抑制效应更高。
[0005] 当利用寡核苷酸作为核酸药物时，研发出了多种核酸类似物诸如锁核酸（Locked NucleicAcid，LNA)(注册商标）、其他桥接的核酸（BNA)等等，以增强对靶RNA的结合亲和 力和体内稳定性。
[0006] 如图2所示，由于天然核酸（RNA或DNA)的糖部分具有四个碳原子和一个氧原子 的五元环，糖部分具有两种构象，N-型和S-型。众所周知，这些构象从一个构象转向另一个 构象，并且从而，核酸的螺旋结构也采取不同的形式，A-型和B-型。由于充当前述AS0的 靶的mRNA采取A-型的螺旋结构，糖部分主要地为N-型，因此从增加对RNA的亲和力的观 点来看，AS0的糖部分采取N-型是非常重要的。在这种理念下研发的产品为修饰的核酸诸 如LNA(2' _0,4' -C亚甲基-桥接的核酸（2'，4' -BNA))。例如，在LNA中，由于通过亚甲 基基团桥接2' -位置的氧和4' -位置的碳，构象被固定为N-型，且在构象之间不再存在波 动。因此，与利用传统的天然核酸合成的寡核苷酸相比，通过并入若干单元的LNA合成的寡 核苷酸具有非常高的对RNA的亲和力和非常高的序列特异性，并且还表现出极好的耐热性 和核酸酶耐受性（参见专利文献1)。由于其他人工核酸也具有这样的特性，已经将很多注 意力放在了与反义方法的利用等等相关的人工核酸上（参见专利文献1至9)。
[0007] 尽管如此，即使利用这些高性能修饰的核酸的反义寡核苷酸的设计物，仍然缺少 用作治疗剂的合适的效率、效力和/或安全性。
[0008] 众所周知，AS0的长度显著地影响AS0的性能，但是具有两种形成鲜明对比的结果 (非专利文献5-7)。更长的探针长度（例如，16-22个核苷酸）提供了对靶向的RNA序列的 更高的结合强度（更高的Tm)和更大的特异性。更大的序列特异性通常导致较少的副作用 且很少或没有毒性。然而，更长的探针的效力低。为了补偿这样低的活性，需要大的剂量。
[0009] 相反，较短的探针长度（例如，12-15个核苷酸）最有效-这个长度范围通常提供 了基因表达水平的最高的阻抑或抑制程度。然而，较短的探针具有较低的序列特异性并因 此通常引起毒性副作用。
[0010] 因此，对提供较短的AS0的效率和效力但是同时具有较长的AS0的安全性的多核 苷酸存在需求。
[0011] 此外，当将反义寡核苷酸用作药物时，可以以高特异性和高效率将相关的寡核苷 酸递送至靶位点是重要的。用于递送寡核苷酸的方法包括利用脂质诸如胆固醇和维生素 E(非-专利文献1和2)、利用受体-特异性的肽诸如RVG-9R(非专利文献3)、或利用靶位 点特异性的抗体（非专利文献4)。
[0012] 引用列表
[0013] 专利文献
[0014] {PTL 1}JP 10-304889A
[0015] {PTL 2}WO 2005/021570
[0016] {PTL 3}JP 10-195098A
[0017] {PTL 4}JP 2002-521310ff
[0018] {PTL 5}W0 2007/143315
[0019] {PTL 6}WO 2008/043753
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[0021] {PTL 8}WO 2003/011887
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[0023] 非专利文献
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[0026] {NPL3}KazutakaNishina等人，MolecularTherapy,Vol. 16, 734-740 (2008)
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[0030] {NPL7}JanStenvang等人，Silence,Vol. 3: 1，17 页（2012)
【发明内容】
[0031] 提供了新的嵌合反义多核苷酸和双链反义试剂，尽管具有增加的长度，但是其保 留较短的多核苷酸（~13个碱基）的效率和效力。新的嵌合反义寡核苷酸包括短的缺口体 (gapmer)反义寡核苷酸，在缺口体的5'末端、3'末端，或两个末端向该短的缺口体反义寡 核苷酸添加另外的核苷酸。另外的核苷酸对蛋白质结合显示低的亲和力。另外，另外的核苷 酸比天然的DNA或RNA核苷酸具有更高的DNA酶或RNA酶耐受性，且当递送嵌合反义多核苷 酸时，在细胞内消失。双链反义试剂包括嵌合反义多核苷酸。因此，例如，根据本文的公开内 容，可以将13个碱基的缺口体重新设计为20个碱基的缺口体，该缺口体在一个或两个末端 添加有侧翼区域，所述侧翼区域包括这样的核苷酸：对蛋白质和蛋白质样（protein-like) 细胞组分显示低的结合亲和力、比天然的DNA或RNA核苷酸具有更高的DNA酶/RNA酶耐受 性和/或当递送嵌合反义多核苷酸时在细胞内消失。嵌合反义链的缺口体部分，即，中心区 域、第一 5' -侧翼区域和第一 3' -侧翼区域可以是在标题为"ChimericDouble-Stranded NucleicAcid"的PCT/JP2012/083180中描述的反义链中的任何一个，其全部内容通过引用 并入本文。
[0032] 本发明的发明人已经确定了，当引入细胞时，新的嵌合单链多核苷酸和双链反义 试剂能够改变转录产物的活性或功能。转录产物可以是编码蛋白质的转录产物或非编码蛋 白质的产物如miRNA。本申请还构思了用于借助于反义效应更改细胞内的蛋白质的表达水 平，以及改变蛋白质结构的方法。
[0033] 嵌合反义多核苷酸和双链反义试剂还可用于治疗患者，所述患者具有特征在于改 变的基因表达水平使得例如蛋白质过表达的状况。通过利用包含嵌合反义多核苷酸或双链 反义试剂的药物组合物治疗患者，可以特异性地将基因表达水平阻抑或抑制到蛋白质水平 减少，从而改善状况的程度。
[0034] 在某些实施方式中，提供以下内容。
[0035] (1) -种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：
[0036] 包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
[0037] 连接到所述中心核苷酸区域的5'末端的第一 5' -侧翼区域，所述第一 5' -侧翼 区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
[0038] 连接到所述中心核苷酸区域的3'末端的第一 3' -侧翼区域，所述第一 3' -侧翼 区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和
[0039]第二5'-侧翼区域和/或第二3'-侧翼区域，其中：
[0040] 所述第二5' -侧翼区域连接到所述第一 5' -侧翼区域的5'末端且包括至少1个 低蛋白质-亲和力核苷酸；且
[0041] 所述第二3' -侧翼区域连接到所述第一 3' -侧翼区域的3'末端且包括至少1个 低蛋白质-亲和力核苷酸；
[0042] 其中核苷酸、核苷酸类似物和低蛋白质-亲和力核苷酸的总数不超过100个核苷 酸。
[0043] (2) -种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：
