检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物检测技术，具体地说，设及一种检测水稻抗稻攝病基因 Pigm的引 物、试剂盒及基因分型方法。
【背景技术】
[0002] 由稻攝病菌(Magnapothe 0巧zae)引起的水稻稻攝病是对水稻生产危害最严重的 病害之一，每年可造成的10~30%减产。选育与利用抗病品种，是防治稻攝病最安全有效的 方法。经湖南稻攝病病圃多年鉴定，水稻品种"谷梅4号"一直为高抗品种。W "谷梅4号"为供 体，选育并推广的水稻品种已广泛应用于商业化育种中，其抗稻攝病性表现稳定高抗。
[0003] "谷梅4号"所携带的Pigm基因是抗谱广且抗性持久的基因之一。Pigm基因被定位 于水稻品种％梅4号"第6号染色体10367284~10421563的片段内。目前，用于检测该基因 的分子标记多为显性或非紧密连锁标记，检测结果易引起误判;检测过程中使用的EB或聚 炳締酷胺易对环境造成污染、对人体产生危害。开发与抗稻攝病基因 Pigm共分离的特异性 分子标记及建立高效、环境友好的相关检测体系，则对促进Pigm基因在商业化育种中的应 用具有重要意义。基于化qMan探针的基因分型方法是通过计算机记录并分析PCR过程中产 生的巧光信号，实现对突变位点监测。检测结果与表现型一致;检测过程无需电泳，彻底杜 绝了PCR产物的气溶胶污染和邸对环境的污染、甲醒对人体的危害。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度 高、特异性强和成本低的检测水稻抗稻攝病基因 Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0006] 本发明按照如下方法获取探针及引物：
[0007] a.采用植物DNA提取方法获得水稻基因组DNA，作为下游实验的模板；
[000引b.对多个水稻稻攝病抗性基因 Pigm的等位基因与"谷梅4号"近等基因系序列做比 对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因的1个碱基差异位点；
[0009] C.根据化qMan MGB探针的设计原理和设计方法，针对上述位点设计化qMan MGB分 型探针、引物；
[0010] d.对所设计的探针、引物进行筛选，从中筛选出优化地特异性探针、引物;并优化 出合适的PCR反应体系和反应条件。
[0011] 本发明选定的用于检测水稻抗稻攝病基因 Pigm的化qman定性基因型分析PCR引物 包括：
[0012] 上游引物S1806GC-F: 5' -ACTCCTTTCATCCCATAAAATACAAACGT-3' ；
[0013] 下游引物5180660尺：5'-〔60：1'(：了0：4641'176〔46了41'-3'。
[0014] 本发明选定的配合上述引物使用的探针包括：
[0015] S1806-VIC:5，-CCCAAATGTTAGAGATCATA-3,；
[0016] S1806-FAM:5 '-CCCAAATGTTAGACATCATA-3 '。
[0017] 其中，VIC、FAM均为巧光报告基团。
[0018] 本发明还提供了采用前述探针和引物制成的用于水稻抗稻攝病Pigm基因分型检 测的试剂盒。
[0019]进一步地，本发明还提供一种水稻抗稻攝病基因 Pigm的Taqman定性基因型分析方 法，该方法包括W下步骤：
[0020] 1)提取待测水稻的基因组DNA，调整浓度至20-25ngAil左右；
[0021] 2)利用前述探针和引物，通过化qMan实时巧光PCR仪ABI 7500对水稻基因组DNA进 行基因分型检测，获得多组分图谱和基因分型图;根据多组分图谱，判断是否有巧光信号收 集;根据基因分型图，判断基因类型：基因分型结果为GG或GC的水稻基因组，表明存在抗稻 攝病基因 Pigm。
[0022] 本发明优选的？〔1?反应体系^2〇41计为：2XTaqMan*?Genotyping Master Mix ΙΟμ l，20XTaqMan?SNPGenotypingAssayslμl，20-化ng/μlDNA化l，d地20补足至20μl。
[0023] 其中，TaqMan*?Genotyping Master MidRTaqManSSNP Genotyping 433日73分别自 ThermoFisher公司（产品编号4371353)及Invitrogen公司（产品编号4332077)购得。
[0024] 本发明优选的PCR反应程序为:95°C预变性10分钟;95°C变性15秒，56°C退火30秒， 72°C延伸1分钟，共40个循环;60°C保持1分钟。
