一种液相色谱高分辨质谱测定土壤中草甘膦残留量的方法与流程

本发明涉及农业生产技术领域，具体是涉及一种液相色谱高分辨质谱测定土壤中草甘膦残留量的方法。

背景技术：

土壤是自然生态环境的一个重要组成部分，更是一个复杂的多介质载体，同时也是除草剂的重要归属。草甘膦化学名为N-膦羟甲基甘氨酸，因为其高效、低毒等优点，成为广泛使用的除草剂之一，自推向市场以来，广泛的用于各种杂草的防除，非农田杂草的治理；草甘膦在环境和生物体内不断富集，通过食品和饮用水进入体内，对人体造成伤害；绿色和平组织的分析报告也提出：广泛使用除草剂草甘膦是不安全的，对生殖健康、癌症和神经系统都有影响。因此对土壤中或其他介质中草甘膦残留量的检测、管理就显得格外的重要。

目前土壤中草甘膦的检测方法一般有高效液相色谱柱前柱后衍生法、气相色谱法、液质联用法、气质联用法，相对于气相色谱，液相色谱更适用于分析高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物，但由于草甘膦缺少必要的官能团，因此样品检测需要前处理以及柱前、柱后衍生，操作较为繁琐。周艳明等采用水提取、柱前衍生、液相色谱荧光检测器检测水中的草甘膦，近年来，检测器的不断改进，提高了检测的灵敏度和效率.Kusters等采用阳离子交换柱富集草甘膦，然后进行液相色谱测定。到90年代大量采用的气相色谱和气相色谱-质谱方法(GC-MS)，这两种方法使得草甘膦的检测灵敏度较之液相色谱高了很多。也有人用用水浸提出香蕉中的草甘膦(PMG)和代谢产物AMPA，利用阳离子交换固相萃取(SPE)小柱净化处理后在三氟乙酸酐和七氟丁醇的混合液中进行衍生化；随后用GC-MS定性定量。高效液相色谱－质谱联用技术(high performance liquid chromatography-mass spetrometry HPLC-MS)是一种利用内喷射式和粒子流式接口技术将液相色谱与质谱联接起来的检测方法，原理与气相色谱－质谱联用技术相似。随着近年来液相色谱-质谱联用技术的出现和进一步发展，高分辨质谱在原有HPLC-MS的基础上增加了高分辨模式，对草甘膦的结构式的分析能力有了进一步的提高，并且高分辨质谱则对草甘膦的分析检测更灵敏、更准确，提高了草甘膦定性和定量的可靠性。

由于草甘膦没有紫外吸收又不易挥发，采用气相色谱或高效液相色谱检测，往往借助于柱前衍生化处理，测定步骤较为复杂；更重要的是土壤中草甘膦残留量检测的前处理过程较为复杂，工作量大、时间长。寻找一种快速、简便、高效的检测分析方法迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明是针对现有技术对土壤中的草甘膦残留量的测定方法太复杂、工作量大、时间长，准确度和灵敏度不高的问题，提供了一种液相色谱高分辨质谱测定土壤中草甘膦残留量的方法。

本发明的技术方案是：

一种液相色谱高分辨质谱测定土壤中草甘膦残留量的方法，包括以下步骤：

1)土壤样品中草甘膦残留量的氢氧化钾提取

称取5.0g土壤样品至于塑料离心管中，加入20ml浓度20％氢氧化钾，进行振荡离心处理，提取液用50ml二氯甲烷萃取两次，5000r/min离心5min，收集水层待净化。

2)样品提取液的分散固相萃取净化

取水层溶液，加入经5mL甲醇活化的CAX(AG 50W-X8,0.8cm*4cm)小柱，待水层全部通过小柱后，用10ml洗脱液(160ml水+40ml甲醇+3ml盐酸)洗脱，收集洗脱液，60℃下旋转蒸发至干，用1.0ml 5％硼酸溶解，用20％氢氧化钾和3mol/l盐酸调节溶液的pH在9.0左右，过0.22微米尼龙滤膜即为样品溶液。

3)使用液相色谱—高分辨质谱仪检测

a)标准溶液的制备：准确称取草甘膦标准品用水和两滴盐酸(1.18g/cm3)溶解，配置成1.0mg/l的标准储备液，再用水稀释成标准中间溶液。

b)使用液相色谱—高分辨质谱仪检测标准工作液和净化后的样品溶液，由自动进样器分别吸取标准中间溶液和样品溶液，注入液相色谱—质谱分析器中，样品溶液经色谱柱分离，高分辨质谱选择扫描模式检测。

