一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的分析方法
【专利摘要】本发明提供一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的分析方法，对卷烟烟气进行样品前处理，采用双柱液相色谱串联质谱系统对前处理所得待测样品进行定性定量分析，所述双柱液相色谱串联质谱系统包括有第一维液相色谱泵、第一分离柱、第二维液相色谱泵、第二分离柱、质谱装置。本发明进一步提供了一种双柱液相色谱串联质谱系统。本发明提供一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的分析方法，样品前处理简单，检测效率高，能有效地去除烟气中干扰物质，取得优异的分离度、灵敏度，检测结果准确可靠。
【专利说明】
一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于卷烟主流烟气中重要化学成分分析的技术领域，涉及一种双柱液相色 谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的分析方法。
【背景技术】
[0002] 卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺（tobacco-specific N-nitrosamines TSNAs)为 Hoffmann清单和七种有害成分评价体系中的烟气有害物质，是烟气中最重要的化合物之 一，一直以来都是烟草化学研究的热点。烟草特有亚硝胺(TSNAs)主要包括4-(N-甲基亚硝 胺基)-1-(3_吡啶基)-1_ 丁酮(NNK)、N-亚硝基降烟碱(NNN)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)，结构如图1所示。
[0004] 由于烟气TSNAs释放量较低且由于烟气成分背景复杂、基质干扰严重，难以对其准 确测定。值得注意的是同等焦油情况下烤烟型比混合型卷烟低一个数量级左右，因而对卷 烟特别是烤烟型卷烟TSNAs释放量的准确定量一直是烟草化学分析的重点和难点。
[0005] 目前，TSNAs的分析方法主要有气相色谱-热能分析仪法(GC-TEA)、气相色谱串联 质谱法GC-MS/MS、液质联用LC-MS/MS法。GC-TEA法存在前处理步骤烦琐、样品分析时间长、 检测灵敏度较低等缺点，而LC-MS法有基质干扰严重，方法的灵敏度、检测限较低等问题。因 此，发展此类化合物适用的多维液相色谱技术进行分离分析十分必要。
[0006] 多维液相色谱(MDLC)是将分离机理不同而又相互独立的液相分离模式串联起来 构成的分离系统，样品在第一根液相色谱柱的目标馏分进入后面的色谱柱进行二次分离， 将其与质谱(MS)联用是目前对复杂样品分离分析最重要的手段之一。多维液相色谱-质谱 联用系统用来分析烟草及烟气样品中各种复杂基质样品，虽然具有极高的选择性和灵敏 度，但需综合考虑流动相的兼容性、阀接口切换及目标物的富集还有质谱的兼容性，所以建 立在线检测技术难度较大。
【发明内容】
[0007] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双柱液相色谱串联质 谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的分析方法，用于解决现有技术中由于卷烟主流烟气烟草 特有亚硝胺(TSNAs)释放量较低，基质干扰相对严重、难以准确测定的问题。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种双柱液相色谱串联质 谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的分析方法，对卷烟烟气进行样品前处理，采用双柱液相 色谱串联质谱系统对前处理所得待测样品进行定性定量分析，所述双柱液相色谱串联质谱 系统包括有第一维液相色谱、第一分离柱、第二维液相色谱、第二分离柱、质谱装置。
[0009] 较佳地，所述卷烟烟气中亚硝胺包括有N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝 基氨基比啶基）-1_ 丁酮（NNK)、N-亚硝基假木贼碱（NAB)和N-亚硝基新烟草碱 (NAT)〇
[0010] 较佳地，所述样品前处理包括以下步骤：
[0011] 1)选取卷烟烟支，点燃后进行抽吸，采用滤片捕集方式捕集卷烟烟气；
[0012] 2)将滤片进行超声萃取后过膜，即得待测样品。
[0013] 优选地，在步骤1)中，所述抽吸采用多孔道转盘式吸烟机进行。更优选地，所述多 孔道转盘式吸烟机为20孔道转盘式吸烟机。所述20孔道转盘式吸烟机可以一次性抽吸20支 卷烟的烟气。
[0014] 优选地，在步骤1)中，所述滤片为剑桥滤片。所述剑桥滤片的直径为44_。
[0015] 优选地，在步骤1)中，所述捕集卷烟烟气按国家标准GB/T 19609-2004中规定方法 进行捕集。
[0016] 优选地，在步骤2)中，所述萃取溶液为醋酸铵(NH4Ac)水溶液，所述萃取溶液的加 入量为l〇-2〇mL 0. lmol/L的醋酸铵水溶液/20支卷烟烟气。更优选地，所述萃取溶液的加入 量为20mL 0. lmol/L的醋酸铵水溶液/20支卷烟烟气。所述醋酸铵水溶液，通过称取醋酸铵， 用水完全溶解后，转移至容量瓶中，加水定容得到。
[0017]优选地，在步骤2)中，所述萃取溶液中还加入内标溶液，所述内标溶液的加入量为 l-2mL400ng/mL内标溶液/20支卷烟烟气。更优选地，所述内标溶液的加入量为lmL 400ng/ mL内标溶液/20支卷烟烟气。
[0018] 更优选地，所述内标溶液通过分别称取NNN-cU、NNK-cU、NAT-cU、NAB-cU，加入甲醇 定容后获得。
[0019] 进一步优选地，所述内标溶液中顺^(14、顺1(-(14、嫩1'-(14、嫩8-(14的浓度均为400即/ mL〇
[0020] 进一步优选地，所述顺^(14、顺1(-(14、嫩1'-(14、嫩8-(14为氘代试剂。具体的，所述顺^ (14、顺1(-(14、财1'-(14、嫩8-(14分别为氘代^亚硝基去甲基烟碱、氘代4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-比啶基)-1_ 丁酮、氖代N-亚硝基新烟草碱、氖代N-亚硝基假木贼碱。
[0021] 所述NNN-cU、NNK-cU、NAT-cU、NAB-cU为商品化试剂，其化学性质稳定，适于作为内 标。
[0022]优选地，在步骤2)中，所述超声萃取的时间为10-50min。更优选地，所述超声萃取 的时间为40min。
[0023] 优选地，在步骤2)中，所述过膜的方式为水相滤膜过滤方式。更优选地，所述水相 滤膜的孔径为0.22M1。
[0024] 较佳地，所述采用双柱液相色谱串联质谱系统对前处理所得待测样品进行定性定 量分析，包括以下步骤：
[0025] A)配制标准样品:配制混合标准储备溶液、内标溶液和混合标准溶液；
[0026] A1)分别称取嫩8、嫩!\顺1^疆的标准品，加入甲醇定容，配成混合标准储备溶液；
[0027] 优选地，所述混合标准储备溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的浓度均为1 Oμg/ml。
[0028] A2)分别称取NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4，加入甲醇定容，配成内标溶液；
[0029] 优选地，所述内标溶液中NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4的浓度均为400ng/ml。 [0030] 优选地，所述顺^(14、财1'-(14、财8-(14、顺1(-(14为氘代试剂。具体的，所述顺1(14、 NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4分别为氘代N-亚硝基去甲基烟碱、氘代4-(甲基亚硝基氨基)-1-( 3-比啶基)_1_ 丁酮、氘代N-亚硝基新烟草碱、氘代N-亚硝基假木贼碱。
