与疾病相关的基因用途的制作方法

专利名称：与疾病相关的基因用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及与疾病相关的基因的用途。更详细地涉及针对与疾病相关的基因的、用作诊断支气管哮喘和慢性阻塞性肺部疾病等标记物的反义核苷酸，针对该与疾病相关的基因产物的抗体以及用于筛选该与疾病相关的基因产物药物的方法等。
背景技术：
支气管哮喘是呼吸道的慢性炎症，表明呼吸道狭窄，症状表现为发作性呼吸困难，哮喘，咳嗽。其起始症状和病情的进展与呼吸道的上皮细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等多种细胞有关。支气管哮喘最重要的特征之一是呼吸道对刺激反应敏感(过敏性呼吸道)。这种过敏性被认为是主要与浸润呼吸道内的嗜酸性粒细胞等分泌的化学传递物质导致呼吸道上皮剥离而引起的呼吸道炎症，但是更倾向于这种炎症与复杂的遗传因素及环境因素有关。
若从外界来的刺激(过敏原，排除物)和病毒等引起的呼吸道炎症，则在呼吸道上皮细胞和支气管周边的毛细血管内皮细胞上将有粘着分子进行表达，如VCAM-1和ICAM-1等[(J.Allergy Clin.Immunol.)，第96卷，第941项(1995)]，并产生细胞因子和化学游走物质。支气管哮喘的患者其Th2型辅助T细胞的机能产生亢进，其中Th2型细胞因子包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF等，和趋化因子包括eotaxin、RANTES等增加。IL-4和IL-13对IgE具有诱导作用，同时IL-3和IL-4对肥大细胞的增殖具有诱导作用。IL-5、GM-CSF等可使嗜酸性粒细胞增殖分化，eotaxin、RANTES可使呼吸道发生浸润现象[(Allergy Asthma Proc.)，第20卷，第141项(1999)]。
覆盖在气管或支气管上的黏膜上皮细胞不仅具有屏障作用以及排除分泌物或异物的作用外，而且还能控制由于上皮分泌的平滑肌迟缓因子对气管的收缩作用，所述屏障作用是指为了防止从外界来的刺激直接传递到黏膜下部的组织内。浸润到支气管哮喘患者呼吸道的嗜酸性粒细胞以脱颗粒的方式释放细胞内的颗粒蛋白[(Compr.Ther.)第20卷，第651项(1994)]，其中包括活化的MBP(主要为碱性蛋白)和ECP(嗜酸性粒细胞阳离子蛋白)等。这些颗粒蛋白对上皮细胞具有杀伤作用使上皮细胞脱落损伤。由于上皮细胞的剥离使感觉神经末梢露出，上皮通透性亢进，造成上皮分泌的平滑肌弛缓因子的丧失。另外，嗜酸性粒细胞产生的白三烯(LTC4)和血小板活化因子(PAF)可使支气管平滑肌紧张度亢进。以上这些变化慢慢地引起重复性发作进而可导致支气管壁加厚，成为过敏性呼吸道。
如众所周知，上述细胞因子和粘着分子的基因表达不断增加与呼吸道炎症相关，然而在肺或支气管病变的部位进行表达并系统地分析基因的变化与呼吸道过敏性的产生以及相互关系至今尚无报道。
另一方面，有关氯离子通道和疾患的关系仅有以下两个报道，即CFTR与囊胞性纤维症的关系(科学，257卷1125页(1992)))，CIC氯离子通道与肌肉紧张症的关系(自然，354卷304页(1991))，然而关于钙依赖性氯离子通道与支气管哮喘等疾病之间的关系未见报道。
本发明来源于人CLCA1cDNA和蛋白质以及来源小鼠的Gob-5cDNA和蛋白质虽然有文献报道(Genomics 54卷200页(1998)，Biochem Biophys ResCommun 255卷347页(1999))，但是这些DNA或蛋白质与支气管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病之间的关系完全没有描述。
本发明提供用于筛选具有抑制蛋白质活性化合物的方法以及该筛选法获得的化合物等，所述蛋白质在呼吸道过敏性产生亢进的肺、支气管上表达增加。

发明内容
本发明人为了解决所述的技术方案反复钻研终于从肺或支气管的哮喘型小鼠模型中发现与之相关的基因表达显著增加。我们详细研究了这个cDNA表达类型，结果证实，过敏性呼吸道炎症是通过呼吸道上皮细胞而被诱导表达的。
本发明人根据这些建树经过反复研究，最终完成了本发明的技术课题。
因此，本发明涉及(1)一种反义核苷酸，其具有与编码蛋白质或其部分肽的DNA序列互补或基本互补的碱基序列，所述蛋白质或其部分肽含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；(2)如(1)所述的反义核苷酸，其中与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列为SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(3)如(1)所述的反义核苷酸，其具有与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示碱基序列互补的序列或互补的部分碱基序列；(4)一种药物，其中包含如(1)所述的反义核苷酸；(5)如(4)所述的药物，其为预防或治疗支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物；(6)一种含有抗体的诊断试剂，所述抗体是针对含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐；(7)一种用于筛选化合物或其盐的方法，所述化合物或其盐具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性，它们含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列，所述筛选法的特征为，应用含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐；(8)如(7)所述的筛选方法，其中所述含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐，是通过编码含有与SEQ IDNO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐的DNA，通过该DNA进行基因转导形成的转化体并在转化体细胞膜上进行表达；(9)一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，所述化合物或其盐具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性，它们含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列，所述筛选用试剂盒的特征为，其中包含与SEQ IDNO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐；(10)一种化合物或其盐，其具有抑制含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐的活性，该化合物或其盐可通过如(7)所述的筛选方法或如(9)所述的筛选用试剂盒而获得；(11)一种药物，其中包含具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐活性的化合物或其盐，所述蛋白质或其部分肽或其盐含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，所述化合物或其盐可通过如(7)所述的筛选方法或如(9)所述的筛选用试剂盒而获得；(12)如(11)所述的药物是用于治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物；
(13)一种用于治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物，其中包括具有抑制钙依赖性氯离子通道作用的化合物或其盐；(14)一种治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，针对哺乳动物投与如(1)所述的反义核苷酸；(15)一种如(1)所述的反义核苷酸的应用，其目的用于制备治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物；(16)一种治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，针对哺乳动物投与具有抑制与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐活性的化合物或其盐，该化合物或其盐可通过如(7)所述的筛选方法或如(9)所述的筛选用试剂盒而获得；(17)一种化合物或其盐的应用，其目的可用于制备治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物，该化合物或其盐具有抑制与SEQ IDNO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐的活性，所述化合物或其盐可通过如(7)所述的筛选方法或如(9)所述的筛选用试剂盒而获得；(18)一种治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，针对该哺乳动物投与具有抑制钙依赖性氯离子通道作用的化合物或其盐；(19)一种具有抑制钙依赖性氯离子通道作用的化合物或其盐的应用，其目的可用于制备治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物。


图1为实施例2中的正常或过敏性呼吸道亢进小鼠模型Gob-5基因产物(mRNA)的组织分布示意图。图中Lu，H，Li，Ki，Br，Thy，Sp，SI，Li，St和PBL分别表示肺、心脏、肝脏、肾脏、脑、胸腺、脾脏、小肠、大肠、胃和外周血淋巴细胞。
图2为给与500μg/kg的乙酰胆碱(Ach)后产生的过敏性呼吸道亢进随时间变化的关系。**p＜0.01(Dunnett试验)。
图3为在实施例3的肺胞洗涤液中浸润的细胞数与时间的变化关系。Mφ、Eos、Neu和Lym分别表示噬菌体，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞和淋巴细胞。
图4为实施例3的小鼠过敏性呼吸道亢进模型Gob-5的基因产物(mRNA)随时间变化的关系。
图5为实施例4的正常小鼠或过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型在肺部冷冻切片中Gob-5基因的表达部位。
图6为实施例4的正常小鼠或过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型在肺部冷冻切片中PAS染色。
图7为实施例7中给予Gob-5基因反义寡核苷酸后的实验结果。**p＜0.01图8为实施例9中经给予AdV Gob-5-AS的小鼠和对照组的经给予AdV-wt的小鼠对乙酰胆碱显示的呼吸道反应性。数据用平均值±标准差表示。OVA吸入组和PBS吸入组两者之间的比较用t检验(#p＜0.05，##p＜0.01)，OVA吸入组和AdV给药组两者之间的多重比较用Dunnett检验(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图中柱1表示PBS吸入组，柱2表示OVA吸入组，柱3表示给药AdV-wt并吸入OVA的组，柱4表示给药AdV Gob-5-AS并吸入OVA的组。
图9为实施例9中给小鼠投药AdV Gob-5-AS及作为对照给小鼠投药AdV-wt的肺冷冻切片的PAS染色。
图10为实施例10中使用CHO细胞及表达人CLCA1的CHO细胞检测Cl-离子的分泌。无刺激和用10μM的离子霉素刺激时荧光强度与时间变化的关系。
图中，-○-表示无刺激的CHO细胞，-●-表示用10μM的离子霉素刺激的CHO细胞，-△-表示无刺激的表达人CLCA1的CHO细胞，-▲-表示用10μM离子霉素刺激表达人CLCA1的CHO细胞。
图11为实施例10中表达人CLCA1的CHO细胞对Cl-离子分泌具有抑制作用的NFA(niflumic acid)，DIDS(4，4′-diisothiocyanastilbene-2，2′-disulfonic acid)，DTT(dithiothreitol)。
图中，各柱所示细胞。
柱1无刺激柱2未添加阴离子转运抑制剂·离子霉素(10μM)刺激柱3添加NFA(200μM)·离子霉素(10μM)刺激。
柱4添加NFA(10μM)·离子霉素(10μM)刺激。
柱5添加DIDS(200μM)·离子霉素(10μM)刺激。
柱6添加DIDS(10μM)·离子霉素(10μM)刺激。
柱7添加DTT(200μM)·离子霉素(10μM)刺激。
柱8添加DTT(10μM)·离子霉素(10μM)刺激。
具体实施例方式
具有与本发明SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同序列的蛋白质(下文通常称为本发明蛋白质或本发明使用的蛋白质)既可为下述的蛋白质也可为合成蛋白，下述蛋白质均可来自人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)细胞如肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或者这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等)或者含此类细胞的组织，例如脑、脑的任何部分(例如，嗅球、屏状核、大脑基底神经节、海马、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、垂体、胃、胰腺、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、颌下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等。
作为与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，可举例为，具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列同源性至少约50％，优选至少约60％，进一步优选至少约70％，更优选至少约80％，特别优选至少约90％，最优选至少约95％的氨基酸序列。
作为包括与本发明SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列的蛋白质，例如优选具有与上述SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同，并且具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质性质基本相同的蛋白质等。
所述性质基本相同的例子包括，氯离子通道样活性(钙依赖性氯离子通道样活性)等。所谓性质基本相同是指，它们的性质在定性上(如生理上或药理上)相同。因此，优选氯离子通道样活性相同(如约0.01-100倍，优选约0.1-10倍，更优选约0.5-2倍)。然而，这些活性的大小或蛋白质分子量等其量化要素可以不尽相同。
若测定氯离子通道样等活性的话，可采用公知方法进行，如可按照Genomics，54卷200页(1998)阐述的方法或其改良方法进行测定。
作为含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的蛋白质，可举例为包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质等。
作为本发明所使用的蛋白质可进一步举例为，①在SEQ ID NO1或SEQID NO2所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸缺失(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，②在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸附加(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，③在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸插入(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，④在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸被置换(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，以及⑤上述氨基酸序列的组合同时也可包括突变蛋白质等。
如上所述，当氨基酸序列的插入，缺失或置换时，对插入，缺损或置换的位置没有特殊的要求，也可以包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2各自所示共同的氨基酸序列之外的位置等。
本说明书中所述的蛋白质，可以用本领域已知的描述肽的方法来定义。即，左端为N-末端(氨基端)，右端为C-末端(羧基端)。主要以包含SEQ IDNO1所示氨基酸序列的蛋白质，其中C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
这里R所代表的酯如C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、或正丁基等；C3-8环烷基包括环戊基和环己基等；C6-12芳基包括苯基和α-萘基等；以及C7-14芳烷基包括苯基-C1-2烷基如苯甲基、苯乙基等；或α-萘基-C1-2烷基如α-萘甲基，还有通常用作口服给药的酯的三甲基乙酰氧甲基。
当本发明蛋白质在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸酯)时，它可以酰胺化或酯化，则这类酰胺或酯也可以包括在本发明所述蛋白质的范围之内。所述酯基可以与上述C-末端酯基相同。
另外，本发明蛋白质还可以包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基用保护基(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述蛋白质分子中氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受适当基团(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护，或为结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白质等。
作为本发明蛋白质的具体之例，如来源于小鼠的包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质，来源于人小肠的包括SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质等。
作为本发明所应用的蛋白质的部分肽，就是前面所叙述的蛋白质的部分肽，优选的是只要与上述蛋白质具有同样性质的均可。
用于制备以后将要阐述的本发明抗体的具体实例，包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的第22～第913位氨基酸序列肽，还包括SEQ ID NO2所示氨基酸序列中第22～第914位氨基酸序列肽等。另外，在以后将要阐述的本发明的筛选法和筛选用试剂盒中，包含细胞膜结合部位(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中第1～第21位的序列)，优选使用SEQ IDNO1所示氨基酸序列中的第22～第913位部分氨基酸序列肽，还包括SEQID NO2所示氨基酸序列中第22～第914位部分氨基酸序列肽等。例如，在构成本发明蛋白质的氨基酸序列中，至少应用含有20个以上的氨基酸序列肽，优选50个以上，较优选70个以上，更优选100个以上，最优选200个以上。
