一种超高效液相色谱‑串联质谱检测三乙膦酸铝的方法与流程

本发明属于分析化学领域，涉及一种有机污染物的定量分析方法，具体地说，是一种利用超高效液相色谱-串联质谱同时测定乙基磷酸和亚磷酸离子的含量，通过计算其比例并折算成为三乙膦酸铝含量的定量方法。

背景技术：

三乙膦酸铝(fosetyl-aluminium)是一种有机磷类高效、广谱、内吸性低毒杀菌剂。它在植物体内可以上、下双向传导，对单轴霉菌属、霜霉属、疫霉属引起的病害有良好的防治效果，是目前国内外防治水稻稻瘟病、果树、蔬菜霜霉病、疫病应用较多的药剂。

三乙膦酸铝由乙基磷酸离子和铝离子以化学键的形式构成，其在基质中通常解离后以化学离子乙基磷酸和亚磷酸离子的形式存在。传统的分析方法以络合滴定测定三乙膦酸铝含量[化工技术与开发,2007,36(1):39-41,35]，但是该方法操作复杂，在做痕量分析时，误差较大。近年来，随着色谱技术的普及，各类基于色谱分离后的分析技术也被应用于三乙膦酸铝的测定当中。常规方法使用三甲基硅重氮甲烷在恒温下进行衍生化[农药,2009,48(10):747-748,759]，或将三乙膦酸铝在密闭的反应瓶中完全碱解后生成乙醇[色谱,1993,11(5):285-287]，通过气相色谱法测定衍生化或碱解后的产物对三乙膦酸铝进行定量，但是这些方法前处理较复杂，实验条件较难掌控。考虑到三乙膦酸铝以离子的形式存在，有文献报道使用离子色谱分析样品离子的含量[Microchemical Journal,1995,52(1):68-76]，并使用乙基膦酸离子的含量进行定量，但是该方法容易受到复杂基质的干扰，影响测定结果。此外，液相色谱技术也被应用于三乙膦酸铝的定量分析当中，有文献报道使用离子对反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定三乙膦酸铝的含量[色谱,2009,27(6):849-851]，但是该方法的检出限较高，不能满足三乙膦酸铝残留分析的需求。

我国的食品安全国家标准《食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2014)中规定三乙膦酸铝的残留定义为乙基磷酸和亚磷酸及其盐之和，以乙基磷酸表示。现有的文献中仅测定乙基磷酸的含量[Journal of AOAC International,2003,86(4):832-838]，不能满足国家标准中关于三乙膦酸铝残留定义的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种超高效液相色谱-串联质谱检测三乙膦酸铝的方法，采用超高效液相色谱-串联质谱法检测乙基磷酸和亚磷酸离子的含量，同时通过计算其比例并折算成为三乙膦酸铝含量，用于三乙膦酸铝残留量的准确、快速分析。

本发明所采用的技术原理：

低毒杀菌剂--三乙膦酸铝在溶液中以乙基磷酸和亚磷酸两种形式存在，对两种酸进行离子化裂解，然后利用超高效液相色谱-串联质谱测定乙基磷酸和亚磷酸两种离子的含量。根据不同溶液中两种离子的存在比例基本为40：60的规律，将测定的离子含量经计算、折算即可得到待测物中三乙膦酸铝的含量。

本发明所采用的技术方案：

一种超高效液相色谱-串联质谱检测三乙膦酸铝的方法，其步骤如下：

1、准确称取样品后加入乙腈进行预处理，然后以乙腈为标准按质量体积比为1：10～15(g/mL)的比例加入氯化钠，剧烈震荡1～3min后，以4000r/min的转速离心4～6min，取上层乙腈溶液；在乙腈溶液中按体积质量比为1：0.02～0.025(mL/g)的比例分别加入无水硫酸镁和PSA吸附剂，剧烈震荡1～3min后，以4000r/min的转速离心5～7min，取上清液作为提取液，待测。所述样品是果蔬样品、土壤样品或水样品。所述预处理过程是：在果蔬样品中按质量体积比为1：2～3(g/mL)的比例加入乙腈，然后高速匀浆2～5min；在土壤样品中按质量体积比为1：2～3(g/mL)的比例加入乙腈，然后振荡13～18min；在水样品中按体积比为1：2～3(mL/mL)的比例加入乙腈，然后振荡13～18min。

2、使用超高效液相色谱—串联质谱测定提取液中乙基磷酸离子和亚磷酸离子的含量，其中乙基磷酸的母离子和定量离子对分别为109和81/63，亚磷酸的母离子和定量离子对分别为81和79/63。

3、色谱工作条件：UPLC色谱柱为ACQUITYBEH HILIC(1.7μm，2.1mm×50mm)，柱温：35℃，流速：0.25mL/min，进样量：2μL；流动相：A相为乙腈，B相为0.05％甲酸水(10/90，v/v)，其梯度洗脱条件为：0～0.5min，流动相A保持10％；0.5～3.0min，流动相A从10％变为90％；3.0～3.5min，流动相A从90％变为10％；3.5～5.0min，流动相A保持10％；5.0min停止。

4、质谱工作条件：扫描方式：电喷雾负离子(ESI-)扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；雾化气：379.225kPa；喷雾电压：4500kV。