[0031] 所述NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4为商品化试剂，其化学性质稳定，适于作为内 标。
[0032] A3)分别移取不同体积的步骤A1中混合标准储备溶液，再分别加入一定体积的步 骤A2中内标溶液，用甲醇定容配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。
[0033]优选地，所述混合标准溶液的浓度为0-100ng/ml。
[0034] 优选地，所述混合标准溶液内，顺^(14、嫩1'-(14、嫩8-(14、顺1(-(14的浓度均为1〇1^/ ml 〇
[0035] B)样品定性检测:分别将步骤A)配制的标准样品和经样品前处理后待测样品进行 双柱液相色谱串联质谱系统检测，在第一维液相色谱作用下，通过第一分离柱进行馏分后， 在第二维液相色谱作用下，由所述第二分离柱进行分离，再由所述质谱装置进行测定，比较 保留时间、质谱扫描进行定性，确定待测样品中4种亚硝胺成分；
[0036] C)样品定量检测:分别将步骤A)配制的标准样品和经样品前处理后待测样品进行 双柱液相色谱串联质谱系统检测，在第一维液相色谱作用下，通过第一分离柱进行馏分后， 在第二维液相色谱作用下，由所述第二分离柱进行分离，再由所述质谱装置进行测定，采用 内标标准曲线法进行MRM定量，获得待测样品中4种亚硝胺成分的含量。
[0037] 优选地，所述步骤B)或C)中，所述在第一维液相色谱作用下，通过第一分离柱进行 馏分是在第一维液相色谱作用下，将步骤A3配制的混合标准溶液和经样品前处理后待测样 品溶液通过第一分离柱进行馏分。
[0038] 优选地，所述步骤B)或C)中，所述在第二维液相色谱作用下，由所述第二分离柱进 行分离是在第二维液相色谱作用下，将步骤A3配制的混合标准溶液与待测样品通过第二分 离柱进行分离。
[0039]优选地，所述步骤B)或C)中，所述第一维液相色谱的条件为:第一维液相色谱:正 相液相色谱；柱温：25-35°C ;流速:0.5-1.5mL/min;进样量:5-15yl;第一维流动相A相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L H3P04+80 -90%H20+10-20%CH3CN(pH=2-4);第一维流动相B 相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L H3P〇4+0.1-1.0mol/L KCl+80-90%H20+10-20%CH3CN (pH=2-4);梯度洗脱。
[0040]更优选地，所述第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱：Agilent Technologies 1260Infinity正相液相色谱;柱温：30°C ;流速：lmL/min;进样量：lOyl;第一 维流动相A相：10mmol/L KH2P〇4+5mmol/L H3P〇4+85%H2〇+15%CH3CN(pH=2.8);第一维流动 相B相：10mmol/L KH2P〇4+5mmol/L H3P〇4+0.5mol/L KCl+85%H2〇+15%CH3CN(pH = 2.8);梯 度洗脱。
[0041] 上述百分比％为体积百分比。
[0042] 最优选地，如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
[0043] 〇-5min，A相:B 相体积比为100:0-90:10;
[0044] 5-5 ? lmin，A相:B 相体积比为90:10-60:40;
[0045] 5 ? l-15min，A相:B 相体积比为60:40-0:100;
[0046] 15-15 ? lmin，A相:B相体积比为0:100-100:0;
[0047] 15. l-40min，A相:B相体积比为 100:0-100:0。
[0048]表1第一维液相色谱的梯度洗脱
[0050]优选地，所述步骤B)或C)中，所述第一分离柱为强阳离子交换色谱柱(SCX)。
[0051 ] 更优选地，所述强阳离子交换色谱柱(30乂)为￥3七6^3口1161^8〇1^35 30乂柱(4.6* 150mm,5ym)〇
[0052]优选地，所述步骤B)或C)中，所述第二维液相色谱的条件为:第二维液相色谱:反 相液相色谱(RPLC);柱温:25-35 °C ;流速:0.2-0.3mL/min;进样量:5-15yl;第二维流动相A 相：l-10mmol/L NH4Ac+92-98%H2〇+2-8%CH3CN;第二维流动相B相：1-1〇111111〇1/1順4厶〇+92-98 % CH3CN+2-8 % H20;梯度洗脱。
[0053]更优选地，所述第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱：A g i 1 e n t Technologies 1260Inf inity反相液相色谱(RPLC);柱温：30°C ;流速:0? 25mL/min;进样量： l〇yl;第二维流动相A相：5謹〇1/1^冊44。+95%112〇+5%(：113〇1第二维流动相8相 ：5111111〇1/ LNH4Ac+95 % CH3CN+5 % H20;梯度洗脱。
[0054] 上述百分比％为体积百分比。
[0055] 最优选地，如表2所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
[0056] 〇-l〇min，A相:B 相体积比为 100:0-100:0;
[0057] 10-20min，A相:B 相体积比为 100:0-0:100;
[0058] 20-22min，A相:B 相体积比为0:100-0:100;
[0059] 22-22 ? lmin，A相:B 相体积比为0:100-100:0;
[0060] 22-25min，A相:B 相体积比为 100:0-100:0。
[0061] 表2第二维液相色谱的梯度洗脱
[0063]优选地，所述步骤B)或C)中，所述第二分离柱为Trap捕集柱。
[0064] 更优选地，所述Trap捕集柱为Thermo scientificAcclaim PolarAdvantagell C18柱（4.6*50mm，3iim)。
[0065] 优选地，所述步骤B)或C)中，所述质谱装置的条件为：
[0066] 质谱:Agilent Technologies 6460Triple Quad MS三重四极杆质谱；电离方式： 电喷雾离子源（ESI);扫描方式：多反应监测（MRM);MRM条件：见表3;喷雾（IS)电压为： 5000V;雾化气(Gas 1)压力为:482 ? 6kPa;气帘气(Curtain Gas)压力为:206 ? 7kPa;辅助雾化 气（Gas2)压力为：482 ? 6kPa;离子源温度（TEM)为：500°C ;清洗进样针程序:needle wash 30s;质谱流路切换:从lOmin开始扫描，28min结束。
[0067] 表3 MRM条件
[0069] 优选地，所述步骤B)或C)中，所述第一分离柱进行馏分后将目标物馏分的pH值调 节至中性，采用中心切割法，获得4种亚硝胺成分的馏分。所述4种亚硝胺成分的馏分包括 NNK、NNN、NAT、NAB 馏分。
[0070] 更优选地，所述调节至中性的pH值为6.8-7.2。
[0071] 所述中心切割法为多维色谱中常用的分离方法，在本发明的双柱液相色谱中，即 将在第一维液相色谱作用下，第一分离柱分离出的目标物馏分的色谱峰的切割完整，在第 二维液相色谱作用下，转移至第二分离柱捕集保留，其它非目标物馏分不进第二分离柱。