另外，本发明所用的部分肽，其中氨基酸序列中可以有1个或2个以上氨基酸缺失(优选1～10个，更优选数个(1～5个))，或其中可以有1个或2个以上氨基酸附加(优选1～20个，较优选1～10个，更优选数个(1～5))，或者其中可以有1个或2个以上氨基酸被插入(优选1～20个，较优选1～10个，更优选数个(1～5个))，或者有1个或2个以上氨基酸被置换(优选1～10个，较优选数个，更优选1～5个)。
然而，本发明所应用的部分肽，C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，如前面叙述过的蛋白质一样其C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
本发明所使用的部分肽与前述的蛋白质同样在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸酯)时，它可以酰胺化或酯化，N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基用保护基，所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述分子内的氨基酸侧链上的取代基受适当基团保护，或结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白质等。
可使用本发明的部分肽作为制备抗体的抗原。
作为本发明的蛋白质或部分肽的盐，生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐而使用，优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
本发明的蛋白质或其部分肽或它们的盐如上述，可从人或其它温血动物细胞或组织中按照公知的蛋白质纯化方法进行制备，也可以通过培养转化体其中包含编码所述蛋白质的DNA来制备或根据以后将要叙述的肽合成法制备。
制备人和哺乳动物的组织或细胞时，先将人和哺乳动物的组织或细胞匀浆后，使用酸进行抽提，用反相层析法、离子交换层析法等组合的方法进行纯化分离。
本发明的蛋白质或部分肽或其盐或其酰胺物的合成，可以使用可用于蛋白质合成的商用树脂。这类树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂，4-甲基二苯甲基胺树脂，PAM树脂，4-羟甲基甲苯乙酰胺甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2′，4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时，将那些α-氨基及侧链上官能团受到相应保护的氨基酸，在树脂上按目标蛋白质或肽的序列顺序，用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时，将蛋白质或肽从树脂上切除下来，同时除去保护基团。然后在高度稀释的溶液中进行分子内二硫键的形成反应，以获得目标蛋白质或部分肽、或其酰胺物。
进行上述受保护氨基酸的缩合反应时，可使用蛋白质合成的多种活化试剂，但优选使用碳二亚胺。所述碳二亚胺有DCC、N，N′-二异丙基碳二亚胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。用这些试剂活化时，直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如，HOBt，HOOBt)，或先将受保护的氨基酸活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到树脂上。
适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂选自已知可用于蛋白质缩合反应的溶剂。这样的溶剂有酰胺类如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；卤化烃类如亚甲基盐酸盐和氯仿等；醇类如三氟乙醇等；亚砜类如二甲亚砜等；醚类如吡啶、二恶烷和四氢呋喃等；腈类如乙腈和丙腈等；酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及这些溶剂的适当混合物。反应温度从已知适用于蛋白质(蛋白质)成键反应的范围中选取，通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通常以过量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反应检验所述缩合反应；当所述缩合不充分时，可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成。当即使重复反应后仍未充分缩合时，用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化，以消除对后续反应的可能负影响。
用于保护初始氨基的保护基团有Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc等。
羧基可用如下的酯化作用保护，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基和2-金刚烷基等的直链、支链或环状烷基酯)，芳烷基酯化(例如酯化为苄酯、4-硝基苄酯、4-甲氧苄酯、4-氯苄酯以及二苯甲基酯等)、苯甲酰甲基酯化、苄氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化等。
丝氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级C1～6烷酰基如乙酰基，芳酰基如苯甲酰基，以及来自碳酸的基团如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基等。
适于保护酪氨酸中酚羟基的基团有Bz1，Cl2-Bz1，2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基等。
适于保护组氨酸中咪唑基的基团有Tos，4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
初始氨基酸中的活化羧基有相应的酸酐、叠氮化物、活化酯(带有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、HONB，N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)。将初始物质中待活化氨基酸的氨基活化时，可以使用其相应磷酰胺。
为了除去(脱离)保护基，在氢气流下用Pd-黑或Pd-碳等催化剂进行催化还原；用氢氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸或三氟醋酸，或这些酸的混合液进行酸处理；用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪等碱进行碱处理；以及用液态氨中的钠还原。用上述酸处理除去所述保护基团的反应通常在约-20℃～40℃进行。在酸处理中，添加阳离子清除剂以使反应有效进行，例如使用甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、间甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇或1，2-乙二硫醇。此外，用苯硫酚处理以除去已知可作为组氨酸中咪唑的保护基团的2，4-二硝基苯基。用作色氨酸中吲哚的保护基团的甲酰基用下述方法去除在1，2-乙二硫醇或1，4-丁二硫醇存在时用上述酸进行处理，以及用氢氧化钠稀溶液和稀氨水等碱进行处理。
与起始物质之反应无关的官能团的保护、保护基的选择、该保护基的消除、以及与上述反应有关的官能团的活化，从公知的基团和公知的方法中适当选择。
获得目标蛋白质或部分肽的酰胺体的其它方法有，如先将羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而加以保护；然后，将肽(蛋白质)链从氨基侧延伸至预期长度。然后，制备只将其中N-末端α-氨基的保护基团除去的蛋白质或肽以及只将其中C-末端羧基的保护基团除去的蛋白质或肽。将这两种蛋白质或肽浓缩在上述溶剂的混合液中。浓缩反应的细节同上。对浓缩所得被保护蛋白质或肽进行纯化后，通过上述方法除去所有的保护基团，获得所需粗制蛋白质或肽。该粗制蛋白质或肽可用各种已知的纯化方法进行纯化。冻干主要级分获得所需蛋白质或肽的酰胺物。
将羧基末端氨基酸的α-羧基与所选醇类缩合获得氨基酸酯，然后用与上述制备目标蛋白质或肽的酰胺物方法类似的方法获得所需蛋白质或肽的酯物。
本发明部分肽或它们的盐可通过已知的肽合成方法而制备，或本发明的蛋白质也可在适当的部位切断肽链制备。就肽合成的方法而言，固相合成或液相合成都可使用。即，将能构成本发明部分肽的一段部分肽或氨基酸与本发明蛋白质的其他部分缩合在一起。当产物中包含保护基团时，除去这些保护基团得到所需肽。用来缩合或除去保护基团的公知方法见下列1)～5)。
1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，纽约(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，纽约(1965)3)泉屋信夫等蛋白质合成与实验，丸善公司(1975)4)矢岛治明和榊原俊平生物化学实验教材1，蛋白质化学IV，205(1977)5)矢岛治明主编药物开发续篇，卷14，肽合成，广川书店反应完成后，可将常规纯化方法如溶剂提取、蒸馏、柱层析、液相层析以及重结晶等进行组合以纯化分离本发明蛋白质或肽。当用上述方法获得的蛋白质或肽为游离形式时，可以用公知的方法或其改良方法将所述蛋白质或肽转化为相应盐当所述蛋白质或肽以盐形式获得时，可以用公知的方法或改良方法将其转化为游离形式或其他的盐。
编码本发明蛋白质的DNA可为任意DNA，只要其含有编码本发明所述蛋白质的碱基序列。这类DNA也可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。
用于上述文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一种。所述DNA可以用从上述细胞或组织中制备的总RNA或mRNA级分通过反转录聚合酶链反应(以下简称为RT-RCR)直接扩增。
作为编码本发明蛋白质的DNA，如，SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示碱基序列含有的DNA，或者该DNA和能在严谨条件下与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示碱基序列杂交的碱基序列，并且能编码与本发明蛋白质性质基本相同的蛋白质的DNA，可以为任一种DNA。
作为能在严谨条件下与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示碱基序列杂交的DNA，例如，使用与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示碱基序列的同源性具有约50％以上，优选约60％以上，更优选约70％以上，再优选约80％以上，特别优选约90％以上，最优选约95％以上的DNA。
就杂交而言，可以用公知方法或其改良方法进行，如，分子克隆，第2版；J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社(1989)中所述方法。也可以按照所附说明书使用商品文库。该杂交反应优选在高度严谨条件下进行。
此处的高度严谨条件是，例如钠离子的浓度约为19-40mM，优选约19-20mM，而温度约为50-70℃，优选约60-65℃。特别优选钠离子的浓度约为19-40mM，温度约为65℃。
作为编码含有具体的SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，可使用SEQ ID NO3所示碱基序列的DNA等。而作为编码含有具体的SEQID NO2所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，可以使用SEQ ID NO4所示碱基序列的DNA等。
作为编码本发明部分肽的DNA，只要其含有编码本发明所述部分肽的碱基序列即可。这类DNA也可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。
作为编码本发明部分肽的DNA，可以使用含SEQ ID NQ3或SEQ IDNO4所示碱基序列的部分DNA，或者含有与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，同时编码与本发明蛋白质具有基本相同活性的蛋白质的DNA，使用其中一部分的DNA等。
所述能与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示碱基序列杂交的DNA，其意义同前所述。
有关碱基序列杂交的方法和严谨条件可与上述相同。
对完全编码本发明蛋白质、部分肽(以下，在克隆编码这些物质时以及说明其表达时，仅把它们简称为本发明的蛋白质)的DNA进行克隆时，可以用含有本发明蛋白质之部分碱基序列的合成型DNA引物按公知的PCR进行扩增，或通过与编码本发明蛋白质之部分或完整区的标记的DNA片段或合成DNA片段杂交来筛选已插入合适载体中的DNA。杂交反应可以根据分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989)描述的方法进行。也可用商品化的文库根据所附说明书进行杂交。
DNA碱基序列的转换可根据众所周知的方法如ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunlel法等Gupped duplex法或Kunkel法或其改进方法，使用PCR或众所周知的商品化试剂盒如MutanTM-super Express Km、MutanTM-K(均来自宝酒造株式会社)进行。
已经克隆的编码本发明蛋白质的DNA，根据需要，或者单独使用或者经限制酶消化后或连接一接头之后使用。该DNA可能在其5′端包含ATG作为翻译起始密码子，而在其3′端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始和终止密码子也可用合适的合成型DNA接头加上。
本发明蛋白质的表达载体可通过以下方法生产，例如，(a)从编码本发明蛋白质的DNA上切下所需DNA片段，(b)将该DNA片段连接到一合适载体上的启动子下游。
可以使用的载体包括来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌体如λ噬菌体等、动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒等以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
本发明所使用的启动子可以是任意启动子，只要它能同所用基因表达宿主匹配。在使用动物细胞作为宿主时，启动子有SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等。
在这些启动子中，优选CMV(巨细胞病毒)启动子或SRα启动子。如果宿主为大肠杆菌属的细菌，优选的启动子有trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时，优选的启动子有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子等。在用酵母作宿主时，优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子等。在用昆虫细胞作宿主时，优选的启动子有多角体蛋白启动子和P10启动子等。
除了前述的实例，根据需要，表达载体还可使用包含增强子、剪接信号、poly A加尾信号、选择标记、SV40复制起始子(下文通常简写为SV40ori)等。选择标记的例子包括，二氢叶酸还原酶(下文通常缩写为dhfr)基因[甲氨喋呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因(下文通常缩写为Ampr)、新霉素抗性基因(下文通常缩写为Neor，Geneticin抗性)等。尤其是，当CHO(dhfr-)细胞缺少dhfr基因并用dhfr基因作为选择标记时，使用无胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基可以进行筛选。
根据需要，可在本发明蛋白质的N-端加上同宿主匹配的信号序列。在用大肠杆菌属细菌作宿主时，可以使用的信号序列为Pho A信号序列、OmpA信号序列等；当用枯草杆菌属的细菌作宿主时，可以使用的信号序列为α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等；在用酵母作宿主时，可以使用的信号序列为MFα信号序列、SUC2信号序列等；在用动物细胞作宿主时，可以使用的信号序列为胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
使用含有如此构建的编码本发明蛋白质的DNA序列的载体，可获得转化体。
可以使用的宿主的实例有，属于大肠杆菌属的细菌、属于枯草杆菌属的细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫以及动物细胞等。
大肠杆菌属的细菌有，大肠杆菌(Eschericha cili)K12 DH1(美国国家科学院院刊，60，160(1968))、JM103(核酸研究，9，309(1981))、JA221(分子生物学杂志，120，517(1978))、HB101(分子生物学杂志，41，459(1969))、C600(遗传学，39，440(1954))等。
枯草杆菌属的细菌有，枯草杆菌MI 114(基因，24，255(1983))、207-221(生物化学杂志，95，87(1984))等。
酵母有，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)KM71等。
就昆虫细胞而言，病毒为AcNPV时有草地夜蛾幼虫(Spodopterafrugiperda，Sf)的细胞株、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中肠的MG1细胞、粉纹夜蛾卵的High FiveTM细胞、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的细胞、Estigmenaacrea的细胞等；病毒为BmNPV时有家蚕(Bombyx mori)的N细胞(BmN细胞)等。可用的Sf细胞有Sf9细胞(ATCC CRL1711)和Sf21细胞(这两种细胞均由Vaughn，J.L.等在In Vivo，13，213-217(1977)中描述)。
作为昆虫的例子，可以使用家蚕的幼虫(前田等，自然，315，592(1985))。
动物细胞包括猴COS-7细胞、Vero、中华仓鼠细胞CHO(以下简称CHO细胞)、dhfr基因缺陷的中华仓鼠细胞CHO(以下简称CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。
大肠杆菌属的细菌可以根据美国国家科学院院刊，69，2110(1972)或基因，17，107(1982)中描述的方法进行转化。
