一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记Pi2‑1及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记Pi2-1及应用。

背景技术：

水稻作为世界上主要的粮食作物之一，其产量的高低直接影响全球粮食安全。水稻稻瘟病作为真菌性病害已成为热带和温带国家水稻最主要的病害，其大规模爆发可使水稻严重减产甚至绝收。尤其表现在中国的杂交水稻育种中，由于杂交水稻发展过程中亲本间的遗传关系较近，远缘优异抗病资源引入较少，导致杂交水稻抗病性改良进展缓慢。目前对于水稻稻瘟病主要以预防为主，在水稻生长抽穗初期喷施化学农药加以防治。然而这样又带来了水稻生产成本的的提高、水稻食用安全以及环境污染等问题。

培育抗稻瘟病水稻新品种是解决以上诸多问题既经济环保又安全高效的有效途径。传统的育种方法将抗病品种与感病品种杂交，在后代根据抗病表型选择优异后代的方法，具有表型鉴定年际间不稳定、选择过程容易丢失抗病性的弊端。随着生物技术的发展，尤其水稻基因组学，为稻瘟病基因的鉴定克隆奠定了良好的基础。截至目前，已经克隆的水稻抗稻瘟病基因已有21个，另有多个已被精细定位。伴随着水稻抗稻瘟病基因的精细定位与克隆，与水稻抗稻瘟病基因紧密连锁甚至共分离的分子标记则可用于水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择。

水稻抗稻瘟病基因Pi2于2006年被克隆，该基因具有广谱抗性，被广泛应用于水稻抗稻瘟病遗传改良。现有技术中水稻抗稻瘟病基因Pi2的应用主要体现在开发与Pi2紧密连锁的分子标记用于Pi2分子标记辅助选择。然而，这些开发的标记多为SSR标记与Pi2为连锁关系，位于Pi2基因外部，随着遗传选择世代的增加，标记与Pi2的连锁关系往往会被打破，导致标记跟踪失效，利用效率低下。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记及应用，本发明根据基因内部核苷酸序列在不同品种之间的差异(包括变异和缺失)，通过设计基因内部的In-Del(插入-缺失)标记，将不同水稻品种类型的基因型分开，该方法具有稳定性(不同的碱基缺失在不同水稻品种中稳定存在)和标记追踪可靠性(标记在基因内部与基因共分离)。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记Pi2-1，功能分子标记所扩增的DNA片段包含水稻抗稻瘟病基因Pi2基因组序列的第1543-1545位核苷酸，某些水稻感稻瘟病品种在该位点存在ACA 3个碱基缺失，由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组中扩增出抗稻瘟病基因Pi2的DNA片段，经电泳检测DNA片段大小，从而确定水稻抗稻瘟病基因Pi2的完整性，进而确定其稻瘟病抗性。

本发明还公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记Pi2-1的引物对，所述引物对的正向引物如SEQ ID NO.1所示，所述引物对的反向引物如SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pi2的方法，包括以下步骤：

1)通过常规PCR法扩增及测序，获得水稻抗稻瘟病基因Pi2的1个抗病等位基因与1个感病等位基因序列；

2)将步骤1)所获得的序列进行比对，得到水稻抗稻瘟病基因Pi2的第1543-1545位点处存在ACA 3个碱基缺失，该差异位于该基因的外显子；

3)对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，所得扩增产物进行电泳检测验证，获得与水稻抗稻瘟病基因Pi2呈特异性带型的核苷酸片段；