[0072] 更优选地，所述4种亚硝胺成分的馏分是通过第二分离柱分离，并经质谱装置通过 质谱检测质荷比确定每个色谱峰对应的物质。所述4种亚硝胺成分的质荷比数值见表3。所 述NNK馏分的母离子质荷比为208.1，子离子质荷比为122.1;所述NAB馏分的母离子质荷比 为192.1，子离子质荷比为162.1;所述NAT馏分的母离子质荷比为190.1，子离子质荷比为 160.1;所述NNN馏分的母离子质荷比为178.1，子离子质荷比为148.1。
[0073] 优选地，所述步骤B)或C)中，所述第一维液相色谱与第一分离柱之间设有进样阀。 [0074]更优选地，所述进样阀为二位六通阀，所述进样阀设有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口为进样口，所述第3接口为排废口，所述第1接 口经管线与第一维液相色谱相连通，所述第6接口经管线与第一分离柱相连通。
[0075] 优选地，所述步骤B)或C)中，所述第一分离柱与第二维液相色谱之间设有连通阀， 所述连通阀与第一分离柱之间设有混合器，所述混合器分别与所述第一分离柱、连通阀相 连通。
[0076] 更优选地，所述连通阀为二位六通阀，所述连通阀设有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口经管线与第二分离柱的进样端相连通，所述第 4接口经管线与第二分离柱的出样端相连通，所述第2接口经管线与第二维液相色谱相连 通，所述第3接口经管线与质谱装置相连，所述第5接口为排废口，所述第6接口经管线与混 合器相连通。
[0077] 进一步优选地，所述第5接口还连接有紫外检测器，所述紫外检测器经管线与第5 接口相连通。
[0078]更进一步优选地，所述紫外检测器的检测波长为220-240nm。
[0079]最优选地，所述紫外检测器的检测波长为230nm。
[0080] 更优选地，所述混合器还连接有补偿栗，所述补偿栗经管线与混合器相连通。所述 补偿栗用于调节一维流动相的pH值并稀释一维流动相中乙腈浓度，所述补偿栗可添加也可 不添加。
[0081 ]进一步优选地，所述补偿栗为一元栗。
[0082]进一步优选地，所述补偿栗的条件为：补偿流动相为：l-10mmol/L K2HPO4;流速： 0?6_1?0mL/min〇
[0083] 最优选地，所述补偿栗的条件为：补偿流动相为：5mmol/L K2HP〇4;流速：0.8mL/ min〇
[0084] 优选地，所述步骤C)中，所述内标标准曲线法包括以下步骤：
[0085] 所述内标标准曲线法是指在标准溶液中加入内标物质，进行仪器测定，获得标准 工作曲线，进而测定含有内标物质的实际样品浓度的方法。
[0086] i、将步骤A)的A3中一系列不同浓度的混合标准溶液分别进行双柱液相色谱质谱 联用系统检测，分别获得4种亚硝胺成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比与4种亚硝 胺成分/相应内标物的质量浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到4 种亚硝胺成分标准工作曲线的回归方程。
[0087] 进一步的，所述标准曲线中，以4种亚硝胺成分与相应内标物的二级选择离子峰面 积比为纵坐标(Y轴），其4种亚硝胺成分与相应内标物的质量浓度比为横坐标(X轴）。
[0088] ii、将经样品前处理后待测样品溶液，进行双柱液相色谱质谱联用系统检测，将获 得的待测液中4种亚硝胺成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比，代入步骤i中相应的4 种亚硝胺成分标准工作曲线的回归方程，并根据加入相应内标物的已知质量浓度，计算得 到待测样品溶液中4种亚硝胺成分的质量浓度。
[0089] 本发明第二方面提供一种双柱液相色谱串联质谱系统，包括有第一维液相色谱、 进样阀、第一分离柱、混合器、连通阀、第二维液相色谱、第二分离柱、质谱装置、紫外检测 器，所述进样阀分别经管线与所述第一维液相色谱、第一分离柱的进样端相连通，所述连通 阀分别经管线与所述混合器、第二维液相色谱、第二分离柱、质谱装置、紫外检测器相连通， 所述混合器还经管线与所述第一分离柱的出样端相连通。
[0090]较佳地，所述进样阀为二位六通阀，所述进样阀设有第1接口、第2接口、第3接口、 第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口为进样口，所述第3接口为排废口，所述第1接口经 管线与第一维液相色谱相连通，所述第6接口经管线与第一分离柱的进样端相连通。
[0091 ]较佳地，所述连通阀为二位六通阀，所述连通阀设有第1接口、第2接口、第3接口、 第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口经管线与第二分离柱的进样端相连通，所述第4接 口经管线与第二分离柱的出样端相连通，所述第2接口经管线与第二维液相色谱相连通，所 述第3接口经管线与质谱装置相连，所述第5接口为排废口，所述第5接口经管线与紫外检测 器相连通，所述第6接口经管线与混合器相连通。
[0092]较佳地，所述紫外检测器的检测波长为220-240nm。优选地，所述紫外检测器的检 测波长为230nm〇
[0093] 较佳地，所述混合器还连接有补偿栗，所述补偿栗经管线与混合器相连通。
[0094]优选地，所述补偿栗为一元栗。
[0095] 优选地，所述补偿栗的条件为：补偿流动相为：l-10mm〇l/L K2HP〇4;流速：0.6-1?0mL/min〇
[0096] 更优选地，所述补偿栗的条件为：补偿流动相为：5mmol/L K2HP〇4;流速：0.8mL/ min〇
[0097]所述双柱液相色谱串联质谱系统中的第一维液相色谱、进样阀、第一分离柱、混合 器、连通阀、第二维液相色谱、第二分离柱、质谱装置、紫外检测器、补偿栗要相匹配。所述匹 配是指上述各部件经连通后作为一个整体使用时，能够有效运行。
[0098]本发明第三方面提供一种双柱液相色谱串联质谱系统的使用方法，包括以下步 骤：
[0099] 1)打开第一维液相色谱和进样阀，第一维流动相由进样阀的第1接口进入，同时待 测样品溶液由进样阀的第4接口进入，经第5接口，与第一维流动相在第6接口混合后，经管 线进入第一分离柱进行馏分；
[0100] 2)多余的第一维流动相，由进样阀的第1接口切换经第2接口至第3接口经管线排 出；
[0101] 3)打开连通阀，将在步骤1)中第一分离柱进行馏分后不含待测成分的溶液，经管 线由连通阀的第6接口进入，流到第5接口，经管线进入紫外检测器进行测定后排出；
[0102] 4)切换连通阀至捕集位置，将在步骤1)中第一分离柱进行馏分后含待测成分的溶 液，由连通阀的第6接口进入，切换经第1接口，经管线进入第二分离柱进行分离捕集；
[0103] 5)切换连通阀位置，然后打开第二维液相色谱，同时切断连通阀的第6接口与第1 接口的连通，第二维流动相由连通阀的第2接口反相进入，切换经第1接口，经管线将第二分 离柱中分离出的待测成分冲洗出；
[0104] 6)步骤5)中冲洗出的待测成分，切换依次经连通阀的第4接口、第3接口，经管线进 入质谱装置进行测定。
[0105] 优选地，步骤4)中，打开补偿栗，补偿流动相与所述第一分离柱进行馏分后含待测 成分的溶液，经管线进入混合器后混合，再进入连通阀的第6接口。
[0106] 优选地，步骤1)和步骤2)的运行时间为0~7min;步骤3)和步骤4)的运行时间为7 ~12.5min;步骤5)的运行时间为12.5~20min;步骤6)的运行时间为20~28min。所述步骤 1)和步骤2)的运行时间为第一分离柱除杂时间。所述步骤3)和步骤4)的运行时间为第二分 离柱分离捕集时间。所述步骤5)的运行时间为第二分离柱冲洗时间。所述步骤6)的运行时 间为质谱测定时间。
[0107] 优选地，步骤3)中，所述紫外检测器用于防止待测成分损失。