4)结果分析

定性和定量：以化合物的准分子离子峰的精确质量数为定性离子和定量离子；以标准中间液的质量浓度X为横坐标，定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行外标法定量；用样品溶液出现的色谱峰保留时间和定性离子(精确质量数)进行定性。

进一步地，在上述方案中，所述的步骤1)中振荡混匀后超声提取30min，再振荡提取30min。移出上清液用25ml二氯甲烷萃取一次，再用25ml二氯甲烷萃取一次，水层溶液待净化。

进一步地，在上述方案中，液相色谱的条件：超纯水为流动相，流速0.2ml/min，两通代替色谱柱；质谱条件：质量分析器：能提供精确质量数的质量分析器；扫描模式：负离子-选择离子扫描；质量范围：167.50-168.50；分辨率60000；离子源：电喷雾离子源；喷雾电压2.5KV，辅助气压力0.5Mpa。

采用高分辨质谱负离子选择扫描模式,目标物的定性定量离子为草甘膦分子失去质子的负离子，且为精确质量数。

本发明的有益效果是：本发明用氢氧化钾提取土壤中的草甘膦残留，用二氯甲烷除去土壤中的有机物，用CAX小柱净化；用液相色谱-高分辨质谱对土壤样品中草甘膦的精确质量数进行的定性和定量分析，不仅可以消除其他非目标化合物的干扰，还进一步提高了草甘膦定性的准确性和定量的可靠性。

本发明中草甘膦残留量的质量准确度小于1ppm，其样品的最低检出限为0.01mg/kg,添加回收率70％—95％，相对标准偏差小于15％。

附图说明

图1是草甘膦溶液(100.0ppb)的总离子流图；

图2是草甘膦溶液(100.0ppb)的高分辨质谱图。

具体实施方式

采集某某农田中深10cm处的土壤，作为待测样品，采样液相色谱高分辨质谱测定土壤中草甘膦残留量，包括以下步骤：

1)土壤样品中草甘膦残留量的氢氧化钾提取

称取5.0g土壤样品至于塑料离心管中，加入20ml浓度20％氢氧化钾，进行振荡离心处理，振荡混匀后超声提取30min，再振荡提取30min，移出上清液用25ml二氯甲烷萃取一次，再用25ml二氯甲烷萃取一次，水层溶液待净化；提取液用50ml二氯甲烷萃取两次，5000r/min离心5min，收集水层待净化。

2)样品提取液的分散固相萃取净化

取水层溶液，加入经5mL甲醇活化的CAX(AG 50W-X8,0.8cm*4cm)小柱，待水层全部通过小柱后，用10ml洗脱液(160ml水+40ml甲醇+3ml盐酸)洗脱，收集洗脱液，60℃下旋转蒸发至干，用1.0ml 5％硼酸溶解，用20％氢氧化钾和3mol/l盐酸调节溶液的pH在9.0左右，过0.22微米尼龙滤膜即为样品溶液。

3)使用液相色谱—高分辨质谱仪检测

a)标准溶液的制备：准确称取草甘膦标准品用水和两滴盐酸(1.18g/cm3)溶解，配置成1.0mg/l的标准储备液，再用水稀释成标准中间溶液。

b)使用液相色谱—高分辨质谱仪检测标准工作液和净化后的样品溶液，由自动进样器分别吸取标准中间溶液和样品溶液，注入液相色谱—质谱分析器中，样品溶液经色谱柱分离，高分辨质谱选择扫描模式检测。

其中，液相色谱的条件：超纯水为流动相，流速0.2ml/min，两通代替色谱柱；质谱条件：质量分析器：能提供精确质量数的质量分析器；扫描模式：负离子-选择离子扫描；质量范围：167.50-168.50；分辨率60000；离子源：电喷雾离子源；喷雾电压2.5KV，辅助气压力0.5Mpa。

4)结果分析

定性和定量：以化合物的准分子离子峰的精确质量数为定性离子和定量离子；以标准中间液的质量浓度X为横坐标，定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行外标法定量；用样品溶液出现的色谱峰保留时间和定性离子(精确质量数)进行定性。

采用高分辨质谱负离子选择扫描模式，目标物的定性定量离子为草甘膦分子失去质子的负离子，且为精确质量数。

最终得到的草甘膦溶液(100.0ppb)的总离子流图如图1所示，草甘膦溶液(100.0ppb)的高分辨质谱图如图2所示。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。