4)对步骤3)所获得的分子标记在不同的水稻品种中进行带型显色和基因型分型，从而确定水稻抗稻瘟病基因Pi2的完整性，进而确定其稻瘟病抗性。

进一步地，步骤3)中的PCR反应体系如下：

进一步地，电泳检测中的8％聚丙烯酰胺凝胶的组成如下：

进一步地，显色中的聚丙烯酰胺凝胶显色液100ml的组成如下：

本发明还公开了一种上述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记Pi2-1在筛选和鉴定水稻稻瘟病抗性品种中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：本发明利用水稻抗稻瘟病基因Pi2开发了新的Pi2功能分子标记。这些功能分子标记的开发将有助于将Pi2导入不同的水稻遗传背景中进而利用分子标记辅助选择技术快速高效地筛选到新的抗稻瘟病水稻新品种。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明Pi2-1抗病品种和感病品种基因型分析；其中，1-12，分别为抗病品种：粤农丝苗，华占，嘉58，荣18B，抗丰B，R286，长粒早粳2号，浙粳88，松粳9号，长粳香1号；13-24，分别为感病品种：桃1B，文香1号，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1号，丽江新团黑谷，杨粳581，武育236，南粳5854；

图2是本发明各抗稻瘟病品种和感稻瘟病品种抗性表型鉴定；其中，1-12，分别为抗病品种：粤农丝苗，华占，嘉58，荣18B，抗丰B，R286，长粒早粳2号，浙粳88，松粳9号，长粳香1号；13-24，分别为感病品种：桃1B，文香1号，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1号，丽江新团黑谷，杨粳581，武育236，南粳5854；

图3是本发明Pi2-1在R900/华占F₂群体中的基因型分型分析；其中，1华占；2，R900；3-24，R900/华占F₂分离群体中各单株的基因型分型；

图4是本发明华占，R900以及R900/华占F₂群体中与图3中各单株基因型相对应的稻瘟病抗病表型，其中，1华占；2，R900；3-24，R900/华占F₂分离群体中各单株的基因型分型。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1水稻抗稻瘟病基因Pi2在不同水稻品种中的基因序列分析和功能分子标记开发

水稻材料：粤农丝苗，华占，嘉58，荣18B，抗丰B，R286，长粒早粳2号，浙粳88，松粳9号，长粳香1号，桃1B，文香1号，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，昌香恢1号，丽江新团黑谷，杨粳581，武育236，南粳5854。

对上述不同水稻品种中的抗稻瘟病基因Pi2进行测序，进一步对所测的各品种抗稻瘟病基因Pi2的基因组序列进行比对分析(表1)。根据比对分析结果发现某些测序品种中Pi2基因组序列的外显子区域存在1处有规律的连续3个碱基缺失。进一步根据稻瘟病抗性表型鉴定结果发现在Pi2基因组序列1543-1545位点处存在3个碱基(ACA)缺失的，该品种稻瘟病抗性表现为感病。而在该位点处不存在碱基缺失的，这类品种稻瘟病抗性表现为抗病(表1)。另外根据测序分析发现，与Pi2相邻的基因LOC-Os06g17920，其基因组序列与Pi2非常相似，尤其在Pi2基因组序列1543-1545位点处附近，这两个基因的基因组序列几乎完全一样。

表1不同水稻品种抗稻瘟病基因Pi2全基因组测序及SNP分型分析

因而根据抗稻瘟病基因Pi2在不同品种中测序比对分析，进一步结合抗性表型鉴定结果，发现在Pi2基因组序列1543-1545处，感稻瘟病品种存在3个碱基(ACA)的缺失，抗病品种则不存在碱基缺失。基于上述结果，我们在此处开发1个In-Del标记，Pi2-1；Pi2-1标记在抗病品种中扩增出1个片段长度为65bps(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的单一条带；在感病品种中扩增出2个片段条带，一条为扩增LOC-Os06g17920基因组所具条带，片段长度65bps；另一条为扩增Pi2基因组所具条带，由于存在3个碱基缺失，因而片段长度为62bps(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。Pi2-1即为水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记。在水稻抗稻瘟病分子标记鉴定时，利用这个功能分子标记进行扩增，再进行标记基因型鉴定，凡是扩增出65bps单一条带的，表明该品种不存在碱基缺失，Pi2基因功能正常，具有稻瘟病抗性。而扩增出2个片段条带的(65bps和62bps)，则表明该品种Pi2基因存在3个碱基缺失，基因功能不正常，稻瘟病抗性较差。因此利用Pi2-1可将抗稻瘟病品种和稻瘟病抗性较差品种，快速高效区分。