[0108] 如上所述，本发明属于卷烟主流烟气中重要化学成分分析的技术领域，提供一种 双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的分析方法，将烟气样品经过提取后 上样，采用SCX强阳离子交换柱分离除杂，将目标物馏分pH值调节至中性，进行中心切割，馏 分进入捕集柱经反相液相色谱分离后由质谱进行MRM扫描并定量。该方法具有以下有益效 果：
[0109] (1)本发明提供的一种分析方法，将离子交换和反相液相两种不同的分离模式串 联，根据两根色谱柱分离原理正交，很大程度除去杂质。其分离效果好且具有良好的兼容 性，能有效地去除烟气中干扰物质，基质干扰效应大大降低，使4种TSNAs全部实现基线分 离，取得了优异的分离度、灵敏度。
[0110] (2)本发明提供的一种分析方法，与现有的单柱方法相比，本发明技术可显著改善 卷烟主流烟气亚硝胺释放量测定的效果，样品前处理简单，溶剂提取后即可上样。
[0111] (3)本发明提供的一种分析方法，仪器在线自动运行，检测效率高，检测结果准确 可靠，适应各种类型卷烟特别是低TSNAs释放量卷烟烟气测定。
【附图说明】
[0112] 图1显示为本发明的一种双柱液相色谱串联质谱系统的整体结构示意图。
[0113] 图中，
[0114] 1、第一维液相色谱，
[0115] 2、进样阀，
[0116] 21、第 1 接口，
[0117] 22、第 2 接口，
[0118] 23、第 3 接口，
[0119] 24、第 4 接口，
[0120] 25、第 5 接口，
[0121] 26、第 6 接口，
[0122] 3、第一分离柱，
[0123] 4、混合器，
[0124] 5、第二分离柱，
[0125] 6、连通阀，
[0126] 61、第 1 接口，
[0127] 62、第 2 接口，
[0128] 63、第 3 接口，
[0129] 64、第 4 接口，
[0130] 65、第 5 接口，
[0131] 66、第 6 接口，
[0132] 7、紫外检测器
[0133] 8、第二维液相色谱，
[0134] 9、质谱装置，
[0135] 10、补偿栗。
[0136] 图2显示为传统一维液相色谱串联质谱法分析烤烟型卷烟烟气TSNAs释放量的MRM 谱图 2&、213、2(：、2(1、26，其中：
[0137] 图2a为4种TSNAs释放量的总MRM谱图；
[0138] 图2b为4种TSNAs中NNN释放量的MRM谱图；
[0139] 图2c为4种TSNAs中NAT释放量的MRM谱图；
[0140] 图2d为4种TSNAs中NAB释放量的MRM谱图；
[0141] 图2e为4种TSNAs中NNK释放量的MRM谱图。
[0142] 图3显示为本发明的双柱液相色谱串联质谱法分析烤烟型卷烟烟气TSNAs释放量 的 MRM 谱图 3&、313、3(：、3(1、36，其中：
[0143] 图3a为4种TSNAs释放量的总MRM谱图；
[0144] 图3b为4种TSNAs中NNN释放量的MRM谱图；
[0145] 图3c为4种TSNAs中NAT释放量的MRM谱图；
[0146] 图3d为4种TSNAs中NAB释放量的MRM谱图；
[0147] 图3e为4种TSNAs中NNK释放量的MRM谱图。
【具体实施方式】
[0148] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的保护范围。
[0149] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0150]以下实施例中使用的试剂及实验用具均为常规使用的试剂及实验用具，均可从市 场上购买获得。具体使用试剂和仪器如下：
[0151] 1、试剂
[0152] 参比卷烟1R5F、3R4F购自肯塔基烟草发展研究中心(Kentucky Tobacco Research and Development Center,Lexington,USA);成品卷烟为市售商品；NNN，NNK，NAT，NAB，NNN_ d4，NNK-d4，NAT_d4和NAB_d4(纯度^98%，加拿大Toronto Research chemicals公司）；乙 腈，甲醇(色谱纯，德国Merk公司）；磷酸，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，醋酸铵(分析纯，国药集 团化学试剂有限公司），超纯水(Mi 11 i-Q纯水仪，美国Mi 1 lpore公司）。
[0153] 2、仪器
[0154] 第一维液相色谱、第二维液相色谱(Agilent Technologies 1260Infinity系统， Agilent公司）；紫外检测器(包含在Agilent Technologies 1260Infinity系统中，Agilent 公司）；质谱装置(API4000三重四级杆质谱仪，美国AB SCIEX公司）；SCX色谱柱(Waters Spher i sorb S5SCX柱，4.6*150mm、5ym) ; Trap 捕集柱（Thermo scientificAcclaim Polar Advantage n C18,4.6*50mm、3iim);进样阀、连通阀（二位六通阀，美国Agilent 公司）； 补偿栗(一元栗，美国Agilent公司）；电子天平(感量:0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司）； SW12H超声仪（瑞士Sono Swiss公司）；Milli-Q纯水仪（美国Millpore公司）；RM200A型旋转 式吸烟机(德国Borgwaldt公司）；混合器(80此三通混合器，Agilent公司）。
[0155] 如图1所示，本发明中的一种双柱液相色谱串联质谱系统，包括有第一维液相色谱 (1)、进样阀（2)、第一分离柱(3)、混合器(4)、连通阀（6)、第二维液相色谱(8)、第二分离柱 (5)、质谱装置(9)、紫外检测器(7)，所述进样阀（2)分别经管线与所述第一维液相色谱（1)、 第一分离柱(3)的进样端相连通，所述连通阀(6)分别经管线与所述混合器(4)、第二维液相 色谱(8)、第二分离柱(5)、质谱装置(9)、紫外检测器(7)相连通，所述混合器(4)还经管线与 所述第一分离柱(3)的出样端相连通。
[0156] 实施例1
[0157] 1、样品前处理
[0158]选取20支卷烟烟支，点燃后采用滤片捕集方式捕集卷烟烟气，具体采用20孔道转 盘式吸烟机抽吸卷烟，根据GB/T 19609-2004中规定方法捕集烟气，使烟气吸附于剑桥滤片 上。将剑桥滤片置于l〇〇mL锥形瓶中中加入萃取溶液，置于超声波发生器内进行超声萃取 30-50min，萃取溶液为10-20mL 0. lmol/L NH4Ac水溶液，NH4Ac水溶液是通过称取乙酸铵，用 水完全溶解后，转移至容量瓶中，加水定容得到。萃取溶液中还加入内标溶液，内标溶液通 过分别称取NNN-cU、NNK-cU、NAT-d4、NAB-cU，加入甲醇定容后获得。内标溶液的加入量为1-2mL 400ng/mL。然后经0.22mi水相滤膜过滤后，移至色谱分析瓶中，即得待测样品溶液。
[0159] 2、标准溶液的配制
[0160] 分别移取10ml浓度为0.1mg/ml的财8、财1^顺、顺1(的标准品，置于10〇11^容量瓶 中，加入甲醇定容，配成混合标准储备溶液。混合标准储备溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的浓度 均为l〇μg/ml。同时，分别移取一定体积的d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK内标物，加入甲醇 定容，配成内标溶液，内标溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的浓度均为400ng/ml。
[0161] 分别准确移取不同体积混合标准储备溶液，置于多个100mL容量瓶中，再分别准确 加入一定体积的内标溶液，用甲醇定容，配制为一系列混合标准溶液。配制的系列混合标准 溶液浓度为〇-l〇〇ng/ml，其中内标物浓度为10ng/ml。