[0025] 本发明还提供了前述试剂盒在水稻抗稻攝病Pigm基因分型检测中的应用。
[0026] 本发明还提供了前述引物和探针W及前述试剂盒在抗稻攝病水稻选育方面的应 用。
[0027] 本发明的有益效果在于：
[0028] 本发明提供了检测水稻抗稻攝病基因 Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法。采用 本发明的探针和引物进行TaqMan探针分型检测，每个实时巧光PCR反应中包括本发明的两 个引物和探针对，通过两种不同巧光物质进行双通道同步检测，实现对每个检测样品的SNP 位点的基因型判定，能够克服现有的形态学鉴定方法检测周期长、需要丰富经验和PCR、 RAPD、PCR-RFLP、Southern杂交等检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或 重复性不好等缺点，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染、甲醒对人体的危 害，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例5中利用标记S1806GC检测各供试水稻材料的基因分型图；其 中，GG为携带Pigm的检测结果，包括谷梅4号、谷梅2号及近等基因系B170、B195;CC为未携带 Pigm的检测结果，包括9113、38006、則128、黄华占、魔王谷、湘资3150、3168、〇111曰'、培5、 Y58S、广湘24S、广占63S、中广丝苗、3608、43024、〔8823、41555、明恢63、2855、1141、肌12、 1?299、11?24、2338、册11、9311;6坊1杂合的检测结果，谷梅4号与9311的混合0魁；国为空白对 照。
[0030] 图2为本发明实施例6中利用标记S1806GC检测近等基因系B170与R1128杂交后代 F2群体的基因分型图；其中，GG为携带Pigm的检测结果，包括11个个体;CC为未携带Pigm的 检测结果，包括7个个体;GC为杂合的检测结果，包括11个个体；·为空白对照。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是W下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可W对本发明进行各种修改和替换。
[0032] 若未特别指明，W下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手 册（化*￥〇'4:〔〇1(1591'；[]1旨化1'13〇1'1^日13〇^1:〇巧？'633,1989)中所述的操作技术规程，或 按照制造厂商所建议的实验条件;所用原料均为市售商品。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施例旨在说明本发明所述引物和探针的筛选过程
[0035] 1、实验材料及来源
[0036] 共选择10个供试水稻材料，具体为：谷梅4号、9311、R1128、黄华占、中广丝苗、 R608、华占 W及W谷梅4号为供体、9311为轮回亲本，经杂交、多代回交所得的近等基因系 B170、B195、Z2752(BC6F2单株）。其中，谷梅4号、B170、B195对稻攝病菌株67表现抗病，Z2752、 9311、R1128、黄华占、中广丝苗、R608、华占表现感病。W上材料均由湖南亚华种业科学研究 院提供。
[0037] 2、DNA 提取
[0038] 对10个供试材料，于幼苗期分别取少许叶片利用CTAB法提取基因组DNA。化ro化op 2000微量测量DM浓度，并将浓度调至50ngAU左右。
[0039] 3、测序及序列比对
[0040] 根据Pigm基因定位信息，在可能的抗病基元内设计多对引物，通过扩增、测序及拼 接，获得10个材料的等位片段序列；利用GeneDoc对序列进行比对分析，获得与表型一致的 SNP位点106个。
[0041] 4、探针合成及筛选
[0042] 根据Pita、PiK等功能SNP信息，选择5个SNP位点设计引物及探针，具体包括 81088了6、518066(：、5191464、51539061'及517137(：1'，其中，在51088了6、518066(：及51539061'位 点处合成引物与探针。通过对10个供试材料进行基因分型分析，发现S1088TG-FAM、 S15390GT-FAM及S15390GT-VIC均未能收集到巧光信号，因此，仅在SNP位点S1806GC处设计 并合成的引物及探针合适用于Pigm的基因型分析。
[0043] 实施例2-种用