实施例2新的水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子标记在抗病水稻品种和感病水稻品种中的基因型分型检测

(1)水稻材料：粤农丝苗，华占，嘉58，荣18B，抗丰B，R286，R227，长粒早粳2号，浙粳88，松粳9号，长粳香1号，长松粳；桃1B，文香1号，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1号，丽江新团黑谷，杨粳581，武育236，南粳5854。

(2)水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子标记在不同水稻品种中基因型鉴定

利用上述针对水稻抗稻瘟病基因Pi2开发的功能分子标记对不同水稻品种进行PCR扩增(反应体系如下)，之后通过体积分数为8％的聚丙烯酰胺凝胶(凝胶配置方法如下)电泳分离，对标记在不同水稻品种中进行带型显色和基因型分型(显色液配置方法如下)；之后结合各水稻品种抗稻瘟病表型鉴定结果，进而确定功能分子标记的实用性。

PCR反应体系：

8％聚丙烯酰胺凝胶配方:

聚丙烯酰胺凝胶显色液配方(100ml)：

注：甲醛是临用前现加，其他三个按相应量提前配好。

经上述检测后结果分析发现，水稻品种：粤农丝苗，华占，嘉58，荣18B，抗丰B，R286，R227，长粒早粳2号，浙粳88，松粳9号，长粳香1号，长松粳表现基因型一致，标记Pi2-1，扩增片段长度均为单一条带65bps(图1，1-12)。抗稻瘟病表型鉴定结果显示这些品种抗性为中抗水平，具有稻瘟病抗性(图2，1-12)。然而水稻品种：桃1B，文香1号，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1号，丽江新团黑谷，杨粳581，武育236，南粳5854基因型鉴定表明这些品种在标记Pi2-1的扩增片段长度均为两条带，一条65bps，另一条62bps(图1，13-24)。抗稻瘟病表型鉴定结果表明这些品种稻瘟病抗性较差，均有不同程度的感病现象(图2，13-24)。因而水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记Pi2-1，在不同水稻品种中基因型分型清晰明确，且不同基因型与抗稻瘟病表型能较好对应吻合，表明Pi2-1这个功能分子标记具有实用性。

实施例3、新的水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子标记在R900/华占F₂群体中筛选新的水稻抗稻瘟病单株。

利用上述水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子标记Pi2-1，在水稻抗稻瘟病品种华占和感稻瘟病品种R900构建的F2群体中，逐株检测其基因型。同时在水稻孕穗期(幼穗分化3-5期)，采用混合水稻稻瘟病孢子接种，鉴定各单株稻瘟病穗茎瘟抗性表型。

分析结果表明，在检测到的基因型表现为，标记Pi2-1扩增片段长度表现为单一条带65bps，表现为抗病基因型的112个单株中，有104个具有抗稻瘟病表型。基因型与表型的吻合率达92.8％(图3，图4)；在检测到的基因型表现为标记Pi2-1，扩增片段长度为两条带，一条，65bps，另一条，62bps，表现为感病基因型或杂合基因型的259个单株中，有91个具有感稻瘟病表型(图3，图4)。因而利用Pi2-1这个水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子标记，能从各分离群体中快速高效的筛选出基因型纯合的具有稻瘟病抗性的单株和株系。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子标记Pi2-1及应用

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttggattgga gcattattcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcatgtgcta gactcttggg t 21

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 抗稻瘟病基因

<400> 4

ttggattgga gcattattcg atcattagct atttttggtg acagacccaa gagtctagca 60

catgc 65

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 抗稻瘟病基因

<400> 4

ttggattgga gcattattcg atcattagct atttttggtg gacccaagag tctagcacat 65

gc 62