[0162] 3、样品含量的测定
[0163] 分别将2配制的标准溶液和1中待测样品溶液分别进行双柱液相色谱串联质谱系 统检测，即将混合标准储备溶液和待测样品溶液在第一维液相色谱作用下，通过第一分离 柱进行馏分后，在第二维液相色谱作用下，由所述第二分离柱进行分离，再由所述质谱装置 进行测定，比较保留时间、质谱扫描进行定性，确定待测液中4种亚硝胺成分；同时采用内标 标准曲线法进行MRM定量，获得待测液中4种亚硝胺成分的含量。
[0164] 具体来说，内标标准曲线法是先将上述2中一系列不同浓度的混合标准溶液分别 进行双柱液相色谱质谱联用系统检测，分别获得4种亚硝胺成分/相应内标物的二级选择离 子峰面积比与4种亚硝胺成分/相应内标物的质量浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作 曲线，以4种亚硝胺成分与相应内标物的二级选择离子峰面积比为纵坐标(Y轴），其4种亚硝 胺成分与相应内标物的质量浓度比为横坐标(X轴），分别计算得到4种亚硝胺成分标准工作 曲线的回归方程。再将上述1中待测液进行双柱液相色谱质谱联用系统检测，将获得的待测 液中4种亚硝胺成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比，代入相应的4种亚硝胺成分标 准工作曲线的回归方程，并根据加入相应内标物的已知质量浓度，计算得到待测液中4种亚 硝胺成分的质量浓度。
[0165] 其中，所述第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱：正相液相色谱栗；柱温： 25-35°C ;流速:0 ? 5-1 ? 5mL/min;进样量:5-15yl;流动相A相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/ L H3P〇4+8〇-90%H20+10-20%CH3CN(pH=2-4);流动相B相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L H3PO4+O ? 1 _ 1 ? Omo 1 /L KC1 +80-90 % H2O+10-20 % CH3CN(pH = 2-4);梯度洗脱。
[0166] 如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
[0167] 〇-5min，A相:B 相体积比为 100:0-90:10;
[0168] 5-5 ? lmin，A相:B 相体积比为90:10-60:40;
[0169] 5 ? l-15min，A相:B 相体积比为60:40-0:100;
[0170] 15-15 ? lmin，A相:B 相体积比为0:100-100:0;
[0171] 15 .l-40min，A相:B 相体积比为 100:0-100:0。
[0172] 所述第一分离柱为强阳离子交换色谱柱(SCX)。
[0173] 在第一维液相色谱作用下，第一分离柱进行馏分后将目标物馏分的pH值调节至中 性，采用中心切割法，获得4种亚硝胺成分的馏分。第一分离柱分离出的目标物馏分的色谱 峰的切割完整，在第二维液相色谱作用下，转移至第二分离柱捕集保留，其它非目标物馏分 不进第二分离柱。
[0174]所述第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱栗：反相液相色谱栗(RPLC);柱 温：25-35°C ;流速：0 ? 2-0 ? 3mL/min;进样量：5-15yl;流动相A相：1-1〇111111〇1/1順4六〇+92-98%H20+2-8%CH 3CN;流动相B相：l-10mmol/L NH4Ac+92-98%CH3CN+2-8%H20;梯度洗脱。
[0175] 如表3所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
[0176] 〇-l〇min，A相:B 相体积比为 100:0-100:0;
[0177] 10-20min，A相:B 相体积比为 100:0-0:100;
[0178] 20-22min，A相:B 相体积比为0:100-0:100;
[0179] 22-22 ? lmin，A相:B 相体积比为0:100-100:0;
[0180] 22-25min，A相:B 相体积比为 100:0-100:0。
[0181]所述第二分离柱为Trap捕集柱。
[0182] 所述质谱装置的条件为：
[0183] 质谱:Agilent Technologies 6460Triple Quad MS三重四极杆质谱；电离方式： 电喷雾离子源（ESI);扫描方式：多反应监测（MRM);MRM条件：见表3;喷雾（IS)电压为： 5000V;雾化气(Gas 1)压力为:482 ? 6kPa;气帘气(Curtain Gas)压力为:206 ? 7kPa;辅助雾化 气（Gas2)压力为：482 ? 6kPa;离子源温度（TEM)为：500°C ;清洗进样针程序:needle wash 30s;质谱流路切换:从lOmin开始扫描，28min结束。
[0184] 另外，本发明的双柱液相色谱质谱联用系统在具体测定时，如图1所示，所述第一 维液相色谱与第一分离柱之间设有进样阀。
[0185] 如图1所示，所述进样阀为二位六通阀，所述进样阀设有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口为进样口，所述第3接口为排废口，所述第1接 口经管线与第一维液相色谱相连通，所述第6接口经管线与第一分离柱相连通。
[0186] 如图1所示，所述第一分离柱与第二维液相色谱之间设有连通阀，所述连通阀与第 一分离柱之间设有混合器，所述混合器分别与所述第一分离柱、连通阀相连通。
[0187] 如图1所示，所述连通阀为二位六通阀，所述连通阀设有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口经管线与第二分离柱的进样端相连通，所述第 4接口经管线与第二分离柱的出样端相连通，所述第2接口经管线与第二维液相色谱相连 通，所述第3接口经管线与质谱装置相连，所述第5接口为排废口，所述第6接口经管线与混 合器相连通。
[0188] 如图1所示，所述第5接口还连接有紫外检测器，所述紫外检测器经管线与第5接口 相连通。所述紫外检测器的检测波长为220-240nm。
[0189] 如图1所示，所述混合器还连接有补偿栗，所述补偿栗经管线与混合器相连通。所 述补偿栗用于调节一维流动相的pH值并稀释一维流动相中乙腈浓度。所述补偿栗为一元 栗。所述补偿栗的条件为:流动相为:1 -1 Ommo 1 /L K2HPO4;流速:0.6-1. OmL/min。
[0190] 如图1所示，采用双柱液相色谱质谱联用系统进行测定时，打开第一维液相色谱和 进样阀，第一维流动相由进样阀的第1接口进入，同时待测样品溶液由进样阀的第4接口进 入，经第5接口，与第一维流动相在第6接口混合后，经管线进入第一分离柱进行馏分;多余 的第一维流动相，由进样阀的第1接口切换经第2接口至第3接口经管线排出；上述运行时间 为0~7min。打开连通阀，将在第一分离柱进行馏分后不含待测成分的溶液，经管线由连通 阀的第6接口进入，流到第5接口，经管线进入紫外检测器进行测定后排出；切换连通阀至捕 集位置，将在第一分离柱进行馏分后含待测成分的溶液，由连通阀的第6接口进入，切换经 第1接口，经管线进入第二分离柱进行分离捕集;上述运行时间为7~12.5min。切换连通阀 位置，然后打开第二维液相色谱，同时切断连通阀的第6接口与第1接口的连通，第二维流动 相由连通阀的第2接口反相进入，切换经第1接口，经管线将第二分离柱中分离出的待测成 分冲洗出；上述运行时间为12.5~20min。再将冲洗出的待测成分，切换依次经连通阀的第4 接口、第3接口，经管线进入质谱装置进行测定;上述运行时间为20~28min。还可以打开补 偿栗，补偿流动相与所述第一分离柱进行馏分后含待测成分的溶液，经管线进入混合器后 混合，再进入连通阀的第6接口。