[0044] 包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
[0045] 连接到所述中心核苷酸区域的5'末端的第一 5' -侧翼区域，所述第一 5' -侧翼 区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
[0046] 连接到所述中心核苷酸区域的3'末端的第一 3' -侧翼区域，所述第一 3' -侧翼 区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和
[0047] 第二5' -侧翼区域和/或第二3' -侧翼区域，其中：
[0048] 所述第二5' -侧翼区域连接到所述第一 5' -侧翼区域的5'末端，比天然的DNA 或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所述嵌合多核苷酸时，在细胞内消 失；且
[0049] 所述第二3' -侧翼区域连接到所述第一 3' -侧翼区域的3'末端，比天然的DNA 或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所述嵌合多核苷酸时，在细胞内消 失；
[0050] 其中核苷酸和核苷酸类似物的总数不超过100个核苷酸。
[0051] (3)根据项目（1或2)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括这 样的核苷酸：当与RNA多核苷酸杂交时，所述中心核苷酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA 酶H识别。
[0052] (4)根据项目（3)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域的核苷酸 独立地选自DNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸。
[0053] (5)根据项目（4)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括5-20 个DNA核苷酸。
[0054] (6)根据项目（4)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括5-12 个DNA核苷酸。
[0055] (7)根据项目（1或2)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括独 立地选自RNA核苷酸和核苷酸类似物的核苷酸。
[0056] (8)根据项目（7)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述核苷酸类似物独立地选自 LNA核苷酸、BNA核苷酸、2' -0-MeRNA核苷酸、2' -0-甲氧乙基RNA核苷酸。
[0057] (9)根据项目（8)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括独立 地选自2' -0-MeRNA核苷酸和2' -0-甲氧乙基RNA核苷酸的核苷酸。
[0058] (10)根据项目（1-9)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区 域中的核苷酸的至少一个被硫代磷酸酯化。
[0059] (11)根据项目（10)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域中的所 有核苷酸都被硫代磷酸酯化。
[0060] (12)根据项目（1-11)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述第一侧翼区 域中的核苷酸是桥接的核苷酸。
[0061] (13)根据项目（1-12)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述桥接的核苷 酸独立地选自LNA、cEtBNA、酰胺BNA(amideBNA)和cMOEBNA。
[0062] (14)根据项目（1-13)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸 区域和所述第一侧翼区域中的核苷酸类似物中的至少一个被硫代磷酸酯化。
[0063] (15)根据项目（1-14)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述低蛋白质-亲 和力核苷酸独立地选自2' -0-甲基RNA核苷酸、2' -0-甲氧乙基RNA核苷酸、LNA、cMOE BNA、2_氟RNA核苷酸、硼烧磷酸酯核苷酸（boranophosphatenucleotides)、甲基磷酸酯核 苷酸、亚磷酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶、UNA和5-丙炔基尿嘧啶。
[0064] (16)根据项目（1-15)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多 核苷酸包括第二5' -侧翼区域。
[0065] (17)根据项目（1-15)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多 核苷酸包括第二3' -侧翼区域。
[0066] (18)根据项目（1-15)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多 核苷酸包括第二5' -侧翼区域和第二3' -侧翼区域。
[0067] (19)根据项目（1-18)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多 核苷酸还包括连接到所述嵌合反义多核苷酸的3' -末端和/或5' -末端的功能部分。
[0068] (20)根据项目（19)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分具有选自标记 功能、纯化功能和祀向递送功能的功能。
[0069] (21)根据项目（19)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分经由可切割的 接头部分连接到所述嵌合反义多核苷酸。
[0070] (22)根据项目（19)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分是选自脂质、肽 和蛋白质的分子。
[0071] (23)根据项目（22)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述脂质选自胆固醇、脂肪 酸、脂溶性维生素、糖脂和甘油酯。
[0072] (24)根据项目（22)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述脂质选自胆固醇、生育酚 和生育三烯酚。
[0073] (25)根据项目（22)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述肽选自受体配体片段和 抗体片段。
[0074] (26)根据项目（22)所述的嵌合反义