枯草杆菌属的细菌可以根据分子及普通遗传学，168，111(1979)中描述的方法进行转化。
酵母可以根据酶学方法，194，182-187(1991)或美国国家科学院院刊.，75，1929(1978)中描述的方法进行转化。
昆虫细胞或昆虫可以根据生物/技术，6，47-55(1988)中描述的方法进行转化。
动物细胞的转化可以根据《细胞工程学增订版8，细胞工程学实验最新方法》秀润出版社，263-267(1995)或病毒学，52，456(1973)中描述的方法进行。
由此，可以获得用含有本发明蛋白质之编码DNA的表达载体转化的转化体。
当培养宿主为大肠杆菌或枯草杆菌的转化体时，用于培养的培养基为液体培养基，该培养基含有转化体生长所必需的物质例如碳源、氮源、无机物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源包括无机或有机物质如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、酵母提取液、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯抽提物等。无机物又包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。此外，在培养基中也可加入酵母提取液、维生素、促生长因子等。培养基的pH值优选约5-8。
用于培养大肠杆菌属细菌的培养基优选为，加有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培养基(Miller，分子遗传学实验杂志，431-433，冷泉港实验室，纽约，1972)。必要时可以在培养基中加入试剂如3β-吲哚基丙烯酸，来有效激活启动子。
当用大肠杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约15-43℃培养约3-24小时。必要时培养物可以进行充气或搅拌。
当用枯草杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约30-40℃培养约6-24小时。必要时培养物可以进行充气或搅拌。
当用酵母作为宿主时，转化体培养在，例如Burkholder氏基本培养基(Bostian，K.L.等，美国国家科学院院刊，77，4505(1980))或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培养基(Bitter，G.A.等，美国国家科学院院刊，81，5330(1984))上。优选培养基pH值调节到大约5-8。转化体通常在大约20-35℃培养约24-72小时。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
当用昆虫细胞或昆虫作为宿主时，转化体培养在，例如Grace’s昆虫培养基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))上，其中添加有固相化10％牛血清等适当添加剂。优选培养基pH值调节到大约6.2-6.4。转化体通常在大约27℃培养大约3-5天。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
当用动物细胞作为宿主时，转化体培养在，例如含有大约5-20％牛胎血清的MEM培养基(科学，122，501(1952))、DMEM培养基(病毒学，8，396(1959))、RPMI 1640培养基(美国医学会杂志，199，519(1967))、199培养基(Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950))等中。优选培养基pH值调节到大约6-8。转化体通常在大约30-40℃培养大约15-60小时。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
如上所述，本发明的蛋白质可以产生在转化体的细胞内、细胞膜或细胞外上。
可以根据下述方法从上述培养物中分离纯化本发明的蛋白质。
在培养后，用众所周知的方法收集转化体或细胞，悬浮在一合适的缓冲液中，从中抽提本发明的蛋白质。然后用众所周知的方法破碎转化体或细胞，如超声处理、溶菌酶处理和/或反复东融等，然后离心、过滤，获得本发明蛋白质的粗提物。此过程的缓冲液可包含蛋白变性剂如尿素或盐酸胍、或表面活性剂如Triton X-100TM等。当所述蛋白质分泌在培养液中时，在培养结束后，用众所周知的方法从转化体或细胞中经分离而收集上清。
上清或包含在所获抽提物中的蛋白质可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括，利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀等；主要利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等；利用电荷差异的方法如离子交换层析等；利用特异性亲和力差异的方法如亲和层析等；利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱等；利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳。
当如此获得的蛋白质为游离形式时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为盐。相反，当获得的蛋白质为盐时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为游离形式或另一种盐形式。
重组产生的蛋白质，在纯化前或纯化后，可用相应蛋白修饰酶处理，从而使蛋白质经适当修饰，部分去除一段蛋白质。其中所述蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
由此产生的本发明蛋白质的存在，可通过利用特异性抗体的酶免疫分析法或蛋白质印迹法等进行测定。
针对本发明的蛋白质、部分肽或其盐的抗体，只要所述抗体能够识别本发明蛋白质、部分肽或其盐即可，可为多克隆抗体或单克隆抗体。
针对本发明蛋白质、部分肽或其盐(以下，在说明抗体时，将其简称本发明的蛋白质)的抗体可使用本发明蛋白质作为抗原，根据本领域公知的抗体或抗血清的生产法制备。
(a)产生单克隆抗体细胞的制备将本发明的蛋白质，单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予福氏完全或不完全佐剂。有效给药通常约为每2-6周一次，一共2-10次。使用的温血动物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、绵羊、山羊、家鸡，优选大鼠和小鼠。
在制备产生单克隆抗体细胞时，从抗原免疫的温血动物如小鼠中选择抗体滴度比较明显的动物，在最后一次免疫的2-5天后取脾脏或淋巴结，使其中产生抗体的细胞与同种或异种动物的骨髓瘤细胞融合，获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。抗血清中抗体滴度的测定可以通过使抗血清与标记的随后所述的蛋白质反应，然后测定标记试剂同抗体的结合活性。可以根据Koehler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法进行融合。融合加速剂的例子为聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选PEG。
温血动物骨髓瘤细胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1，优选P3U1。所用抗体产生细胞(脾脏细胞)同骨髓瘤细胞的比例优选约为1∶1到20∶1，加入浓度约为10％-80％的PEG(优选PEG 1000-6000)。然后在20-40℃保温。为了有效实施细胞融合，优选30-37℃保温约1-10分钟。
可以用各种方法筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。这些方法有将作为抗原的蛋白质直接或与载体一起吸附至一种固相(如微量反应板)，将杂交瘤上清加入到该固相中，然后加入标记的放射性物质或酶的抗免疫球蛋白抗体(如果用小鼠细胞作融合，则用抗小鼠的免疫球蛋白抗体)或蛋白A，检测结合到固相上的单克隆抗体；另一方法为，将杂交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相中，加入标记的放射性物质或酶的蛋白质，检测结合到固相上的单克隆抗体。
单克隆抗体的筛选可以根据众所周知的方法或其改进方法进行。一般地，在含有HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的动物细胞培养基中进行筛选。可以使用任何筛选和生长培养基，只要杂交瘤可以在其中生长。例如，可以使用含有1％-20％，优选10-20％牛胎血清的RPMI 1640培养基、含有1％-10％牛胎血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)、无血清的杂交瘤培养基(SFM-101，日水制药株式会社)作为筛选或生长培养基。通常在含5％CO2的条件下于20-40℃(优选37℃)培养约5天-3周(优选1-2周)。杂交瘤培养上清液中抗体滴度的测定同上述抗血清中抗体滴度测定方法相同。
(b)单克隆抗体的纯化单克隆抗体的分离和纯化可根据公知方法，例如免疫球蛋白的分离和纯化方法(如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、离子交换剂(如DEAE)吸附和去吸附、超离心、凝胶过滤、或一种特异性纯化方法，其包括仅收集与结合了抗原的固相、蛋白A或蛋白G等已活化吸附剂相结合的抗体并使之分离以获得该抗体)。
本发明多克隆抗体的制备用众所周知的方法或其改进方法进行。例如，用与上述生产单克隆抗体相似的方法生产免疫原(蛋白质抗原)或配制免疫原与载体蛋白形成的复合物并用其免疫温血动物。从已免疫的动物收集产物，其中含有本发明蛋白质或其盐的抗体，分离和纯化该抗体。
在由免疫原和载体蛋白组成的用于免疫温血动物的复合物中，对载体蛋白的类型和载体同半抗原的混合比率无限定，只要能针对与载体一起免疫的半抗原有效产生抗体。例如，牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或匙孔虫戚血蓝蛋白与半抗原以载体比半抗原重量比约0.1-20(优选约1-5)的比率偶联。
不同的缩合剂可用于偶联载体和半抗原。戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活化的酯和含有巯基或二硫代吡啶基的活化的酯试剂可用于偶联。
将缩合产物单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予福氏完全或不完全佐剂。大约每2-6周给药一次，共3-10次。
多克隆抗体从用上述方法免疫的温血动物的血液、腹水等(优选血液)中收集。
抗血清中多克隆抗体滴度的测定同上述测定血清抗体滴度的方法相同。可以根据上述用于分离和纯化单克隆抗体的免疫球蛋白分离纯化方法来分离和纯化多克隆抗体。
具有与编码本发明蛋白质或部分肽的DNA(下文，在说明反义核苷酸时，有时将它们称作本发明DNA)互补或基本互补的碱基序列的反义DNA可为任一种反义DNA，只要其含有与本发明DNA互补或基本互补的碱基序列，并能抑制该DNA的表达。
与本发明DNA基本互补的碱基序列，包括具有与互补于本发明DNA之碱基序列(即本发明DNA互补链)的全部或部分碱基序列至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％同源性的DNA。尤其是在本发明DNA互补链的全部碱基序列中，反义DNA具有与编码本发明蛋白质上N-末端区的部分碱基序列(如起始密码子附近的碱基序列等)的互补链至少约有70％同源性，优选至少约80％同源性，更优选至少约90％，最优选至少约95％。
具体地说，反义核苷酸具有与SEQ ID NO3、4、22或26所示碱基序列的DNA互补的碱基序列或者基本互补或者它的部分碱基序列；优选使用例如，反义核苷酸具有与SEQ ID NO3、4、22或26所示碱基序列的DNA互补的碱基序列或者它的部分碱基序列(优选与SEQ ID NO3或4所示碱基序列的DNA互补的碱基序列)；反义核苷酸具有与SEQ ID NO22中第1-第14位所示碱基序列的DNA互补的碱基序列或者它的部分碱基序列；反义核苷酸具有与SEQ ID NO22中第2764-第2843位所示碱基序列的DNA互补的碱基序列或者它的部分碱基序列；反义核苷酸具有与SEQ ID NO26中第1-第22位所示碱基序列的DNA互补的碱基序列或者它的部分碱基序列；反义核苷酸具有与SEQ ID NO26中第2765-第2825位所示碱基序列的DNA互补的碱基序列或者它的部分碱基序列等等。
反义核苷酸通常由10-40个碱基组成，优选15-30个碱基。
为了防止水解酶如核酸酶等的分解，组成反义DNA的每个核苷酸的磷酸残基(磷酸)都可以被置换为经过化学修饰的磷酸残基例如，硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯等。反义核苷酸可以用公知的DNA合成装置进行合成。
下面就用途进一步说明本发明蛋白质或部分肽或其盐(有时简称为本发明蛋白质)、编码本发明蛋白质或部分肽的DNA(有时简称为本发明DNA)、针对本发明蛋白质或部分肽或其盐的抗体(有时简称为本发明抗体)以及本发明DNA反义核苷酸(有时简称为本发明反义核苷酸)。
本发明的蛋白质在肺或支气管哮喘型动物模型的特异组织中表达增高，可利用它作为该疾病的标记物。另外，也可用它作为对伴有肺或呼吸道炎症的肺部或胸部疾患的早期诊断、症状严重程度的判定及疾病预后判断的标记物。
正如后面将要叙述的实施例一样，通过投药编码本发明蛋白质基因的反义核苷酸从而抑制了呼吸道过敏性亢进，由此可见，具有抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐与针对本发明蛋白质的抗体都具有同样的作用。
因此，含有编码本发明蛋白质的基因的反义核苷酸以及抑制本发明蛋白质的化合物或其盐或者针对本发明蛋白质的抗体之药物可以用作治疗或预防以下所述疾病的药物，如伴有支气管哮喘和慢性阻塞性肺部疾患等肺或呼吸道炎症的肺部或胸部的疾病。
(1)筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物本发明蛋白质的表达增高早于肺或呼吸道的炎症，所以能够抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐可作为药物用于治疗和预防以下疾病，例如伴有支气管哮喘和慢性阻塞性肺部疾患等肺或呼吸道炎症的肺部或胸部的疾病。
因此，本发明蛋白质可作为一种试剂，用于筛选能抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐。
即，本发明提供(1)一种筛选方法，其用于筛选能抑制本发明蛋白质活性(如，氯离子通道活性等)的化合物或其盐(下文通常简称为抑制剂)，其特征为，该筛选法包括应用本发明蛋白质，具体的例子为(2)一种用于筛选抑制剂的方法，其特征在于，在以下情况下进行比较(i)用钙激活剂激活具有产生本发明蛋白质能力的细胞和(ii)用钙激活剂激活具有产生本发明蛋白质能力的细胞和待测化合物。
针对上述的筛选方法，其特征在于当(i)和(ii)同时存在时，测定并比较本发明蛋白质对氯离子通道的活性。
作为钙激活剂可使用离子霉素，A23187(钙霉素)。
对于被检化合物包括新型化合物及公知的化合物如肽、蛋白、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等。
为了实施上述筛选法，将产生本发明蛋白质的细胞放在适于产生本发明蛋白质细胞的缓冲液中来制备标样。只要缓冲液对本发明蛋白质的氯离子通道活性反应无抑制作用，其中pH约为4～10(优选pH约为6～8)含有磷酸缓冲液和硼酸的缓冲液等均可。
所述能够产生本发明蛋白质的细胞，可以使用经过转化的宿主细胞(转化体)，这种转化是通过如前所述含有编码本发明蛋白质的DNA的载体而实现的。所述宿主优选使用如CHO细胞等动物细胞。筛选时，可以通过前面所述的筛选法进行培养而得到的转化体，优选使用能将本发明蛋白质表达在细胞膜上的转化体。
本发明蛋白质的氯离子通道活性可采用公知的如Genomics.第54卷200页(1998)记载的方法或改良的方法测定。
如上述(ii)中所述的氯离子通道活性与(i)比较，可以选择以可抑制约20％以上，优选约30％以上，更优选约50％以上的被检化合物作为抑制本发明蛋白质活性的化合物。
本发明的筛选用试剂盒中含有本发明的蛋白质、部分肽或它们的盐，或者含有能够产生本发明使用的蛋白质或其部分肽或其盐的细胞本发明筛选法或筛选用试剂盒获得的化合物或其盐是从上述所说的被检化合物中选择出来的，如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等。该化合物具有抑制本发明蛋白质的活性(如氯离子通道活性等)。
针对该化合物的盐，可以使用与上述本发明蛋白质的盐相同的物质。
具有能够抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐可用作治疗或预防以下疾病的药物，如伴有支气管哮喘和慢性阻塞性肺部疾患等肺或呼吸道炎症的肺部或胸部的疾病。
当通过本发明筛选法或筛选用试剂盒获得的化合物或其盐用作治疗或预防上述疾病的药物时，可以按照常规制药方法制成制剂。制剂可以包括片剂、胶囊、酏剂、微囊剂、无菌溶液制剂、悬浮液制剂等。
如此所获制剂安全、低毒，因此可对人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴，黑星星等)经胃肠道给药或非胃肠道给药。
该化合物或其盐的剂量依赖于该化合物的作用、病症、受试者和给药方法等而异；例如用能够抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐的口服药物治疗支气管哮喘疾病时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。当非经口给药时，该化合物一次投药量依赖于给药受体、症状等而定，例如用能够抑制本发明蛋白质活性或其盐的注射药物治疗支气管哮喘疾病时，成年人(体重60kg)优选静脉注射，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(2)本发明蛋白质、部分肽或其盐的定量针对本发明蛋白质的抗体(下文通常简称为本发明抗体)能特异地识别本发明的蛋白质，因此可用于定量测试样品溶液中的本发明蛋白质，尤其是通过夹心免疫分析进行定量。因此，本发明提供了下述的定量方法(i)一种定量待测样品液中本发明蛋白质的方法，其包括，使本发明的抗体与待测样品液以及标记的本发明蛋白质进行竞争反应，测定与该抗体结合的本发明标记性蛋白质的比率；和，(ii)一种定量待测样品液中本发明蛋白质的方法，其包括，同时或先后使所述待测样品液与固定在固相载体上的本发明抗体以及标记的本发明其它抗体反应，测定固相载体上标记试剂的活性。
在上述方法(ii)中，优选一种抗体能识别本发明蛋白质的N-末端，而另一抗体能识别本发明蛋白质的C-末端。
针对本发明蛋白质的单克隆抗体(下文，通常称作本发明单克隆抗体)可用于定量本发明蛋白质。此外，也可通过组织染色来定量本发明蛋白质。为此，可用抗体本身或使用抗体分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
对使用本发明蛋白质的抗体进行的定量方法没有特别的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根据待测样品液中相应抗原含量(例如蛋白质的量)，用化学或物理方法检测抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量，然后根据含已知量抗原的标准溶液制备的标准曲线来计算。优选的方法为，例如比浊法、竞争法、免疫测定法和夹心法；就敏感性和特异性而言，特别优选后面将要描述的夹心法。