[0191] 实施例2
[0192] 1、样品前处理
[0193] 选取20支卷烟烟支，点燃后采用滤片捕集方式捕集卷烟烟气，具体采用20孔道转 盘式吸烟机抽吸卷烟，根据GB/T 19609-2004中规定方法捕集烟气，使烟气吸附于剑桥滤片 上。将剑桥滤片置于l〇〇mL锥形瓶中加入萃取溶液，置于超声波发生器内进行超声萃取 40min，萃取溶液为20ml 0.1mol/L NH4Ac水溶液，0.1mol/L NH4Ac水溶液是通过称取3.85g 乙酸铵，用水完全溶解后，转移至500ml容量瓶中，加水定容得到。萃取溶液中还加入内标溶 液，内标溶液通过分别称取NNN-cU、NNK-cU、NAT-cU、NAB-cU，加入甲醇定容后获得。内标溶液 的加入量为lmL 400ng/mL。然后经0.22M1水相滤膜过滤后，移至色谱分析瓶中，即得待测样 品溶液。
[0194] 2、标准溶液的配制
[0195] 分别移取10ml浓度为0.1mg/ml的财8、财1^顺、顺1(的标准品，置于10〇11^容量瓶 中，加入甲醇定容，配成混合标准储备溶液。混合标准储备溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的浓度 均为lOμg/ml。同时，分别移取一定体积的d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK内标物，加入甲醇 定容，配成内标溶液，内标溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的浓度均为400ng/ml。
[0196] 分别准确移取不同体积混合标准储备溶液，置于多个100mL容量瓶中，再分别准确 加入一定体积的内标溶液，用甲醇定容，配制为一系列混合标准溶液。配制的系列混合标准 溶液浓度为〇. 25、0.5、1.0、2.5、25、50和100ng/mL，其中内标物浓度为10ng/ml。
[0197] 3、样品含量的测定
[0198] 分别将2配制的标准溶液和1中待测样品溶液分别进行双柱液相色谱质谱联用系 统检测，即将混合标准储备溶液和待测样品溶液在第一维液相色谱作用下，通过第一分离 柱进行馏分后，在第二维液相色谱作用下，由所述第二分离柱进行分离，再由所述质谱装置 进行测定，比较保留时间、质谱扫描进行定性，确定待测液中4种亚硝胺成分；同时采用内标 标准曲线法进行MRM定量，获得待测液中4种亚硝胺成分的含量。
[0199] 具体来说，内标标准曲线法是先将上述2中一系列不同浓度的混合标准溶液分别 进行双柱液相色谱质谱联用系统检测，分别获得4种亚硝胺成分/相应内标物的二级选择离 子峰面积比与4种亚硝胺成分/相应内标物的质量浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作 曲线，以4种亚硝胺成分与相应内标物的二级选择离子峰面积比为纵坐标(Y轴），其4种亚硝 胺成分与相应内标物的质量浓度比为横坐标(X轴），分别计算得到4种亚硝胺成分标准工作 曲线的回归方程。再将上述1中待测液进行双柱液相色谱质谱联用系统检测，将获得的待测 液中4种亚硝胺成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比，代入相应的4种亚硝胺成分标 准工作曲线的回归方程，并根据加入相应内标物的已知质量浓度，计算得到待测液中4种亚 硝胺成分的质量浓度。
[0200] 其中，所述第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱:Agilent Technologies 1260Inf inity正相液相色谱;柱温:30°C ;流速：lmL/min;进样量：lOyl;流动相A相：lOmmol/ L KH2P〇4+5mmol/L H3P〇4+85%H2〇+15%CH3CN(pH=2.8);流动相B相：10mmol/L KH2PO4+ 5mmol/L H3P〇4+0.5mol/L KCl+85%H2〇+15%CH3CN(pH=2.8);梯度洗脱。
[0201]如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
[0202] 〇-5min，A相:B 相体积比为100:0-90:10;
[0203] 5-5 ? lmin，A相:B 相体积比为90:10-60:40;
[0204] 5 ? l-15min，A相:B 相体积比为60:40-0:100;
[0205] 15-15 ? lmin，A相:B 相体积比为0:100-100:0;
[0206] 15. l-40min，A相:B相体积比为 100:0-100:0。
[0207] 所述第一分离柱为强阳离子交换色谱柱(SCX)，所述强阳离子交换色谱柱(SCX)为 Waters Spherisorb S5SCX柱（4.6*150mm，5iim)〇
[0208] 在第一维液相色谱作用下，第一分离柱进行馏分后将目标物馏分的pH值调节至中 性，采用中心切割法，获得4种亚硝胺成分的馏分。第一分离柱分离出的目标物馏分的色谱 峰的切割完整，在第二维液相色谱作用下，转移至第二分离柱捕集保留，其它非目标物馏分 不进第二分离柱。
[0209] 所述第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱：Agilent Technologies 12601]1；1^11；[丨7反相液相色谱(1^1^0;柱温：30<€;流速:0.2511117111；[11 ;进样量：10111;流动相八 相：5mmol/L NH4Ac+95 %H20+5 %CH3CN;流动相B相：5mmol/L NH4Ac+95%CH3CN+5%H20;梯度 洗脱。
[0210] 如表3所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
[0211] 〇-l〇min，A相:B 相体积比为 100:0-100:0;
[0212] 10-20min，A相:B 相体积比为 100:0-0:100;
[0213] 20-22min，A相:B 相体积比为0:100-0:100;
[0214] 22-22 ? lmin，A相:B 相体积比为0:100-100:0;
[0215] 22-25min，A相:B 相体积比为 100:0-100:0。
[0216] 所述第二分离柱为Trap捕集柱，所述Trap捕集柱为Thermo scientificAcclaim Polar Advantage II Cl 8柱（4.6*50mm，3iim) 〇
[0217] 所述质谱装置的条件为：
[0218] 质谱:Agilent Technologies 6460Triple Quad MS三重四极杆质谱；电离方式： 电喷雾离子源（ESI);扫描方式：多反应监测（MRM);MRM条件：见表3;喷雾（IS)电压为： 5000V;雾化气(Gas 1)压力为:482 ? 6kPa;气帘气(Curtain Gas)压力为:206 ? 7kPa;辅助雾化 气（Gas2)压力为：482 ? 6kPa;离子源温度（TEM)为：500°C ;清洗进样针程序:needle wash 30s;质谱流路切换:从lOmin开始扫描，28min结束。
[0219] 另外，本发明的双柱液相色谱质谱联用系统在具体测定时，如图1所示，所述第一 维液相色谱与第一分离柱之间设有进样阀。
[0220] 如图1所示，所述进样阀为二位六通阀，所述进样阀设有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口为进样口，所述第3接口为排废口，所述第1接 口经管线与第一维液相色谱相连通，所述第6接口经管线与第一分离柱相连通。
[0221] 如图1所示，所述第一分离柱与第二维液相色谱之间设有连通阀，所述连通阀与第 一分离柱之间设有混合器，所述混合器分别与所述第一分离柱、连通阀相连通。
