一种阿尔茨海默氏病易感基因检测分型试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种检验技术领域，具体是一种阿尔茨海默氏病易感基因检测分型试剂盒及其应用。

背景技术：

随着人类基因组计划(humangenomeproject，hgp)的完成，大量疾病相关基因的发现，促进了传统生物医学模式向可预测性、可预防性、个体化和参与性的基因组医学模式转变，为未来发展预防、诊断、治疗长期困扰人类的诸如癌症、心脑血管疾病、糖尿病、神经和精神疾病等重大复杂性疾病开辟了新途径，也为基因科学的产业化提供了良好的机遇。

全基因组关联分析(genomewideassociationstudies，gwas)是应用人类基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)为标记进行病例一对照关联分析，即在一定人群中收集病例组和对照组dna，进行snps芯片扫描，采用关联分析比较受检snps标记的某一等位基因频率在病例组和对照组间有无显著性差异，筛选与疾病关联的基因序列变异，做出该snps是否与疾病关联的判断，预测疾病的患病率及风险。该方法研究前不需构建任何假设，不再局限于候选基因或候选染色体区域作为关联分析对象，而是针对基因组中所有snps，随机进行基因分型，分析snps与疾病的关联度，可在全基因组水平上，开展多中心、大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，全面及时疾病发生、发展和治疗的相关遗传基因。

目前发现遗传因素，或其与环境因素之间的相互作用参与了几乎所有的人类疾病的发生过程。一些复杂的疾病往往不是由单一基因突变引起的，其发生发展与多基因多位点变异有关，且这些位点的变异可能与环境因素相关，这些位点可提高或降低个体患某种疾病的相对风险，被称为该种疾病的易感位点。根据大量的gwas结果，已经发现并证明的一系列复杂疾病的易感位点已被普遍应用于基因检测领域。

阿尔茨海默症(alzheimer'sdisease,ad)隐匿起病，以进行性认知功能障碍、记忆力减退为主要表现的年龄相关的神经系统变性疾病，是老年期痴呆中最常见的类型。男女两性均对此病易感，以女性稍甚。该病患病率在老年人群中呈指数上升，65岁时患病率约1％，至95岁时达到40％-50％，目前已成为不断增长的威胁公众健康的流行疾患。晚发型ad(late-onsetalzheimer'sdisease,load)是指发病年龄大于65岁的患者，多无家族史。尽管ad的病因及发病机制尚未明了，但遗传因素在ad发病中的作用越来越受到人们的关注。发生在三个基因(app,psen1,psen2)中的突变可导致该病，而apoe4等位基因与患病的危险增加有关。随着人类基因组研究的进展，可能会有更多与该病相关的基因被发现。目前，应用遗传筛选测试，可以帮助阿尔茨海默氏病的高危人群更好地准备和应对未来可能发生的疾病。

cntnap2(contactin-associatedprotein-like2，接触蛋白相关蛋白样蛋白2)，位于7号染色体上，属于轴突蛋白家族成员，该基因编码的膜蛋白主要在神经系统中表达，在有髓鞘的神经纤维细胞的跳跃式神经冲动传导过程中发挥重要作用。logue等人的研究结果显示，cntnap2的基因多态性是ad的重要遗传风险因素，其中rs10273775的等位基因与load发病风险显著相关(loguemarkwetal.,acomprehensivegeneticassociationstudyofalzheimerdiseaseinafricanamericans.,archneurol68(12):1569-79)。