用于分析方法的标记试剂的例子为放射性同位素、酶、荧光物质和化学发光物质等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。优选酶的例子为稳定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。荧光物质的例子包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等。化学发光物质的例子包括鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等。此外，也可使用生物素-链霉素系统来对抗原或抗体标记。
在固定抗原或抗体时，可以使用物理吸附。作为替代方法，也使用传统上来固定蛋白质或酶的化学结合。载体的例子包括，固相多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等。
在夹心法中，待测样品溶液与本发明的固定化单克隆抗体反应(第一反应)，然后与本发明的标记的其它单克隆抗体反应(第二反应)，测定固相载体上的标记试剂活性，由此可以测定待测样品中本发明蛋白质的量。第一和第二反应可以以相反次序进行，或同时或有间隔的先后进行。标记试剂的类型和固定的方法同上述的相同。在夹心法免疫分析中，用于标记的抗体和用于固相的抗体未必是一种类型或一个种类的抗体，也可使用两种或多种抗体的混合物来改善测定的灵敏度等。
在根据本发明的夹心方法测定本发明蛋白质时，优选用于第一和第二反应的单克隆抗体与本发明蛋白质的结合位点彼此不同。也就是说，在第一和第二反应用的抗体为，当第二反应的抗体识别本发明蛋白质的C端时，优选在第一反应中使用能识别除C端以外的位点，如N端。
本发明的单克隆抗体可用于除夹心法以外的其它分析方法，例如竞争法、免疫测定法和比浊法。
在竞争法中，待测溶液中的抗原和标记抗原竞争与抗体反应，然后将未反应的标记抗原(F)及结合于抗体的标记抗原(B)分离(即B/F分离)，测定B或F的标记量，从而可以测定待测溶液中的抗原量。在此类方法的反应中，有一种液相方法和一种固相方法，前者使用可溶性抗体，即加入针对第一抗体的第二抗体后，用聚乙二醇来有效分离B/F；后者可用固定的抗体作为第一抗体，或用可溶性抗体作为第一抗体但第二抗体为固相抗体。
在免疫测定法中，待测溶液中的抗原和固相抗原竞争性地与一定量的标记抗体反应，然后使液相与固相分离；或待测溶液中的抗原与过量标记抗体反应，然后加入固相抗原，使未反应的标记抗体与该固相结合，然后使液相与固相分离。随后，测定两相的标记量，来测定待测溶液中的抗原量。
在比浊法中，测定抗原-抗体在凝胶或溶液中反应产生的固相沉淀的量。即使待测溶液中抗原量很少且仅获得小量的沉淀，利用激光散射的激光比浊法也可以测定。
本发明应用这些免疫分析方法中任何一个进行分析时，不需要任何特殊条件和操作。除了每种方法的常规条件和操作外，本领域技术人员可构建测定本发明蛋白质的分析系统。所述常规技术的细节，参见如入江宽(编)“放射免疫分析”(1974，讲谈社，日本)；入江宽(编)“放射免疫分析，续编”(1979，讲谈社，日本)；石川荣治等(编)“酶免疫分析”(医学书院，1978)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第二版”(医学书院，1982)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第三版”(医学书院，1987)；“酶学方法”卷70(免疫化学技术(A))；同上，卷73(免疫化学技术(B))；同上，卷74(免疫化学技术(C))；同上，卷84(免疫化学技术(D选择性免疫分析))；同上，卷92(免疫化学技术(E单克隆抗体及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化学技术(I杂交瘤技术及单克隆抗体))(Academic Press出版)等)。
如上所述，使用本发明的抗体可高度敏感地定量本发明蛋白质。
此外，使用本发明的抗体可定量本发明蛋白质的浓度，(1)从而当检出本发明蛋白质浓度的增加时，能够诊断出如下各种疾病或者将来对这些疾病的高度易感性例如所述疾病为伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
另外，本发明抗体可用于检出体液或者组织等待检标本液中存在的本发明蛋白质。又可用于抗体柱的制作，该抗体柱可用于纯化本发明蛋白质；检出各纯化组分中的本发明蛋白质；对被检细胞内本发明蛋白质的行踪进行分析等。
(3)基因诊断制剂例如，本发明的DNA作为一种探针可以检出人或温血动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、黑猩猩等)中编码本发明蛋白质或其部分肽的DNA或mRNA的异常(基因异常)，因此，本发明的DNA可用作基因诊断制剂，用于诊断DNA或mRNA的损伤、突变，或其表达量的减少、或该DNA或mRNA的增加或DNA或mRNA的过表达。
上述基因诊断通过使用编码本发明蛋白质的DNA，用众所周知的Northern杂交分析或PCR-SSCP分析来完成(Genomics，5，874-879(1989)；美国科学院学报，86，2766-2770(1989))。
例如，当用Northern杂交分析表达量过多时和PCR-SSCP分析检出DNA突变时，能够很大程度地诊断出如下各种疾病所述疾病为伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
(4)含有反义DNA的药物反义DNA能与本发明DNA互补地结合并抑制该DNA的表达，因此反义DNA能够抑制生物体内中本发明蛋白质或本发明的DNA(如氯离子通道活性)的机能，因此它可用作治疗或预防以下各种疾病的药物例如，伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
当将所述反义DNA用作上述各种疾病的治疗或预防药物时，同前所述可以按照本领域公知的方法制成制剂实施给药。
例如，当反义DNA用作上述预防/治疗药物时，反义DNA可单独使用，或插入合适载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒载体后按常规方法对人或哺乳动物(例如，大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)经胃肠道给药或经非胃肠道给药。该反义DNA可以以裸露DNA的形式给药，或与生理学上承认的用于促进吸收的辅助剂等的载体一起制成药剂并给药以便于其被基因枪摄入或通过含有水凝胶的导管导入。或者作为雾化吸入剂可在呼吸道局部给药。
该反义核苷酸的剂量依赖于给药受体、症状和给药方法等而异，例如当用于治疗或预防支气管哮喘疾病患者(成人体重60kg)时，气管的局部吸入本发明反义核苷酸的剂量为每天大约0-1-100mg/kg。
该反义DNA也可用作诊断寡核苷酸探针，其目的是检查组织或细胞中是否有本发明DNA的存在或者该DNA的表达。
(5)含有本发明抗体的药物本发明抗体具有中和本发明蛋白质活性的作用，例如，该抗体可用作治疗或预防以下各种疾病的药物例如，伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
上述各种疾病的治疗药物或预防药物含有本发明抗体，为低毒，其可直接以原始液体制剂或以适当剂型的药用组合物，对人或哺乳动物(例如，大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)经过口服或非口服形式给药。本发明抗体的剂量依赖于给药受体、症状和给药方法等而异；当用于治疗或预防支气管哮喘疾病患者(成人)时，静脉注射的一次剂量为每天大约0-01-20mg/kg体重，优选大约0-1-10mg/kg体重，更优选0.1-5mg/kg体重，一天1-5次，优选一天1-3次。其他非胃肠道给药或经口给药均依据此量。症状特别严重者根据其病症可以增加使用量。
本发明的抗体可以直接给药或者制成适当的药用组合物给药。所述药用组合物包含上述抗体或它们的盐和可药用载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物可以为适于经口或非胃肠道给药的剂型。
也就是说，适于经口给药的组合物包括固体型制剂或液体型制剂，具体地有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片剂)、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮剂等。这种组合物可以通过公知的方法生产，其制剂通常包括制药领域常规使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如用于片剂的载体或赋形剂有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
适于非胃肠道给药的组合物有针剂、栓剂等，针剂包含的剂型有静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等。这类注射剂根据公知方法，例如将所述抗体或它们的盐溶解、悬浮或者乳化于无菌水性溶液或无菌油性溶液而制备。注射用水溶液有生理盐水、含葡萄糖及其它辅助制剂的等渗溶液，并还可以进一步与合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50(加氢的蓖麻油的聚氧乙烯(50ml)加成化合物)等结合使用。油性溶液有芝麻油和大豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。由此制备的注射液一般装在合适的安瓿中。用于直肠给药的栓剂通过将所述抗体或它们的盐与一般的栓剂基质混合而制备。
上述口服或非口服的药用组合物，最好制成适合于活性成分投药剂量的用药剂型。其投药剂型包括，片剂、丸剂、胶囊、注射制剂(安瓿)、栓剂等，每个单位剂型通常含有上述抗体5-500mg，注射剂优选含5-100mg，其他制剂优选含有10-250mg。
此外，前面所述各种组合物也可含有其它活性成分，只要与上述抗体的结合不发生不利的相互作用。
在说明书和附图中，碱基和氨基酸的代码使用IUPAC-IUB生化命名委员会规定的或本领域通用的代码，如下述例示。对于有光学异构体的氨基酸，除非特别说明，均指L形式。
DNA 脱氧核糖核酸cDNA 互补的脱氧核糖核酸A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶RNA 核糖核酸mRNA 信使核糖核酸dATP 脱氧腺苷三磷酸dTTP 脱氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP 脱氧鸟苷三磷酸dCTP 脱氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸钠Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸Val 缬氨酸Leu 亮氨酸Ile 异亮氨酸Ser 丝氨酸Thr 苏氨酸Cys 半胱氨酸Met 甲硫氨酸Glu 谷氨酸Asp 天冬氨酸
Lys赖氨酸Arg精氨酸HiS组氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬酰胺Gin谷氨酰胺pGlu 焦谷氨酸另外，在本说明书中，频繁使用的取代基、保护基以及试剂用下列符号表示。
Me 甲基Et 乙基Bu 丁基Ph 苯基TC 四氢噻唑-4(R)-氨甲酰Tos 对甲苯磺酰基CHO 甲酰基Bzl 苄基Cl2-Bzl2，6-二氯苄基Bom 苄氧甲基Z 苄氧羰基Cl-Z 2-氯苄氧羰基Br-Z 2-溴苄氧羰基Boc 叔丁氧基羰基DNP 二硝基苯酚Trt 三苯甲基Bum 叔丁氧基甲基Fmoc N-9-芴基甲氧基羰基HOBt 1-羟基苯并三唑
HOOBt 3，4-二羟基-3-羟基-4-氧基-1，2，3-苯并三嗪HONB 1-羟基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亚胺DCCN，N′-二环己基碳二亚胺本说明书序列表中的序列编号分别表示如下[SEQ ID NO1]表示小鼠Gob-5蛋白质的氨基酸序列。
表示人CLCA1蛋白质的氨基酸序列。
表示编码含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的小鼠Gob-5蛋白质DNA的碱基序列。
表示编码含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的人CLCA1Gob-5蛋白质DNA的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR1的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR2的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR3的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR4的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR5的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR6的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR7的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR8的碱基序列。[SEQ ID NO13]表示实施例1中引物-PR9的碱基序列。[SEQ ID NO14]表示实施例1中引物-PR10的碱基序列。[SEQ ID NO15]表示实施例1中引物-PR11的碱基序列。[SEQ ID NO16]表示实施例1中引物-PR12的碱基序列。[SEQ ID NO17]表示实施例1中引物-PR13的碱基序列。[SEQ ID NO18]表示实施例1中引物-PR14的碱基序列。[SEQ ID NO19]表示实施例1中引物-PR15的碱基序列。[SEQ ID NO20]表示实施例1中引物-PR16的碱基序列。[SEQ ID NO21]表示实施例1中引物-PR17的碱基序列。[SEQ ID NO22]表示实施例1所得到的含有Gob-5全长基因cDNA的碱基序列。[SEQ ID NO23]表示实施例2中Gob-5基因探针的序列。[SEQ ID NO24]表示实施例5中引物-PR18的碱基序列。[SEQ ID NO25]表示实施例5中引物-PR19的碱基序列。[SEQ ID NO26]表示实施例5所得到的含有人CLCA1全长基因cDNA的碱基序列。[SEQ ID NO27]表示实施例5中引物-PR20的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR21的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR22的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR23的碱基序列。
表示实施例5中引物-PI24的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR25的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR26的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR27的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR28的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR29的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR30的碱基序列。
表示实施例5中引物-PR31的碱基序列。
表示实施例7中寡核苷酸Gob-5AS的碱基序列。
表示实施例7中寡核苷酸Gob-5MM的碱基序列。
实施例下面，用实施例详述本发明，但并非限制本发明的范围。使用大肠杆菌进行基因操作按“分子克隆”的方法进行。
将实施例1中的Gob-5全长基因DAN片段克隆为pT7 Blue-T Vector进而得到质粒pT7-mGob-5，用这个质粒进行转化形成大肠杆菌转化体Escherichichia coli JM109/pT7-mGob-5，该转化体于1999年9月20日保存在日本国茨城县茨城市东1-1-3(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6882，该保藏已于1999年8月24日保存在日本国大阪府大阪市淀川区十三本町2-17-85(邮编532-8686)的财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16316。
随后在实施例6中得到的质粒pcDNA-hCLCA1通过转化形成大肠杆菌转化体Escherichichia coli DH5α/pcDNA-h CLCA1于1999年9月20日保存在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6877，又在1999年8月24日保存在财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16311。
实施例1 利用过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型克隆提高表达的Gob-5基因过敏性呼吸道亢进小鼠模型的制作为采用BALB/c小鼠(雄性，6周龄)，在腹腔内注射400μl的20μgOVA(卵清蛋白)及含有2mg柱的生理盐水，1周后再注射200μl的10μgOVA及含有1mg柱的生理盐水使其产生增敏作用，再过1周连续7天将溶于1/2浓度的PBS中的5％OVA溶液，在动物无麻醉自主呼吸下吸入25分钟。进行雾化吸入时使用超声喷雾器(索尼喷雾器305、ATOM医疗)。过敏性呼吸道亢进在最后吸入抗原24小时之后，用乙酰胆碱(62.5-2000μg/kg)引起呼吸道狭窄反应然后用Konzett-Rossker方法测定并判断过敏性呼吸道亢进。使用戊巴比妥麻醉药致死小鼠，然后插入气管套管，再用0.5ml的PBS洗涤气管套管3次以制备支气管肺胞洗涤液(BALF)。接着用细胞离心机(700rpm.1min)制作涂抹标本，经过Diff-Quick染色镜检，并计算巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞以及其它细胞的比例。
作为样本poly(A)+RNA使用正常小鼠和过敏性呼吸道亢进小鼠的肺或支气管用ISOGEN(和光纯药)来抽提总RNA，通过寡(dT)纤维素柱(Pharmacia)，制备poly(A)+RNA。各自以2μg的poly(A)+RNA作为起始材料使用PCR-select cDNA减影试剂盒(Clontech)进行减影，在过敏性呼吸道亢进小鼠的肺或支气管中特异性表达，并收集到了表达的cDNA片断(通过PCR扩增了部分cDNA片断)。在所得PCR片段的两端添加用于减影的接头碱基序列，并用限制酶RsaI消化这种接头的碱基序列，经过DNA片断末端平滑处理之后，再对该片断进行亚克隆形成pT7 Blue T-Vector(ノバゲン)。解读经过亚克隆的cDNA片断的碱基序列，将确认的碱基序列为基础用公知的Geneble数据库进行blastN同源性的检索。