[0222] 如图1所示，所述连通阀为二位六通阀，所述连通阀设有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口经管线与第二分离柱的进样端相连通，所述第 4接口经管线与第二分离柱的出样端相连通，所述第2接口经管线与第二维液相色谱相连 通，所述第3接口经管线与质谱装置相连，所述第5接口为排废口，所述第6接口经管线与混 合器相连通。
[0223] 如图1所示，所述第5接口还连接有紫外检测器，所述紫外检测器经管线与第5接口 相连通。所述紫外检测器的检测波长为230nm。
[0224] 如图1所示，采用双柱液相色谱质谱联用系统进行测定时，打开第一维液相色谱和 进样阀，第一维流动相由进样阀的第1接口进入，同时待测样品溶液由进样阀的第4接口进 入，经第5接口，与第一维流动相在第6接口混合后，经管线进入第一分离柱进行馏分;多余 的第一维流动相，由进样阀的第1接口切换经第2接口至第3接口经管线排出；上述运行时间 为0~7min。打开连通阀，将在第一分离柱进行馏分后不含待测成分的溶液，经管线由连通 阀的第6接口进入，流到第5接口，经管线进入紫外检测器进行测定后排出；切换连通阀至捕 集位置，将在第一分离柱进行馏分后含待测成分的溶液，由连通阀的第6接口进入，切换经 第1接口，经管线进入第二分离柱进行分离捕集;上述运行时间为7~12.5min。切换连通阀 位置，然后打开第二维液相色谱，同时切断连通阀的第6接口与第1接口的连通，第二维流动 相由连通阀的第2接口反相进入，切换经第1接口，经管线将第二分离柱中分离出的待测成 分冲洗出；上述运行时间为12.5~20min。再将冲洗出的待测成分，切换依次经连通阀的第4 接口、第3接口，经管线进入质谱装置进行测定;上述运行时间为20~28min。还可以打开补 偿栗，补偿流动相与所述第一分离柱进行馏分后含待测成分的溶液，经管线进入混合器后 混合，再进入连通阀的第6接口。
[0225] 实施例3
[0226] 如上述实施例2中2所示，分别准确移取混合标准储备溶液，采用甲醇定容，配制浓 度为0.25、0.5、1.0、2.5、25、50和100ng/mL的一系列混合标准溶液，其中内标物浓度为 10ng/ml〇
[0227] 将上述配制好的一系列不同浓度的混合标准溶液分别进行双柱液相色谱质谱联 用系统检测，以4种亚硝胺成分与相应内标物的二级选择离子峰面积比为纵坐标(Y轴），其4 种亚硝胺成分与相应内标物的质量浓度比为横坐标(X轴），进行回归分析，得到回归方程的 线性关系良好，在0.25~100.00ng/mL的线性浓度范围内，4种亚硝胺成分的回归方程的相 关系数R均大于0.999。
[0228] 对混合标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样10次，进行双 柱液相色谱质谱联用系统分析，以3倍信噪比为方法的检出限(L0D)，10倍信噪比为定量限 (L0Q)，换算为样品含量后得出NNK的方法检出限为0.77ng/cig，定量限为2.56ng/cig ;NAB 的方法检出限为0.16ng/cig，定量限为0.55ng/cig;NAT的方法检出限为0.57ng/cig，定量 限为1.89ng/cig;NNN的方法检出限为0.46ng/cig，定量限为1.52ng/cig;具有较高的灵敏 度。
[0229] 实施例4
[0230]取相同烤烟型卷烟考察方法的回收率、日内重复性、日间重复性，即选取已知亚硝 胺浓度样品，加入已知浓度的混合标准溶液，然后进行上述实施例2中1的前处理，并进行双 柱液相色谱质谱联用系统分析，计算其回收率。同时对同一待测样品溶液分别在1日内、日 间进行平行测定5次(n = 5)，得到4种亚硝胺成分的精密度测定数据，结果见表4。
[0231] 由表4可以看出，目标物方法的回收率在93.5~106.2%之间，日内重复性的相对 标准偏差(RSD)在2.7~4.9 %之间，日间重复性的相对标准偏差(RSD)在3.8~5.9 %之间， 说明本发明方法的回收率高、准确性和重复性好，可以满足定量需要。
[0232] 表4 4种亚硝胺成分的回收率和精密度
[0233]
[0234] 实施例5
[0235] 采用双柱液相色谱串联质谱法与传统一维液相色谱串联质谱的方法进行比较，分 别选取llmg烤烟型卷烟。第一组采用传统一维液相色谱串联质谱的方法，参考标准YC/ T184-2004,具体结果见图2。第二组采用上述实施例2中1的前处理，并进行双柱液相色谱质 谱联用系统分析，具体结果见图3。
[0236] 通过对图2中2a~2e和图3中3a~3e所示，可以发现，采用双柱液相色谱串联质谱 法使四种物质分离度、检测灵敏度上均有显著提升，NNN、NAT和NNK在两维液相分离基本完 全去除杂质干扰，NAB与干扰峰实现基线分离。
[0237] 实施例6
[0238] 采用如实施例2中的本发明的分析方法测定3R4F卷烟主流烟气中TSNAs的释放量， 其顺1顺1(、嫩1'、嫩8含量分别为106、91、113和13.81^/(^8，与2011年(：01^514组织的19家实 验室共同实验数据平均值进行了比较，采用本方法的测定结果与C0RESTA共同实验均值RSD 在5.5%以内，表明双柱液相色谱串联质谱法方法测卷烟烟气TSNAs释放量准确可靠。
[0239] 另外，选取不同盒标焦油的混合型和烤烟型卷烟，采用如实施例2中的本发明的分 析方法进行测定，结果见表5。由表5可知，混合型卷烟NNN释放量范围59.0~347ng/cig，NAT 释放量范围126~201ng/cig，NAB释放量范围16.5~25 . lng/cig，NNK释放量范围59.0~ 81 ? 5ng/cig。烤烟型卷烟NNN释放量范围4.6~8 ? 7ng/cig，NAT释放量范围14.6~29 ? 5ng/ cig，NAB释放量范围1.2~2.8ng/cig，NNK释放量范围4.4~5.4ng/cig。与传统方法测定样 品的含量水平一致，该方法具有较好的准确性。其中，样品的含量(ng/cig)是将本发明的分 析方法测定的样品浓度(ng/mL) X 20mL/20cig后获得。
[0240] 表5部分市售卷烟TSNAs释放量
[0241]
[0242] 综上所述，本发明表明，运用双柱液相色谱串联质谱法分析卷烟主流烟气亚硝胺 释放量本，具有较好的效果，结果显示：该方法灵敏度高、重复性好、准确度高，标准卷烟 3R4F定量结果与⑶RESTA共同实验均值相对标准偏差在5.5%以内。因此，在线双柱液相色 谱串联质谱法准确可靠、检测限低，适应各种类型卷烟特别是低TSNAs释放量卷烟烟气测 定。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0243] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的分析方法，对卷烟烟气 进行样品前处理，采用双柱液相色谱串联质谱系统对前处理所得待测样品进行定性定量分 析，所述双柱液相色谱串联质谱系统包括有第一维液相色谱、第一分离柱、第二维液相色 谱、第二分离柱、质谱装置。2. 根据权利要求1所述的一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法，其特征在于，所述卷烟烟气中亚硝胺包括有N-亚硝基去甲基烟碱、4-(甲基亚硝 基氨基)-1-( 3-比啶基)-1 - 丁酮、N-亚硝基假木贼碱和N-亚硝基新烟草碱。3. 根据权利要求1所述的一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法，其特征在于，所述样品前处理包括以下步骤： 1) 选取卷烟烟支，点燃后进行抽吸，采用滤片捕集方式捕集卷烟烟气； 2) 将滤片进行超声萃取后过膜，即得待测样品。4. 