5、根据提取液中乙基磷酸离子和亚磷酸离子的存在比例为40：60，利用如下公式计算提取液中三乙膦酸铝含量：

三乙膦酸铝含量＝乙基磷酸离子含量×0.4+亚磷酸含量离子×0.6。

本发明测定的对象为不同样品中三乙膦酸铝的含量，具体的样品可为苹果、香蕉、黄瓜、甘蓝等不同果蔬及水、土壤等。

本发明根据不同溶液中乙基磷酸离子和亚磷酸离子的存在比例基本为40：60的规律，采用超高效液相色谱-串联质谱法检测乙基磷酸和亚磷酸离子的含量，经计算、折算得到待测物中三乙膦酸铝的含量，在10-500μg/L浓度范围内，乙基磷酸和亚磷酸离子的线性相关系数均大于0.999，所得结果更能体现三乙膦酸铝的含量，且误差在合理范围内，符合食品安全国家标准《食品中农药最大残留限量》中的规定，而且测定三乙膦酸铝的定量限为0.52μg/kg，适用于三乙膦酸铝残留量的准确、快速分析。

附图说明

图1是在不同溶液中乙基磷酸和亚磷酸离子的比例。

图2是乙基磷酸和亚磷酸离子的裂解途径。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

本发明建立一种利用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定乙基磷酸和亚磷酸离子的含量，通过计算其比例并折算成为三乙膦酸铝含量。三乙膦酸铝在溶液中以乙基磷酸和亚磷酸两种形式存在，两种酸在溶液中的存在比例对三乙膦酸铝的定量存在影响。

实施例一

研究不同溶液中乙基磷酸离子和亚磷酸离子的存在比例，分别配制0.5μg/mL的三乙膦酸铝溶液，其中一组为乙腈与水的比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2和1:4，另一组为甲醇与水的比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2和1:4。使用乙基磷酸和亚磷酸两种酸的标准溶液对三乙膦酸铝溶液中的两种酸进行定量，并计算其与酸总量的比例。实验结果见图1，可以看出，乙基磷酸和亚磷酸两种离子的比例均约为40％和60％。

实施例二

三乙膦酸铝在溶液中以乙基磷酸和亚磷酸两种形式存在，两种酸在离子化的裂解规律是其准确定量的关键。本发明首先选择负离子模式进行激发，使用直接进样的方式优化质谱分析乙基磷酸和亚磷酸的条件。乙基磷酸和亚磷酸分子在质谱中的裂解碎片如图2所示，在一级质谱中，乙基磷酸和亚磷酸分别产生稳定的[M－H]－离子，其作为母离子的m/z分别为109和81。在确定其母离子后，在SIM模式下，对化合物的碎裂电压(DP)进行优化，乙基磷酸和亚磷酸的最优DP均为-81V。母离子进入二级质谱，发生断裂或重排等反应产生不同的离子碎片，其中，乙基磷酸的子离子分别为亚磷酸(定量离子，m/z＝81)和偏亚磷酸(定性离子，m/z＝63)，亚磷酸的子离子分别为偏磷酸(定量离子，m/z＝79)和偏亚磷酸(定性离子，m/z＝63)。

实施例三

对质谱分析，基质中化合物对目标化合物的离子化存在一定的干扰，为了提高样品中三乙膦酸铝的定量准确度，实验以甘蓝为例，研究了甘蓝基质对目标物定量的基质效应。以甘蓝空白样品乙腈提取液作为空白基质溶液，以纯乙腈溶液作为纯溶剂溶液，分别配制0.1μg/mL的三乙膦酸铝溶液，上机测定两种溶液的响应值，并采用相对响应值法(基质效应＝空白基质标准响应值/纯溶剂标准响应值×100％)计算甘蓝对三乙膦酸铝的基质效应。用上述两种不同溶液测定乙基磷酸和亚磷酸的峰面积，结果见表1，甘蓝基质对乙基磷酸和亚磷酸的基质效应分别为80％和103％，说明基质效应对样品定量存在一定影响。因此，为了降低样品基质效应对目标物离子化带来的干扰，在样品分析时需要使用对应基质提取液配制标准品。

表1不同样品中三乙膦酸铝的添加回收率

实施例四

准确称取样品(其中苹果、香蕉、黄瓜、甘蓝、土壤样品取10g，水样取10mL)，分别添加0.01、0.10和0.50mg/kg的三乙膦酸铝标准溶液，每个试样加入20mL乙腈。果蔬样品高速匀浆2min，土壤和水样振荡15min。分别加入1.5g氯化钠，剧烈震荡1min后，以4000r/min的转速离心5min，分取5mL上层乙腈溶液，加入100mg无水硫酸镁和100mg PSA吸附剂，剧烈震荡1min后，以4000r/min的转速离心5min，取上清液2mL作为提取液。

使用超高效液相色谱—串联质谱测定提取液中乙基磷酸离子和亚磷酸离子的含量，其中乙基磷酸的母离子和定量离子对分别为109和81/63，亚磷酸的母离子和定量离子对分别为81和79/63。

根据提取液中乙基磷酸离子和亚磷酸离子的存在比例为40：60，利用如下公式计算提取液中三乙膦酸铝含量：

三乙膦酸铝含量＝乙基磷酸离子含量×0.4+亚磷酸含量离子×0.6。用常规分析

方法测定回收率，结果见表2。

表2不同样品中三乙膦酸铝的添加回收率

以上所述仅是本发明的一般实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。