其结果表明，在所研究的120个克隆中有79个克隆均与编码公知的小鼠Gob-5基因碱基序列完全一样。因此，用cDNA合成试剂盒(宝酒造)由过敏性呼吸道亢进小鼠肺的poly(A)+RNA合成cDNA，再以该cDNA为模板使用Gob-5基因的5′非翻译区(PR1SEQ ID NO5)和3′的非翻译区(PR2SEQ ID NO6)的2种引物DNA进行PCR扩增，从而获得Gob-5全部基因(SEQ ID NO22)。扩增反应使用TaKaRa EX TaqTM(宝酒造)，并用热循环仪Gene Amp PCR system 9700(Perkin-Elmer)，按照以下循环周期进行最初在98℃反应1分钟后，再以98℃10秒、60℃1分钟、72℃3分钟为一个反应周期，扩增30个周期循环，最后在72℃延长10分钟。接着将扩增所得Gob-5全部基因的DNA片断克隆至pT7 Blue-T载体上。进一步用合成引物(PR1-17SEQ ID NO5-21)进行环状排序反应，通过荧光DNA测序仪(ABIPRISM TM377、Perkin-Elmer)证实了所得反应物的碱基序列。
实施例2利用过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型分析Gob-5基因产物在组织中的分布从正常或过敏性呼吸道亢进小鼠体内摘除以下组织器官，它们包括肺、心脏、肝脏、肾脏、脑、胸腺、脾脏、小肠、大肠、胃，使用ISOGEN(和光纯药)制备总RNA。将该总RNA上样于寡(dT)纤维素柱(Pharmacia)，制备poly(A)+RNA。将0.5μg的poly(A)+RNA在含2.2M福尔马林的1.19琼脂糖凝胶上电泳，然后根据毛细作用印迹法将RNA从凝胶上转移至尼龙膜过滤器(HybondN+Amersham pharmacia biotech)上，所需时间为18个小时。通过紫外线处理将RNA固定在尼龙膜过滤器之后，在Express HybHybridization Solution(Clontech)中65℃下进行再杂交。用[α-32P]dCTP和BcaBEST Labeling Kit(宝酒造)标记作为探针的如实施例1所示的一个Gob-5cDNA片段(SEQ ID NO23)。杂交是在65℃下含有标记探针的Express HybHybridization Solution中进行的，所需时间为2个小时。其过滤膜是在最终浓度为0.1×SSC、0.1％SDS溶液中洗涤的，其温度为50℃，使用BAS-2000(富士胶片)进行检测。其检测结果是，Gob-5基因的表达在正常小鼠的小肠、大肠、胃中看到，而在肺中没有看到。并得知在过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型的肺中表达非常明显，而且强烈引起过敏性呼吸道亢进。另一方面，在过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型的小肠、大肠、胃中的Gob-5基因表达与正常小鼠表达水平相同，在过敏性呼吸道亢进中并没有观察到基因的表达增加(图1)。
实施例3利用过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型分析Gob-5基因的表达与时间的变化关系如实施例1所述，本实施例使用过敏性呼吸道亢进模型中的小鼠按照实施例1的方法，在吸入OVA之前以及吸入OVA之后的第2、3、4、5、6、7天对过敏性呼吸道亢进以及在肺胞洗涤液中的浸润细胞数进行测定(图2、3)。另外，还在吸入OVA之前以及吸入OVA之后的第1、2、3、5、7天将肺器官摘除，按照实施例2的方法进行了Northern印迹杂交分析(图4)。其结果是，在吸入OVA之后的第4天开始出现过敏性呼吸道亢进以及在肺胞洗涤液中的浸润嗜酸性粒细胞，而Gob-5基因的表达却在吸入OVA之后的第2天明显出现。也就是说，Gob-5基因的表达早于过敏性呼吸道亢进以及在肺胞洗涤液中的浸润嗜酸性粒细胞的出现，由此本实验可以暗示，呼吸道炎症并不是由于Gob-5基因表达造成的，很有可能是Gob-5基因表达导致了过敏性呼吸道亢进以及在肺胞洗涤液中的浸润嗜酸性粒细胞的出现。
实施例4利用过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型对Gob-5基因表达的定位用4％的多聚甲醛灌流固定后摘除正常及过敏性呼吸道亢进模型小鼠的肺器官，4℃下过夜固定，然后依次增加蔗糖的浓度以取代蔗糖-HBSS溶液，使蔗糖-HBSS溶液的最终浓度为18％，用千冰冻结。将冰冻的肺在低温温箱内14℃下放置3小时，切割厚度为10-15μl，并粘贴在经过APS涂膜处理的载玻片上。为了制备DIG标记探针，首先以实施例1 Gob-5的全长基因片段为模板，使用合成引物(PR2SEQ ID NO6、PR3SEQ ID NO7)，按照PCR法扩增为0.5kb Gob-5 DNA片段。扩增反应使用TaKaRa EX TaqTM(宝酒造)，并用热循环仪Gene Amp PCR system 9700(Perkin-Elmer)，按照以下周期循环进行最初在94℃反应1分钟后，再以94℃10秒、60℃30秒、72℃90秒为一个反应周期，扩增30个周期循环，最后在72℃延长10分钟。接着将扩增所得DNA片断插入至pCRII-TOPO载体(Invitrogen)上，使用DIGLabeling Kit(ベツリンガ-マンハィム)，按照说明书上的说明根据SP6 RNApolymerase及T7 RNA polymerase在载体的两端进行延长，制备DIG标记的反义探针和有义探针。使用ISHR Starter Kit(nipongene)按照说明书上的说明进行In situ杂交。其结果证实，Gob-5基因在过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型中支气管周围出现高水平的表达。而在正常小鼠中其Gob-5基因的表达在任何部位都没有被证实(图5)。曾有报道Gob-5基因在小肠和大肠的杯状细胞中(goblet细胞)表达[Biochem.Biophys.Res.Commun.255卷，347页，(1999)]。有报道说，正常小鼠的支气管上几乎不存在杯状细胞，而过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型的支气管里形成很多的杯状细胞[Am.J.Respir.Cell Mo1.Bio1.14卷，425页(1996)]。因此支气管周围的Gob-5基因表达是否起因于杯状细胞通过PAS染色法特异地对杯状细胞进行染色观察。将正常以及过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型的肺切片用10％的福尔马林溶液固定10分钟，然后用0.5％高碘酸溶液氧化5分钟，用希夫试剂处理15分钟，再用亚硫酸水溶液处理3分钟，乙醇脱水用レモゾ-ルA透明从而进行PAS染色。从染色结果来看，支气管周围的杯状细胞染色部位与Gob-5基因表达的部位非常一致，所以可以认为支气管杯状细胞就是Gob-5基因表达的部位(图6)。
实施例5获得一种作为Gob-5基因的人配对物的CLCA1基因对Gob-5基因通过Geneble数据库检索了blastN的同源性。检索结果显示，该基因属于钙依赖性氯离子通道家族，它与人CLCA1基因[Genomics，54卷，200页(1998)]的碱基水平相比具有极高的同源性为72％，与氨基酸水平相比也具有极高的同源性为72％。人CLCA1基因在正常人的小肠和大肠里观察到组织特异性的表达，在肠内杯状细胞中为高表达进而显示了与Gob-5基因具有同样性质，由此可以推断Gob-5的人配对物为CLCA1。这样以人小肠的cDNA文库(Clontech)为模板，使用CLCA1基因的5′非翻译区(PR18SEQ ID NO24)和3′的非翻译区(PR19SEQ ID NO25)的2种引物DNA进行PCR，从而获得CLCA1全长基因(SEQ ID NO26)。扩增反应使用TaKaRa EX TaqTM(宝酒造)，并用热循环仪Gene Amp PCR system 9700(Perkin-Elmer)，按照以下循环周期进行最初在98℃反应1分钟后，再以98℃10秒、60℃1分钟、72℃3分钟为一个反应周期，扩增30个周期循环，最后在72℃延长10分钟。接着将扩增所得CLCA1全长基因的DNA片断克隆至pCRII-TOPO载体(Invitrogen)上。进一步用合成引物(PR20-31SEQID NO27-38)进行环状排序反应，通过荧光DNA测序仪(ABI PRISMTM377、Perkin-Elmer)证实了所得反应物的碱基序列。
实施例6构建一种载体使其在动物细胞中表达人CLCA1基因用限制酶KpnI-NotI消化一种已导入了实施例5所示CLCA1基因的pCRII-TOPO载体，得到一种含有CLCA1基因的2.9kbp DNA片段，将它插入到同样用KpnI-NotI消化得到的pcDNA3.1质粒(Invitrogen)上，其在巨细胞病毒增强子/启动子的下游具有CLCA1基因，并构建了具有选择标记抗新霉素基因的质粒pcDNA-hCLCA1。
实施例7通过施与反义寡核苷酸的药物抑制针对Gob-5基因的过敏性呼吸道亢进为了弄清Gob-5基因的表达与过敏性呼吸道亢进的关系，研究了通过施与Gob-5基因翻译起始点附近的硫代磷酸酯型反义寡核苷酸(Gob-5ASSEQ ID NO39)和对照的错配变异硫代磷酸酯型反义寡核苷酸(Gob-5MMSEQ ID NO40)对呼吸道反应性的效果。在实施例1中的过敏性呼吸道亢进小鼠模型中，OVA吸入1个小时前和4个小时后连续7天给气管内喷药，该药物为悬浮于生盐水中的Gob-5AS、Gob-5MM(1mg/kg)。呼吸道的反应性按照实施例1的方法进行测定。由于施与Gob-5AS从而明显地抑制了过敏性呼吸道亢进，而在对照组Gob-5MM中没有看到明显的抑制现象(图7)，从其结果可知Gob-5基因与过敏性呼吸道亢进有关。
实施例8 针对Gob-5基因制备用于表达反义链RNA病毒载体构建一种粘粒载体pAxCA-Gob-5-AS，其构建包括用限制酶KincII-SmaI消化一种已导入了实施例1所示Gob-5基因的pT7Blue-T载体，把2.9kbpDNA片段其中包含Gob-5基因插入到用SwaI消化的pAxCAwt粘粒载体上(宝酒造)，在CAG启动予下游Gob-5基因被反向插入。用AdenovirusExpression Vector Kit(宝酒造)并按照说明书的要求把这个载体转染至293细胞里，同时还转染用限制酶处理过的DNA-TPC。制作重组腺病毒AdVGob-5-AS。进一步在293细胞里重复4次感染得到病毒液体，使用CentriconPlus-20(ミリポア)进行脱盐浓缩制作2.6×1011PFU/ml得到高效病毒液体。用pAxCAwt粘粒载体进行同样操作制作重组腺病毒AdV-wt的一种6.6×1010PFU/ml的高效病毒液体，作为对照实验。
实施例9针对Gob-5基因施与用于表达反义链RNA病毒载体从而抑制过敏性呼吸道亢进为了证实实施例7所示的过敏性呼吸道亢进与Gob-5基因的关系，研究了实施例8所示的针对Gob-5基因施与用于表达反义链RNA病毒载体而对呼吸道反应性带来的效果。在实施例1所示的过敏性呼吸道亢进小鼠模型中，再吸入OVA一天之前在小鼠气管内施与用蒸馏水稀释的AdV Gob-5-AS、AdV-wt(5×108PFU/40μl)的药物。按照实施例1的方法测定了呼吸道反应性。其结果证实由于施与AdV Gob-5-AS明显地抑制了过敏性呼吸道亢进，而在对照组AdV-wt中却没有看到明显的抑制现象(图8)，Gob-5基因与过敏性呼吸道亢进有关。在呼吸道反应性检测之后，摘除小鼠的肺器官，按照实施例4所表示的方法制作冰冻切片，从组织学上研究它们的关系。在施与AdV Gob-5-AS的小鼠呼吸道上皮里，比较对照组AdV-wt的小鼠显示PAS染色阳性的杯状细胞数明显减少，该细胞具有分泌粘液的作用。以上结果显示Gob-5与杯状细胞的增殖分化和粘液分泌有关(图9)。
实施例10利用表达人CLCA1的CHO细胞分析Cl离子的分泌按照Gene transfer lyo(和光纯药)所附说明书的操作指南将实施例6所示的表达人CLCA1的质粒pcDNA-hCLCA1导入到CHO细胞。用添加有1mg/ml新霉素(G418)(Gibco-BRL)的MEM-α培养基(Gibco-BRL)进行选择培养，培养时间为10个小时，取生长的细胞作为具有表达人CLCA1的CHO细胞。将获得的表达人CLCA1的CHO细胞和亲本CHO细胞系用2μg/ml的纤连蛋白(伊藤火腿)涂层在涂过纤连蛋白的96孔培养平板(Packard)上各自播种浓度为4×104细胞/孔，在5％CO2，37℃下培养24小时。培养结束后，用不含氯离子的缓冲液(2.4mM K2HPO4、0.6mMK2HPO4、10m M D-glucose、1mM MgSO4、1mM CaSO4、135mM NaNO3、10mM HEPES pH7.4)洗涤一次，添加100μl/孔的1mM Cl离子荧光指示剂6-甲氧基-碘化N-乙基喹啉盐(MEQ Molecular Probes)37℃温育2个小时。再用含有氯离子的缓冲液(2.4mM K2HPO4、0.6mMK2HPO4、10mM D-glucose、1mM MgSO4、1mMCaSO4、135mM NaCl、10mM HEPES pH7.4)洗涤二次，室温放置30分钟。给每个孔换为不含氯离子的缓中液，再加入离子霉素使之达到10μm，紧接着用多标记计数器Wallac1420ARVOsx(Amersham Pharmacia Biotech)在激发波长为355nm和测定波长为460nm的条件下测定荧光强度。
不论是亲本CHO细胞还是人CLCA1的CHO细胞它们在无刺激的状态下均没有观察到荧光强度的上升。如果用10μm离子霉素(和光纯药)刺激时，人CLCA1的CHO细胞比亲本CHO细胞的荧光强度提高大约2倍左右(图10)。结果表明CLCA1具有Ca2+依赖性氯离子通道的作用。
在上述的实验操作中用含有氯离子的缓中液洗涤2次后，添加一种抑制转运阴离子的药物，即niflumic acid(NFA Cayman Chemical)、4，4′-diisothiocyanastilbene-2，2′-disulfonic acid(DIDS、Molecular Probes)或dithiothreitol(DTT、和光纯药)，室温下放置30分钟，此时由于离子霉素对人CLCA1的CHO细胞的刺激而造成荧光强度的上升受到抑制(图11)。
从以上实验可知，使用人CLCA1的CHO细胞可以筛选具有抑制氯离子通道作用的化合物或其盐。通过该筛选法获得的化合物或其盐可以用于治疗和/或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病等的药物。
产业上的利用性具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质为诊断支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的标记物，因此，具有抑制蛋白质活性的化合物或其盐以及具有抑制该蛋白质活性的中和抗体都可以作为治疗和/或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病等的药物。
另外，本发明的反义核苷酸可以抑制具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质表达作用，所以该反义核苷酸可以用于治疗和/或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病等的药物。
序列表序列表<110>武田药品工业株式会社(Takeda Chemical Industries，Ltd.)<120>与疾病相关的基因用途<130>2672WO0P<150>JP 11-333479<151>1999-11-24<150>JP 2000-127589<151>2000-04-27<160>40<210>1<211>913<212>PRT<213>小鼠<400>1Met Glu Ser Leu Lys Ser Pro Val Phe Leu Leu Ile Leu His Leu Leu5 10 15Glu Gly Val Leu Ser Glu Ser Leu Ile Gln Leu Asn Asn Asn Gly Tyr20 25 30Glu Gly Ile Val Ile Ala Ile Asp His Asp Val Pro Glu Asp Glu Ala35 40 45Leu Ile Gln His Ile Lys Asp Met Val Thr Gln Ala Ser Pro Tyr Leu50 55 60Phe Glu Ala Thr Gly Lys Arg Phe Tyr Phe Lys Asn Val Ala Ile Leu65 70 75 80Ile Pro Glu Ser Trp Lys Ala Lys Pro Glu Tyr Thr Arg Pro Lys Leu85 90 95Glu Thr Phe Lys Asn Ala Asp Val Leu Val Ser Thr Thr Ser Pro Leu100 105 110Gly Asn Asp Glu Pro Tyr Thr Glu His Ile Gly Ala Cys Gly Glu Lys115 120 125Gly Ile Arg Ile His Leu Thr Pro Asp Phe Leu Ala Gly Lys Lys Leu130 135 140Thr Gln Tyr Gly Pro Gln Asp Arg Thr Phe Val His Glu Trp Ala His145 l50 155 160Phe Arg Trp Gly Val Phe Asn Glu Tyr Asn Asn Asp Glu Lys Phe Tyr
165 170 175Leu Ser Lys Gly Lys Pro Gln Ala Val Arg Cys Ser Ala Ala Ile Thr180 185 190Gly Lys Asn Gln Val Arg Arg Cys Gln Gly Gly Ser Cys Ile Thr Asn195 200 205Gly Lys Cys Val Ile Asp Arg Val Thr Gly Leu Tyr Lys Asp Asn Cys210 215 220Val Phe Val Pro Asp Pro His Gln Asn Glu Lys Ala Ser Ile Met Phe225 230 235 240Asn Gln Asn Ile Asn Ser Val Val Glu Phe Cys Thr Glu Lys Asn His245 250 255Asn Gln Glu Ala Pro Asn Asp Gln Asn Gln Arg Cys Asn Leu Arg Ser260 265 270Thr Trp Glu Val Ile Gln Glu Ser Glu Asp Phe Lys Gln Thr Thr Pro275 280 285Met Thr Ala Gln Pro Pro Ala Pro Thr Phe Ser Leu Leu Gln Ile Gly290 295 300Gln Arg Ile Val Cys Leu Val Leu Asp Lys Ser Gly Ser Met Leu Asn305 310 315 320Asp Asp Arg Leu Asn Arg Met Asn Gln Ala Ser Arg Leu Phe Leu Leu325 330 335Gln Thr Val Glu Gln Gly Ser Trp Val Gly Met Val Thr Phe Asp Ser340 345 350Ala Ala Tyr Val Gln Ser Glu Leu Lys Gln Leu Asn Ser Gly Ala Asp355 360 365Arg Asp Leu Leu Ile Lys His Leu Pro Thr Val Ser Ala Gly Gly Thr370 375 380Ser Ile Cys Ser Gly Leu Arg Thr Ala Phe Thr Val Ile Lys Lys Lys385 390 395 400Tyr Pro Thr Asp Gly Ser Glu Ile Val Leu Leu Thr Asp Gly Glu Asp405 410 415Asn Thr Ile Ser Ser Cys Phe Asp Leu Val Lys Gln Ser Gly Ala Ile420 425 430Ile His Thr Val Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Lys Glu Leu Glu Gln435 440 445Leu Ser Lys Met Thr Gly Gly Leu Gln Thr Tyr Ser Ser Asp Gln Val450 455 460Gln Asn Asn Gly Leu Val Asp Ala Phe Ala Ala Leu Ser Ser Gly Asn465 470 475 480Ala Ala Ile Ala Gln His Ser Ile Gln Leu Glu Ser Arg Gly Val Asn485 490 495Leu Gln Asn Asn Gln Trp Met Asn Gly Ser Val Ile Val Asp Ser Ser500 505 510Val Gly Lys Asp Thr Leu Phe Leu Ile Thr Trp Thr Thr His Pro Pro