根据权利要求1所述的一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法，其特征在于，所述采用双柱液相色谱串联质谱系统对前处理所得待测样品进行 定性定量分析，包括以下步骤： A) 配制标准样品:配制混合标准储备溶液、内标溶液和混合标准溶液； B) 样品定性检测:分别将步骤A)配制的标准样品和经样品前处理后待测样品进行双柱 液相色谱串联质谱系统检测，在第一维液相色谱作用下，通过第一分离柱进行馏分后，在第 二维液相色谱作用下，由所述第二分离柱进行分离，再由所述质谱装置进行测定，比较保留 时间、质谱扫描进行定性，确定待测样品中4种亚硝胺成分； C) 样品定量检测:分别将步骤A)配制的标准样品和经样品前处理后待测样品进行双柱 液相色谱串联质谱系统检测，在第一维液相色谱作用下，通过第一分离柱进行馏分后，在第 二维液相色谱作用下，由所述第二分离柱进行分离，再由所述质谱装置进行测定，采用内标 标准曲线法进行MRM定量，获得待测样品中4种亚硝胺成分的含量。5. 根据权利要求4所述的一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法，其特征在于，步骤B)或C)中，所述第一分离柱为强阳离子交换色谱柱;所述第一 维液相色谱的条件为：第一维液相色谱：正相液相色谱；柱温：25-35°C ;流速:0.5-1.5mL/ min;进样量：5-15μ1;第一维流动相A相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L H3P〇4+8〇-90%H20 + 10-20%CH3CN，pH=2-4;第一维流动相B相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L Η3Ρ〇4+0·1-1 · Omol/L KC1+80-90%H20+10-20 %CH3CN，pH=2-4;梯度洗脱。6. 根据权利要求5所述的一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为： 0-5min，A相:B相体积比为 100:0-90:10; 5-5 · lmin，A相:B相体积比为90:10-60:40; 5.1-1511^114相:8相体积比为60:40-0:100 ; 15-15 .lmin，A相:B相体积比为0:100-100:0; 15 .l-40min，A相:B相体积比为 100:0-100:0。7. 根据权利要求4所述的一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法，其特征在于，步骤B)或C)中，所述第二分离柱为Trap捕集柱;所述第二维液相色 谱的条件为:第二维液相色谱:反相液相色谱;柱温:25-35°C ;流速:0.2-0.3mL/min; 进样量：5-15μ1;第二维流动相A相：l-10mmol/L NH4AC+92-98%H20+2-8%CH3CN;第二 维流动相B相：1-1 Ommo 1/L NH4Ac+92-98 % CH3CN+2-8 % H20;梯度洗脱。8. 根据权利要求7所述的一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为： 0-10min，A相:B相体积比为 100:0-100:0; 10-20min，A相:B相体积比为 100:0-0:100; 20-22min，A相:B相体积比为0:100-0:100; 22-22 · lmin，A相:B相体积比为0:100-100:0; 22-25min，A相:B相体积比为 100:0-100:0。9. 根据权利要求4所述的一种双柱液相色谱串联质谱法对卷烟烟气中亚硝胺释放量的 分析方法，其特征在于，步骤B)或C)中，所述质谱装置的条件为： 质谱:Agilent Technologies 6460Triple Quad MS三重四极杆质谱；电离方式：电喷 雾离子源;扫描方式:多反应监测MRM;喷雾电压为:5000V;雾化气压力为:482.6kPa;气帘气 压力为：206 · 7kPa;辅助雾化气压力为:482 · 6kPa;离子源温度为：500°C ;清洗进样针程序： needle wash 30s;质谱流路切换:从10min开始扫描，28min结束。10. -种双柱液相色谱串联质谱系统，其特征在于，包括有第一维液相色谱（1)、进样阀 (2) 、第一分离柱(3)、混合器(4)、连通阀（6)、第二维液相色谱(8)、第二分离柱(5)、质谱装 置(9)、紫外检测器(7)，所述进样阀（2)分别经管线与所述第一维液相色谱（1)、第一分离柱 (3) 的进样端相连通，所述连通阀（6)分别经管线与所述混合器(4)、第二维液相色谱(8)、第 二分离柱(5)、质谱装置(9)、紫外检测器(7)相连通，所述混合器(4)还经管线与所述第一分 离柱(3)的出样端相连通。11. 根据权利要求10所述的一种双柱液相色谱串联质谱系统，其特征在于，所述进样阀 (2)为二位六通阀，所述进样阀设有第1接口（21)、第2接口（22)、第3接口（23)、第4接口 (24 )、第5接口（ 25 )、第6接口（ 26 )，所述第4接口（ 24)为进样口，所述第3接口（ 23)为排废口， 所述第1接口（21)经管线与第一维液相色谱（1)相连通，所述第6接口（26)经管线与第一分 离柱(3)的进样端相连通。12. 根据权利要求10所述的一种双柱液相色谱串联质谱系统，其特征在于，所述连通阀 (6)为二位六通阀，所述连通阀设有第1接口（61 )、第2接口（62 )、第3接口（63 )、第4接口 (64) 、第5接口（65)、第6接口（66)，所述第1接口（61)经管线与第二分离柱(5)的进样端相连 通，所述第4接口（64)经管线与第二分离柱(5)的出样端相连通，所述第2接口（62)经管线与 第二维液相色谱（8)相连通，所述第3接口（63)经管线与质谱装置（9)相连，所述第5接口 (65) 为排废口，所述第5接口（65)经管线与紫外检测器(7)相连通，所述第6接口（66)经管线 与混合器(4)相连通。13. 根据权利要求10所述的一种双柱液相色谱串联质谱系统，其特征在于，所述混合器 (4) 还连接有补偿栗（10)，所述补偿栗（10)经管线与混合器(4)相连通。14. 根据权利要求13所述的一种双柱液相色谱串联质谱系统，其特征在于，所述补偿栗 (10)的条件为:补偿流动相为：l_10mm〇l/L K2HPO4;流速:0.6-1 .OmL/min。15. -种双柱液相色谱串联质谱系统的使用方法，包括以下步骤： a)打开第一维液相色谱和进样阀，第一维流动相由进样阀的第1接口进入，同时待测样 品溶液由进样阀的第4接口进入，经第5接口，与第一维流动相在第6接口混合后，经管线进 入第一分离柱进行馏分； b) 多余的第一维流动相，由进样阀的第1接口切换经第2接口至第3接口经管线排出； c) 打开连通阀，将在步骤a)中第一分离柱进行馏分后不含待测成分的溶液，经管线由 连通阀的第6接口进入，流到第5接口，经管线进入紫外检测器进行测定后排出； d) 切换连通阀至捕集位置，将在步骤a)中第一分离柱进行馏分后含待测成分的溶液， 由连通阀的第6接口进入，切换经第1接口，经管线进入第二分离柱进行分离捕集； e) 切换连通阀位置，然后打开第二维液相色谱，同时切断连通阀的第6接口与第1接口 的连通，第二维流动相由连通阀的第2接口反相进入，切换经第1接口，经管线将第二分离柱 中分离出的待测成分冲洗出； f) 步骤e)中冲洗出的待测成分，切换依次经连通阀的第4接口、第3接口，经管线进入质 谱装置进行测定。16.根据权利要求15所述的一种双柱液相色谱串联质谱系统的使用方法，其特征在于， 步骤d)中，打开补偿栗，补偿流动相与所述第一分离柱进行馏分后含待测成分的溶液，经管 线进入混合器后混合，再进入连通阀的第6接口。
【文档编号】G01N30/88GK106053675SQ201610625682
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月2日
【发明人】陈敏, 王磊君, 吴达, 刘百战
【申请人】上海烟草集团有限责任公司