cr1(complementreceptor1，补体受体1)，又名c3b/c4b受体orcd35，属于补体激活的调控蛋白家族成员，定位于1号染色体“rca簇”区域。cr1分布广泛，能作为i因子介导c3b裂解的辅助因子，加速c3转化酶衰变，促进吞噬细胞对c3b/c4b所包被颗粒及免疫复合物的吞噬、激活和杀菌代谢。已经有研究发现转基因鼠过度表达c3能减少aβ的沉积和病理作用。相反，抑制c3转化酶的表达则加速aβ的沉积和神经退行性改变。aβ通过c3b介导与红细胞表面的cr1相结合，并最终被红细胞清除出循环系统。lambert等人的研究结果显示，cr1的基因多态性是高加索人患ad的重要遗传风险因素，rs6656401和rs3818361的等位基因是迟发型ad发病的危险因素。另外一项基因组研究显示，rs3818361也是欧洲和美洲人群发生ad的危险因素(haroldd,abrahamr,hollingworthpj.genome-wideassociatiedstudyidentifiesvariantsatcluandpicalmassociatedwithalzheimer'sdisease.natgenet,2009,41:1088-1093)。

lrat(lecithinretinolacyltransferase，卵磷脂-视黄醇酰基转移酶)，定位于色素上皮细胞的内质网膜上，其n端位于细胞质侧，c端位于内质网管腔侧，其功能是催化全反式视黄醛与磷脂胆碱进行酯化反应生成全反式视黄酯，因此对体内的维生素a代谢途径起重要作用。abrahamr等人的研究发现，位于lrat转录起始点上游13kb处的rs727153位点load有着显著的相关性，并通过更多覆盖lrat的snp位点，进一步确定了lrat为load的新的候选易感基因(abrahamr,moskvinav,simsretal.agenome-wideassociationstudyforlate-onsetalzheimer'sdiseaseusingdnapooling.bmcmedgenomics,2008sep29；1:44)。

因此，对cntnap2、cr1和lrat与阿尔茨海默氏病相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在阿尔茨海默氏病方面的遗传因素，评估阿尔茨海默氏病发病的相对风险，对于阿尔茨海默氏病早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义。同时还能辅助阿尔茨海默氏病的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种阿尔茨海默氏病易感基因检测分型试剂盒及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种阿尔茨海默氏病易感基因检测分型试剂盒，所述试剂盒中包括dna提取试剂盒、dna扩增试剂盒和测序试剂盒；所述dna提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的dp322型产品，所述dna扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)f：5'-ccagagacaaccagtgctca-3'，r：5'-aaatccaccctgctgtatgc-3',2)f：5'-ggcttagggtatgctcacca-3'，r：5'-tgagggactgcctctgtagg-3',3)f：5'-agatgaaaaggggccagatt-3',r：5'-tatccctgggcagttttgtc-3'；所述酶采用宝生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述测序试剂盒采用美国abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

作为本发明进一步的方案：所述扩增引物为基于基因cntnap2、cr1和lrat进行设计合成的。

一种阿尔茨海默氏病易感基因检测分型试剂盒的应用，具体步骤为：

(1)首先，将采集回来的样本按照dna提取试剂盒提取获得样本基因组dna；

(2)然后，将获得样本基因组dna使用dna扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；

(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；

(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/edta纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。

作为本发明进一步的方案：步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。

作为本发明进一步的方案：步骤(4)中乙醇/edta纯化具体为从pcr仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl0.125medta，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；pcr仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明制备出一种阿尔茨海默氏病易感基因检测分型试剂盒，对cntnap2、cr1和lrat与阿尔茨海默氏病相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在阿尔茨海默氏病方面的遗传因素，评估阿尔茨海默氏病发病的相对风险，对于阿尔茨海默氏病早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义；同时还能辅助阿尔茨海默氏病的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等；本专利产品采用基因检测领域的金标准——桑格测序法进行基因分型；桑格测序法是通过控制dna的合成来产生终止于靶序列特定位点的寡核苷酸片段；首先，合成的寡核苷酸引物同单链的dna模板退火，设立四种不同的测序反应，每一种反应中都含有dna聚合酶和四种正常的dntp；除此之外，还含有少量的有3'-h取代普通脱氧核糖3'-oh的2',3'-ddntp；若ddntp掺入到延伸中的dna链，由于缺少3'-oh将会阻断后续dntp形成磷酸二酯键，dna的进一步延伸被终止；使用四种不同的ddntp，产生的寡核苷酸将终止于每一个a,c,g或t在模板链上占据的位置，将四种反应产生的寡核苷酸加到测序仪中，由于寡核苷酸片段的大小不同，泳动的速率就不同，测序仪的图像控制器按照寡核苷酸经过的时间顺序，便可以检测出新合成链5'到3'的序列信息。