515 520 525Thr Ile Phe Ile Trp Asp Pro Ser Gly Val Glu Gln Asn Gly Phe Ile530 535 540Leu Asp Thr Thr Thr Lys Val Ala Tyr Leu Gln Val Pro Gly Thr Ala545 550 555 560Lys Val Gly Phe Trp Lys Tyr Ser Ile Gln Ala Ser Ser Gln Thr Leu565 570 575Thr Leu Thr Val Thr Ser Arg Ala Ala Ser Ala Thr Leu Pro Pro Ile580 585 590Thr Val Thr Pro Val Val Asn Lys Asn Thr Gly Lys Phe Pro Ser Pro595 600 605Val Thr Val Tyr Ala Ser Ile Arg Gln Gly Ala Ser Pro Ile Leu Arg610 615 620Ala Ser Val Thr Ala Leu Ile Glu Ser Val Asn Gly Lys Thr Val Thr625 630 635 640Leu Glu Leu Leu Asp Asn Gly Ala Gly Ala Asp Ala Thr Lys Asn Asp645 650 655Gly Val Tyr Ser Arg Phe Phe Thr Ala Phe Asp Ala Asn Gly Arg Tyr660 665 670Ser Val Lys Ile Trp Ala Leu Gly Gly Val Thr Ser Asp Arg Gln Arg675 680 685Ala Ala Pro Pro Lys Asn Arg Ala Met Tyr Ile Asp Gly Trp Ile Glu690 695 700Asp Gly Glu Val Arg Met Asn Pro Pro Arg Pro Glu Thr Ser Tyr Val705 710 715 720Gln Asp Lys Gln Leu Cys Phe Ser Arg Thr Ser Ser Gly Gly Ser Phe725 730 735Val Ala Thr Asn Val Pro Ala Ala Ala Pro Ile Pro Asp Leu Phe Pro740 745 750Pro Cys Gln Ile Thr Asp Leu Lys Ala Ser Ile Gln Gly Gln Asn Leu755 760 765Val Asn Leu Thr Trp Thr Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Asp His Gly Arg770 775 780Ala Ser Asn Tyr Ile Ile Arg Met Ser Thr Ser Ile Val Asp Leu Arg785 790 795 800Asp His Phe Asn Thr Ser Leu Gln Val Asn Thr Thr Gly Leu Ile Pro805 810 815Lys Glu Ala Ser Ser Glu Glu Ile Phe Glu Phe Glu Leu Gly Gly Asn820 825 830Thr Phe Gly Asn Gly Thr Asp Ile Phe Ile Ala Ile Gln Ala Val Asp835 840 845Lys Ser Asn Leu Lys Ser Glu Ile Ser Asn Ile Ala Arg Val Ser Val850 855 860Phe Ile Pro Ala Gln Glu Pro Pro Ile Pro Glu Asp Ser Thr Pro Pro865 870 875 880Cys Pro Asp Ile Ser Ile Asn Ser Thr Ile Pro Gly Ile His Val Leu885 890 895Lys Ile Met Trp Lys Trp Leu Gly Glu Met Gln Val Thr Leu Gly Leu900 905 910His913<210>2<211>914<212>PRT<213>人<400>2Met Gly Pro Phe Lys Ser Ser Val Phe Ile Leu Ile Leu His Leu Leu5 10 15Glu Gly Ala Leu Ser Asn Ser Leu Ile Gln Leu Asn Asn Asn Gly Tyr20 25 30Glu Gly Ile Val Val Ala Ile Asp Pro Asn Val Pro Glu Asp Glu Thr35 40 45Leu Ile Gln Gln Ile Lys Asp Met Val Thr Gln Ala Ser Leu Tyr Leu50 55 60Phe Glu Ala Thr Gly Lys Arg Phe Tyr Phe Lys Asn Val Ala Ile Leu65 70 75 80Ile Pro Glu Thr Trp Lys Thr Lys Ala Asp Tyr Val Arg Pro Lys Leu85 90 95Glu Thr Tyr Lys Asn Ala Asp Val Leu Val Ala Glu Ser Thr Pro Pro100 105 110Gly Asn Asp Glu Pro Tyr Thr Glu Gln Met Gly Asn Cys Gly Glu Lys115 120 125Gly Glu Arg Ile His Leu Thr Pro Asp Phe Ile Ala Gly Lys Lys Leu130 135 140Ala Glu Tyr Gly Pro Gln Gly Lys Ala Phe Val His Glu Trp Ala His145 150 155 160Leu Arg Trp Gly Val Phe Asp Glu Tyr Asn Asn Asp Glu Lys Phe Tyr165 170 175Leu Ser Asn Gly Arg Ile Gln Ala Val Arg Cys Ser Ala Gly Ile Thr180 185 190Gly Thr Asn Val Val Lys Lys Cys Gln Gly Gly Ser Cys Tyr Thr Lys195 200 205Arg Cys Thr Phe Asn Lys Val Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Gly Cys Glu2l0 2l5 220Phe Val Leu Gln Ser Arg Gln Thr Glu Lys Ala Ser Ile Met Phe Ala225 230 235 240Gln His Val Asp Ser Ile Val Glu Phe Cys Thr Glu Gln Asn His Asn245 250 255Lys Glu Ala Pro Asn Lys Gln Asn Gln Lys Cys Asn Leu Arg Ser Thr260 265 270Trp Glu Val Ile Arg Asp Ser Glu Asp Phe Lys Lys Thr Thr Pro Met275 280 285Thr Thr Gln Pro Pro Asn Pro Thr Phe Ser Leu Leu Gln Ile Gly Gln290 295 300Arg Ile Val Cys Leu Val Leu Asp Lys Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly305 310 315 320Asn Arg Leu Asn Arg Leu Asn Gln Ala Gly Gln Leu Phe Leu Leu Gln325 330 335Thr Val Glu Leu Gly Ser Trp Val Gly Met Val Thr Phe Asp Ser Ala340 345 350Ala His Val Gln Ser Glu Leu Ile Gln Ile Asn Ser Gly Ser Asp Arg355 360 365Asp Thr Leu Ala Lys Arg Leu Pro Ala Ala Ala Ser Gly Gly Thr Ser370 375 380Ile Cys Ser Gly Leu Arg Ser Ala Phe Thr Val Ile Arg Lys Lys Tyr385 390 395 400Pro Thr Asp Gly Ser Glu Ile Val Leu Leu Thr Asp Gly Glu Asp Asn405 410 415Thr Ile Ser Gly Cys Phe Asn Glu Val Lys Gln Ser Gly Ala Ile Ile420 425 430His Thr Val Ala Leu Gly Pro Ser Ala Ala Gln Glu Leu Glu Glu Leu435 440 445Ser Lys Met Thr Gly Gly Leu Gln Thr Tyr Ala Ser Asp Gln Val Gln450 455 460Asn Asn Gly Leu Ile Asp Ala Phe Gly Ala Leu Ser Ser Gly Asn Gly465 470 475 480Ala Val Ser Gln Arg Ser Ile Gln Leu Glu Ser Lys Gly Leu Thr Leu485 490 495Gln Asn Ser Gln Trp Met Asn Gly Thr Val Ile Val Asp Ser Thr Val500 505 510Gly Lys Asp Thr Leu Phe Leu Ile Thr Trp Thr Thr Gln Pro Pro Gln515 520 525Ile Leu Leu Trp Asp Pro Ser Gly Gln Lys Gln Gly Gly Phe Val Val530 535 540Asp Lys Asn Thr Lys Met Ala Tyr Leu Gln Ile Pro Gly Ile Ala Lys545 550 555 560Val Gly Thr Trp Lys Tyr Ser Leu Gln Ala Ser Ser Gln Thr Leu Thr565 570 575Leu Thr Val Thr Ser Arg Ala Ser Asn Ala Thr Leu Pro Pro Ile Thr580 585 590Val Thr Ser Lys Thr Asn Lys Asp Thr Ser Lys Phe Pro Ser Pro Leu595 600 605Val Val Tyr Ala Asn Ile Arg Gln Gly Ala Ser Pro Ile Leu Arg Ala610 615 620Ser Val Thr Ala Leu Ile Glu Ser Val Asn Gly Lys Thr Val Thr Leu625 630 635 640Glu Leu Leu Asp Asn Gly Ala Gly Ala Asp Ala Thr Lys Asp Asp Gly645 650 655Val Tyr Ser Arg Tyr Phe Thr Thr Tyr Asp Thr Asn Gly Arg Tyr Ser660 665 670Val Lys Val Arg Ala Leu Gly Gly Val Asn Ala Ala Arg Arg Arg Val675 680 685Ile Pro Gln Gln Ser Gly Ala Leu Tyr Ile Pro Gly Trp Ile Glu Asn690 695 700Asp Glu Ile Gln Trp Asn Pro Pro Arg Pro Glu Ile Asn Lys Asp Asp705 710 715 720Val Gln His Lys Gln Val Cys Phe Ser Arg Thr Ser Ser Gly Gly Ser725 730 735Phe Val Ala Ser Asp Val Pro Asn Ala Pro Ile Pro Asp Leu Phe Pro740 745 750Pro Gly Gln Ile Thr Asp Leu Lys Ala Glu Ile His Gly Gly Ser Leu755 760 765Ile Asn Leu Thr Trp Thr Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Asp His Gly Thr770 775 780Ala His Lys Tyr Ile Ile Arg Ile Ser Thr Ser Ile Leu Asp Leu Arg785 790 795 800Asp Lys Phe Asn Glu Ser Leu Gln Val Asn Thr Thr Ala Leu Ile Pro805 810 815Lys Glu Ala Asn Ser Glu Glu Val Phe Leu Phe Lys Pro Glu Asn Ile820 825 830Thr Phe Glu Asn Gly Thr Asp Leu Phe Ile Ala Ile Gln Ala Val Asp835 840 845Lys Val Asp Leu Lys Ser Glu Ile Ser Asn Ile Ala Arg Val Ser Leu850 855 860Phe Ile Pro Pro Gln Thr Pro Pro Glu Thr Pro Ser Pro Asp Glu Thr865 870 875 880Ser Ala Pro Cys Pro Asn Ile His Ile Asn Ser Thr Ile Pro Gly Ile885 890 895His Ile Leu Lys Ile Met Trp Lys Trp Ile Gly Glu Leu Gln Leu Ser900 905 910Ile Ala914<210>3<211>2739<212>DNA<213>小鼠<400>3atggaatctt tgaagagtcc tgtcttcctc ttgatcctcc accttctgga aggagttctg60agtgagtccc tcatccaact gaacaacaac ggctatgagg gcatcgtcat cgccatagac 120cacgacgtgc cggaagatga agccctcatt caacacataa aggacatggt gactcaggcc 180tctccatacc tgtttgaagc tacaggaaaa agattttact tcaaaaatgt tgccattttg 240attcccgaga gctggaaggc aaagcctgaa tatacgaggc caaaacttga aaccttcaaa 300aacgctgatg tccttgtatc aacaaccagc cctctaggca atgatgagcc ctacaccgaa 360catataggag catgtggaga aaaggggatc aggattcacc tgactcctga cttcttagca 420ggaaagaagc tgactcagta tgggccacaa gacaggacct ttgtccatga gtgggctcac 480ttccgatggg gagtgtttaa tgaatacaac aacgacgaga agttctactt atccaaagga 540aaaccccaag cagtgaggtg ttcagcagcc attaccggta aaaatcaagt tcgtcggtgc 600cagggaggca gttgtatcac taacggaaag tgtgtaatcg acagagtaac gggactgtat 660aaagacaatt gtgtatttgt accagatcca caccaaaacg agaaggcttc catcatgttt 720aaccaaaata tcaattctgt ggttgaattc tgtacagaaa aaaatcacaa tcaagaagcc 780ccaaatgacc aaaaccaacg atgcaatctc cgaagcacgt gggaagtcat ccaggaatct 840gaggacttca agcaaaccac tcccatgaca gcccagccac ctgcacccac cttctcactg 900ctgcaaattg gacaaagaat tgtgtgctta gttcttgata agtccgggag catgctgaac 960gatgatcgtc ttaaccgaat gaatcaggca agccggcttt tcctgctgca gactgtggag 1020cagggatcct gggtcgggat ggtgaccttt gacagtgctg cctatgtaca aagcgaactc 1080aaacagttaa acagtggtgc tgacagagat ctgctgatca agcacttacc cacagtatct 1140gcaggaggga catctatatg ctctggcctt cggacagcat ttacagtgat aaagaagaag 1200tatccaactg atggatctga aattgtgctg ctgaccgatg gggaggacaa caccattagc 1260agctgctttg acctggtgaa gcagagcggg gccatcatcc atacagtggc cctgggaccg 1320gctgccgcta aagagcttga gcagctgtcc aaaatgacag gaggcctgca gacatactct 1380tcggatcagg ttcagaacaa tggtcttgtt gatgctttcg cagcactctc ctcaggaaat 1440gcggcgatcg ctcagcactc catccagctg gagagcaggg gagttaatct ccagaataac 1500caatggatga atggctcagt gatcgtggac agctcggtgg gcaaggacac cttgtttctt 1560atcacctgga caacgcatcc tcctacaata tttatctggg atcccagcgg agtggaacaa 1620aatggtttta tactagacac aaccactaag gtggcctacc tccaagtccc aggcacggct 1680aaggttggct tttggaaata cagcattcaa gcgagctcac agactctcac cttgactgtc 1740acctcccgtg cagcaagtgc tacactgcct cctattacag tgaccccggt agtgaataag 1800aacacaggga aattccccag ccctgtaaca gtgtatgcaa gcattcgcca aggagcctcg 1860cctattctca gggccagcgt cacagccttg attgaatctg tgaatggaaa aacagtaacc 1920ctggaattac tggataacgg agcaggtgcc gatgccacca agaatgatgg tgtctactca 1980aggtttttta cagcttttga tgcaaatggt agatacagcg ttaaaatatg ggctctggga 2040ggagtcactt cagacagaca gagagcagca cctccgaaga acagagccat gtacatagat 2100ggctggattg aggatggtga agtaagaatg aacccaccac gtcctgaaac tagttatgtt 2160caagacaagc agctgtgctt cagcaggaca tcttcagggg gatcgtttgt ggccaccaat 2220gtccccgcag cagctcccat tcctgacctc tttccaccct gtcaaatcac tgacctgaag 2280gccagcatcc aagggcagaa cctggtgaat ctgacgtgga cggctcctgg ggatgactac 2340gaccacggga gagcttccaa ctacatcatc cgaatgagca ccagtatcgt tgatctcagg 2400gaccacttca acacctcact ccaagtgaac actaccggtc ttatccccaa agaggccagc 2460tctgaggaaa tctttgagtt tgaactggga ggcaacactt ttggaaatgg cacagatatc 2520ttcattgcta tccaggctgt ggataagtcc aatctgaaat cagaaatctc caacattgca 2580cgggtgtctg tgttcatccc cgctcaggag ccgcccattc ccgaagactc aactccccct 2640tgtcctgaca tcagcatcaa cagcaccatt cctggcatcc acgtgctgaa gataatgtgg 2700aagtggctag gggaaatgca ggtgacacta ggtttgcac 2739<210>4<211>2742<212>DNA<213>人<400>4atggggccat ttaagagttc tgtgttcatc ttgattcttc accttctaga aggggccctg 60agtaattcac tcattcagct gaacaacaat ggctatgaag gcattgtcgt tgcaatcgac120cccaatgtgc cagaagatga aacactcatt caacaaataa aggacatggt gacccaggca180tctctgtatc tgtttgaagc tacaggaaag cgattttatt tcaaaaatgt tgccattttg240attcctgaaa catggaagac aaaggctgac tatgtgagac caaaacttga gacctacaaa300aatgctgatg ttctggttgc tgagtctact cctccaggta atgatgaacc ctacactgag360cagatgggca actgtggaga gaagggtgaa aggatccacc tcactcctga tttcattgca420ggaaaaaagt tagctgaata tggaccacaa ggtaaggcat ttgtccatga gtgggctcat480ctacgatggg gagtatttga cgagtacaat aatgatgaga aattctactt atccaatgga540agaatacaag cagtaagatg ttcagcaggt attactggta caaatgtagt aaagaagtgt600cagggaggca gctgttacac caaaagatgc acattcaata aagttacagg actctatgaa660aaaggatgtg agtttgttct ccaatcccgc cagacggaga aggcttctat aatgtttgca720caacatgttg attctatagt tgaattctgt acagaacaaa accacaacaa agaagctcca780aacaagcaaa atcaaaaatg caatctccga agcacatggg aagtgatccg tgattctgag840gactttaaga aaaccactcc tatgacaaca cagccaccaa atcccacctt ctcattgctg900cagattggac aaagaattgt gtgtttagtc cttgacaaat ctggaagcat ggcgactggt960aaccgcctca atcgactgaa tcaagcaggc cagcttttcc tgctgcagac agttgagctg 1020gggtcctggg ttgggatggt gacatttgac agtgctgccc atgtacaaag tgaactcata 1080cagataaaca gtggcagtga cagggacaca ctcgccaaaa gattacctgc agcagcttca 1140ggagggacgt ccatctgcag cgggcttcga tcggcattta ctgtgattag gaagaaatat 1200ccaactgatg gatctgaaat tgtgctgctg acggatgggg aagacaacac tataagtggg 1260tgctttaacg aggtcaaaca aagtggtgcc atcatccaca cagtcgcttt ggggccctct 1320gcagctcaag aactagagga gctgtccaaa atgacaggag gtttacagac atatgcttca 1380gatcaagttc agaacaatgg cctcattgat gcttttgggg ccctttcatc aggaaatgga 1440gctgtctctc agcgctccat ccagcttgag agtaagggat taaccctcca gaacagccag 1500tggatgaatg gcacagtgat cgtggacagc accgtgggaa aggacacttt gtttcttatc 1560acctggacaa cgcagcctcc ccaaatcctt ctctgggatc ccagtggaca gaagcaaggt 1620ggctttgtag tggacaaaaa caccaaaatg gcctacctcc aaatcccagg cattgctaag 1680gttggcactt ggaaatacag tctgcaagca agctcacaaa ccttgaccct gactgtcacg 1740tcccgtgcgt ccaatgctac cctgcctcca attacagtga cttccaaaac gaacaaggac 1800accagcaaat tccccagccc tctggtagtt tatgcaaata ttcgccaagg agcctcccca 1860attctcaggg ccagtgtcac agccctgatt gaatcagtga atggaaaaac agttaccttg 1920gaactactgg ataatggagc aggtgctgat gctactaagg atgacggtgt ctactcaagg 1980tatttcacaa cttatgacac gaatggtaga tacagtgtaa aagtgcgggc tctgggagga 2040gttaacgcag ccagacggag agtgataccc cagcagagtg gagcactgta catacctggc 2100tggattgaga atgatgaaat acaatggaat ccaccaagac ctgaaattaa taaggatgat 2160gttcaacaca agcaagtgtg tttcagcaga acatcctcgg gaggctcatt tgtggcttct 2220gatgtcccaa atgctcccat acctgatctc ttcccacctg gccaaatcac cgacctgaag 2280gcggaaattc acgggggcag tctcattaat ctgacttgga cagctcctgg ggatgattat 2340gaccatggaa cagctcacaa gtatatcatt cgaataagta caagtattct tgatctcaga 2400gacaagttca atgaatctct tcaagtgaat actactgctc tcatcccaaa ggaagccaac 2460tctgaggaag tctttttgtt taaaccagaa aacattactt ttgaaaatgg cacagatctt 2520ttcattgcta ttcaggctgt tgataaggtc gatctgaaat cagaaatatc caacattgca 2580cgagtatctt tgtttattcc tccacagact ccgccagaga cacctagtcc tgatgaaacg 2640tctgctcctt gtcctaatat tcatatcaac agcaccattc ctggcattca cattttaaaa 2700attatgtgga agtggatagg agaactgcag ctgtcaatag cc 2742<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gggaaagctg caggatggaa tc 22<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6tataccgccc cctacaggaa gtctaa 26<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ctacgaccac gggagagctt c21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8gaagctctcc cgtggtcgta g21<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9caatgatgag ccctacaccg aaca 24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10tgttcggtgt agggctcatc attg 24<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11accactccca tgacagccca g 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12ctgggctgtc atgggagtgg t 21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13tggccttcgg acagcattta ca 22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14tgtaaatgct gtccgaaggc ca 22<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15atgcgttgtc caggtgataa gaaa24<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16ggtggcctac ctccaagtcc caggcac 27<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17cccgtgcagc aagtgctaca ctgcctcc28<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18ggaggcagtg tagcacttgc tgcacggg28<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19cgccaaggag cctcgcctat tctcaggg28<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20aggctgtgac gctggccctg agaatag 27<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21cttggtggca tcggcacctg ctccg 25<210>22<211>2843<212>DNA<213>小鼠<400>22gggaaagctg caggatggaa tctttgaaga gtcctgtctt cctcttgatc ctccaccttc 60tggaaggagt tctgagtgag tccctcatcc aactgaacaa caacggctat gagggcatcg 120tcatcgccat agaccacgac gtgccggaag atgaagccct cattcaacac ataaaggaca 180tggtgactca ggcctctcca tacctgtttg aagctacagg aaaaagattt tacttcaaaa 240atgttgccat tttgattccc gagagctgga aggcaaagcc tgaatatacg aggccaaaac 300ttgaaacctt caaaaacgct gatgtccttg tatcaacaac cagccctcta ggcaatgatg 360agccctacac cgaacatata ggagcatgtg gagaaaaggg gatcaggatt cacctgactc 420ctgacttctt agcaggaaag aagctgactc agtatgggcc acaagacagg acctttgtcc 480atgagtgggc tcacttccga tggggagtgt ttaatgaata caacaacgac gagaagttct 540acttatccaa aggaaaaccc caagcagtga ggtgttcagc agccattacc ggtaaaaatc 600aagttcgtcg gtgccaggga ggcagttgta tcactaacgg aaagtgtgta atcgacagag 660taacgggact gtataaagac aattgtgtat ttgtaccaga tccacaccaa agcgagaagg 720cttccatcat gtttaaccaa aatatcaatt ctgtggttga attctgtaca gaaaaaaatc 780acaatcaaga agccccaaat gaccaaaacc aacgatgcaa tctccgaagc acgtgggaag 840tcatccagga atctgaggac ttcaagcaaa ccactcccat gacagcccag ccacctgcac 900ccaccttctc actgctgcaa attggacaaa gaattgtgtg cttagttctt gataagtccg 960ggagcatgct gaacgatgat cgtcttaacc gaatgaatca ggcaagccgg cttttcctgc 1020tgcagactgt ggagcaggga tcctgggtcg ggatggtgac ctttgacagt gctgcctatg 1080tacaaagcga actcaaacag ttgaacagtg gtgctgacag agatctgctg atcaagcact 1140tacccacagt atctgcagga gggacatcta tatgctctgg ccttcggaca gcatttacag 1200tgataaagaa gaagtatcca actgatggat ctgaaattgt gctgctgacc gatggggagg 1260acaacaccat tagcagctgc tttgacctgg tgaagcagag cggggccatc atccatacag 1320tggccctggg accggctgcc gctaaagagc ttgagcagct gtccaaaatg acaggaggcc 1380tgcagacata ctcttcggat caggttcaga acaatggtct tgttgatgct ttcgcagcac 1440tctcctcagg aaatgcggcg atcgctcagc actccatcca gctggagagc aggggagtta 1500atctccagaa taaccaatgg atgaatggct cagtgatcgt ggacagctcg gtgggcaagg 1560acaccttgtt tcttatcacc tggacaacgc atcctcctac aatatttatc tgggatccca 1620gcggagtgga acaaaatggt tttatactag acacggccac taaggtggcc tacctccaag 1680tcccaggcac ggctaaggtt ggcttttgga aatacagcat tcaagcgagc tcacagactc 1740tcaccttgac tgtcacctcc cgtgcagcaa gtgctacact gcctcctatt acagtgaccc 1800cggtagtgaa taagaacaca gggaaattcc ccagccctgt aacagtgtat gcaagcattc 1860gccaaggagc ctcgcctatt ctcagggcca gcgtcacagc cttgattgaa tctgtgaatg 1920gaaaagcagt ggccctggaa ttactggata acggagcagg tgccgatgcc accaagaatg 1980atggtgtcta ctcaaggttt tttacagctt ttgatgcaaa tggtagatac agcgttaaaa 2040tatgggctct gggaggagtc acttcagaca gacagagagc agcacctccg aagaacagag 2100ccatgtacat agarggctgg attgaggatg gtgaagtaag aatgaaccca ccacgtcctg 2160agactagtta tgttcaagac aagcagctgt gcttcagcag gacatcttca gggggatcgt 2220ttgtggccac caatgtcccc gcagcagctc ccattcctga cctctttcca ccctgtcaaa 2280tcactgacct