附图说明

图1为本发明的杂合型ag测序分型结果图；

图2为本发明的正常纯合型ct测序分型结果图；

图3为本发明的杂合型ag测序分型结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

一种阿尔茨海默氏病易感基因检测分型试剂盒，所述试剂盒中包括dna提取试剂盒、dna扩增试剂盒和测序试剂盒；所述dna提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的dp322型产品，所述dna扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)f：5'-ccagagacaaccagtgctca-3'(seqidno.1)，r：5'-aaatccaccctgctgtatgc-3'(seqidno.2),2)f：5'-ggcttagggtatgctcacca-3'(seqidno.3)，r：5'-tgagggactgcctctgtagg-3'(seqidno.4),3)f：5'-agatgaaaaggggccagatt-3'(seqidno.5),r：5'-tatccctgggcagttttgtc-3'(seqidno.6)；所述酶采用宝生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述测序试剂盒采用美国abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

所述扩增引物为基于基因cntnap2、cr1和lrat进行设计合成的；其中，检测的目标snp位点包括rs10273775、rs3818361和rs727153，这3个位点分别位于基因cntnap2、cr1和lrat。

一种阿尔茨海默氏病易感基因检测分型试剂盒的应用，具体步骤为：

(1)首先，将采集回来的样本按照dna提取试剂盒提取获得样本基因组dna；

(2)然后，将获得样本基因组dna使用dna扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；

(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；

(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/edta纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。

其中：

步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。

步骤(2)中使用dna扩增试剂盒进行扩增，扩增的反应体系为：

takarataqtm(5u/μl)1u

10×pcrbuffer(mg2+)5μl

dntpmixture(2.5mmeach)4μl

正向引物(10pmol/μl)0.5μl

反向引物(10pmol/μl)0.5μl

模板1μl

双蒸水upto50μl，

扩增程序为：

stage1:predegeneration

repeat:1time

95℃3minutes

stage2:pcrreaction

repeat:30cycles

95℃5second

55℃30second

72℃1minutes

stage3:finalextension

72℃5minutes。

步骤(2)中电泳检测和纯化，其中电泳检测具体步骤为：制备1％的琼脂糖凝胶：称一定量的琼脂糖粉加入对应体积的10×tae加热熔解琼脂糖，待其完全熔解后加入10000×goldviewⅰ。待胶凝固后，取5μl的pcr产物加入loadingbuffer混合后，点到胶孔内，120v定压，跑15min左右。在tgreentransilluminator内观察扩增产物的片段大小、单一性及扩增浓度；

其中纯化体系为：

pcr扩增后的反应液5μl

sap/cip(1u/μl)1μl

exoⅰ(5u/μl)1μl

ddh2o3μl，

其中纯化反应程序为：

37℃30minutes

75℃15minutes。

步骤(3)中的桑格测序反应，反应体系为：

bigdye混合液1μl

测序引物(3.2pmol/μl)1μl

模板(纯化产物)1μl

ddh2o2μl，

反应程序为：

stage1:1time

95℃2minutes

stage2:25cycles

95℃10second

50℃5second

60℃4minutes。

步骤(4)中乙醇/edta纯化具体为从pcr仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl0.125medta，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；pcr仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。

结果检测判定：

分型判定标准如下，见表1。

表1

其中rs10273775的杂合型ag、rs3818361的正常纯型ct和rs727153的杂合型ag，测序分型结果图，见图1-3.

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。