gaaggccagc atccaagggc agaacctggt gaatctgacg tggacggctc 2340ctggggatga ctacgaccac gggagagctt ccaactacat catccgaatg agcaccagta 2400tcgttgatct cagggaccac ttcaacacct cactccaagt gaacactacc ggtcttatcc 2460ccaaagaggc cagctctgag gaaatctttg agtttgaact gggaggcaac acttttggaa 2520atggcacaga tatcttcatt gctatccagg ctgtggataa gtccaatctg aaatcagaaa 2580tctccaacat tgcacgggtg tctgtgttca tccccgctca ggagccgccc attcccgaag 2640actcgactcc cccttgtcct gacatcagca tcaacagcac cattcctggc atccacgtgc 2700tgaagataat gtggaagtgg ctaggggaaa tgcaggtgac actaggtttg cactgaattt 2760tcaggcaaga aatcaaccag tcattccttt cactggagaa ttttctaaaa atgtacttta 2820gacttcctgt agggggcggt ata 2843<210>23<211>486<212>DNA<213>小鼠<400>23agcggagtgg aacaaaatgg ttttatacta gacacaacca ctaaggtggc ctacctccaa 60gtcccaggca cggctaaggt tggcttttgg aaatacagca ttcaagcgag ctcacagact 120ctcaccttga ctgtcacctc ccgtgcagca agtgctacac tgcctcctat tacagtgacc 180ccggtagtga ataagaacac agggaaattc cccagccctg taacagtgta tgcaagcatt 240cgccaaggag cctcgcctat tctcagggcc agcgtcacag ccttgattga atctgtgaat 300ggaaaaacag taaccctgga attactggat aacggagcag gtgccgatgc caccaagaat 360gatggtgtct actcaaggtt ttttacagct tttgatgcaa atggtagata cagcgttaaa 420atatgggctc tgggaggagt cacttcagac agacagagag cagcacctcc gaagaacaga 480gccatg 486<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24aatcacaggg agatgtacag c 21<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25ttttataatc aaaaaaagga tg22<210>26<211>2825<212>DNA<213>人<400>26aatcacaggg agatgtacag caatggggcc atttaagagt tctgtgttca tcttgattct 60tcaccttcta gaaggggccc tgagtaattc actcattcag ctgaacaaca atggctatga 120aggcattgtc gttgcaatcg accccaatgt gccagaagat gaaacactca ttcaacaaat 180aaaggacatg gtgacccagg catctctgta tctgtttgaa gctacaggaa agcgatttta 240tttcaaaaat gttgccattt tgattcctga aacatggaag acaaaggctg actatgtgag 300accaaaactt gagacctaca aaaatgctga tgttctggtt gctgagtcta ctcctccagg 360taatgatgaa ccctacactg agcagatggg caactgtgga gagaagggtg aaaggatcca 420cctcactcct gatttcattg caggaaaaaa gttagctgaa tatggaccac aaggtagggc 480atttgtccat gagtgggctc atctacgatg gggagtattt gacgagtaca ataatgatga 540gaaattctac ttatccaatg gaagaataca agcagtaaga tgttcagcag gtattactgg 600tacaaatgta gtaaagaagt gtcagggagg cagctgttac accaaaagat gcacattcaa 660taaagttaca ggactctatg aaaaaggatg tgagtttgtt ctccaatccc gccagacgga 720gaaggcttct ataatgtttg cacaacatgt tgattctata gttgaattct gtacagaaca 780aaaccacaac aaagaagctc caaacaagca aaatcaaaaa tgcaatctcc gaagcacatg 840ggaagtgatc cgtgattctg aggactttaa gaaaaccact cctatgacaa cacagccacc 900aaatcccacc ttctcattgc tgcagattgg acaaagaatt gtgtgtttag tccttgacaa 960atctggaagc atggcgactg gtaaccgcct caatcgactg aatcaagcag gccagctttt 1020cctgctgcag acagttgagc tggggtcctg ggttgggatg gtgacatttg acagtgctgc 1080ccatgtacaa agtgaactca tacagataaa cagtggcagt gacagggaca cactcgccaa 1140aagattacct gcagcagctt caggagggac gtccatctgc agcgggcttc gatcggcatt 1200tactgtgatt aggaagaaat atccaactga tggatctgaa attgtgctgc tgacggatgg 1260ggaagacaac actataagtg ggtgctttaa cgaggtcaaa caaagtggtg ccatcatcca 1320cacagtcgct ttggggccct ctgcagctca agaactagag gagctgtcca aaatgacagg 1380aggtttacag acatatgctt cagatcaagt tcagaacaat ggcctcattg atgcttttgg 1440ggccctttca tcaggaaatg gagctgtctc tcagcgctcc atccagcttg agagtaaggg 1500attaaccctc cagaacagcc agtggatgaa tggcacagtg atcgtggaca gcaccgtggg 1560aaaggacact ttgtttctta tcacctggac aacgcagcct ccccaaatcc ttctctggga 1620tcccagtgga cagaagcaag gtggctttgt agtggacaaa aacaccaaaa tggcctacct 1680ccaaatccca ggcattgcta aggttggcac ttggaaatac agtctgcaag caagctcaca 1740aaccttgacc ctgactgtca cgtcccgtgc gtccaatgct accctgcctc caattacagt 1800gacttccaaa acgaacaagg acaccagcaa attccccagc cctctggtag tttatgcaaa 1860tattcgccaa ggagcctccc caattctcag ggccagtgtc acagccctga ttgaatcagt 1920gaatggaaaa acagttacct tggaactact ggataatgga gcaggtgctg atgctactaa 1980ggatgacggt gtctactcaa ggtatttcac aacttatgac acgaatggta gatacagtgt 2040aaaagtgcgg gctctgggag gagttaacgc agccagacgg agagtgatac cccagcagag 2100tggagcactg tacatacctg gctggattga gaatgatgaa atacaatgga atccaccaag 2160acctgaaatt aataaggatg atgttcaaca caagcaagtg tgtttcagca gaacatcctc 2220gggaggctca tttgtggctt ctgatgtccc aaatgctccc atacctgatc tcttcccacc 2280tggccaaatc accgacctga aggcggaaat tcacgggggc agtctcatta atctgacttg 2340gacagctcct ggggatgatt atgaccatgg aacagctcac aagtatatca ttcgaataag 2400tacaagtatt cttgatctca gagacaagtt caatgaatct cttcaagtga atactactgc 2460tctcatccca aaggaagcca actctgagga agtctttttg tttaaaccag aaaacattac 2520ttttgaaaat ggcacagatc ttttcattgc tattcaggct gttgataagg tcgatctgaa 2580atcagaaata tccaacattg cacgagtatc tttgtttatt cctccacaga ctccgccaga 2640gacacctagt cctgatgaaa cgtctgctcc ttgtcctaat attcatatca acagcaccat 2700tcctggcatt cacattttaa aaattatgtg gaagtggata ggagaactgc agctgtcaat 2760agcctagggc tgaatttttg tcagataaat aaaataaatc attcatcctt tttttgatta 2820taaaa 2825<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27aaggtaaggc atttgtccat20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>28atggacaaat gccttacctt20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29gaagcatggc gactggtaac20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30gttaccagtc gccatgcttc20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>31tccatccagc ttgagagtaa20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>32ttactctcaa gctggatgga20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>33tgatgctact aaggatgacg20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>34cgtcatcctt agtagcatca20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>35aggaagccaa ctctgaggaa20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>36ttcctcagag ttggcttcct20<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>37ctgatgttct ggttgctgag t 21<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>38ttggagcttc tttgttgtgg20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>反义<400>39gactcttcaa agattccatc20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>反义<400>40gagtcatctt agtttcgttc20
权利要求
1.一种反义核苷酸，其具有与编码蛋白质或其部分肽的DNA序列互补或基本互补的碱基序列，所述蛋白质或其部分肽含有与SEQ IDNO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
2.权利要求1所述的反义核苷酸，其中与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列为SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的反义核苷酸，其具有与SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示碱基序列互补的序列或互补的部分碱基序列。
4.一种药物，其中包含权利要求1所述的反义核苷酸。
5.权利要求4所述的药物，其为预防或治疗支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物。
6.一种含有抗体的诊断试剂，所述抗体是针对含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐。
7.一种用于筛选化合物或其盐的方法，所述化合物或其盐具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性，它们含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列，所述筛选法的特征为，应用含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐。
8.权利要求7所述的筛选方法，其中所述含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐，是通过编码含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐的DNA，通过该DNA进行基因转导形成的转化体并在转化体细胞膜上进行表达。
9.一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，所述化合物或其盐具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性，它们含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列，所述筛选用试剂盒的特征为，其中包含与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐。
10.一种化合物或其盐，其具有抑制含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐的活性，该化合物或其盐可通过权利要求7所述的筛选方法或权利要求9所述的筛选用试剂盒而获得。
11.一种药物，其中包含具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐活性的化合物或其盐，所述蛋白质或其部分肽或其盐含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，所述化合物或其盐可通过权利要求7所述的筛选方法或权利要求9所述的筛选用试剂盒而获得。
12.权利要求11所述的药物是用于治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物。
13.一种用于治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物，其中包括具有抑制钙依赖性氯离子通道作用的化合物或其盐。
14.一种治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，将权利要求1所述反义核苷酸投药于哺乳动物。
15.权利要求1所述的反义核苷酸作为制备治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物的应用。
16.一种治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，将具有抑制与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐活性的化合物或其盐投药于哺乳动物，所述化合物或其盐可通过权利要求7所述的筛选方法或权利要求9所述的筛选用试剂盒而获得。
17.具有抑制与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐活性的化合物或其盐作为制备治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物的应用，所述化合物或其盐可通过权利要求7所述的筛选方法或权利要求9所述的筛选用试剂盒而获得。
18.一种治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，将具有抑制钙依赖性氯离子通道作用的化合物或其盐投药于哺乳动物。
19.具有抑制钙依赖性氯离子通道作用的化合物或其盐作为制备治疗或预防支气管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的药物的应用。
全文摘要
本发明提供针对与疾病相关的基因的反义DNA;含有该反义DNA的药物;针对与疾病相关的基因产物的抗体;含有该抗体的诊断药物;筛选具有抑制与疾病相关的基因产物活性的化合物的方法;通过该筛选方法获得的化合物等。能够抑制具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质活性的化合物或其盐以及能够抑制该蛋白质活性的中和抗体,可用作治疗或预防如支气管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等的药物。反义DNA还可抑制蛋白质表达,该蛋白质具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列,因此,反义DNA可用作治疗或预防,如支气管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等的药物。
文档编号C07K14/435GK1390255SQ00815618
公开日2003年1月8日 申请日期2000年11月22日 优先权日1999年11月24日
发明者中西淳, 森田滋 申请人:武田药品工业株式会社