液相色谱-质谱联用对分析物进行高效分离鉴定的方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用液相色谱-质谱联用对分析物进行高效分离鉴定的方法，使用三氟乙酸作为液相色谱流动相添加剂，在密闭的电喷雾离子源处引入挥发性酸气体，通过向离子化区域中引入挥发性酸气体来降低或消除三氟乙酸对电喷雾质谱检测信号的抑制，提高质谱检测的分辨率和灵敏度。该分离鉴定方法简单，只需要从密闭电喷雾离子源处引入挥发性酸即可以降低或消除三氟乙酸对电喷雾质谱检测信号的抑制，提高质谱检测的分辨率和灵敏度。
【专利说明】
液相色谱-质谱联用对分析物进行高效分离鉴定的方法
技术领域
[0001] 本发明属于液相色谱-质谱联用的研究技术领域，具体设及一种提高分析物色谱 分离分辨率和质谱检测灵敏度，从而实现分析物的高效分离鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 液相色谱-质谱联用是常见的分离鉴定技术。在流动相中加入离子对试剂， 如S氣乙酸（TFA)，甲酸等，有助于获得更好的分离效率。尽管S氣乙酸在分离方面上 展现出比甲酸更优越的分离效果（文献l.Ga;rcia,M.C. ;Hogenboom,A.C. ;Zappey,比； Irth, H. , Effect of the mobile phase composition on the separation and detection of int曰ct proteins by reversed-ph曰se liquid chrom曰togr曰phy-electrospr曰y m曰ss spectrometiT. Journal of C虹omatogra地y. A 2002,957 (2),187-99.)，但由于 S 氣 乙酸会抑制离子化效率，与目前高通量鉴定蛋白质的质谱不兼容（文献2. Apffel，A.; Fischer, S. ；Goldberg, G. et al. Enhanced Sensitivity for Peptide-Mapping with Electrosprsy Liquid-Chrom曰togr曰phy M曰ss-Spectrometry in the Presence of Sign曰I Suppression Due to Trifluoroacetic Acid-Containing Mobile Phases. Journal of C虹omatography A 1995, 712 (I), 177-190.)，因此，许多研究工作人员通过各种方法降低 =氣乙酸的离子抑制效应。
[0003] Kuhlman等在柱后添加含丙酸的异丙醇溶液，破坏分析物与TFA形成的离子对， 释放出分析物从而降低离子抑制作用，该方法有显著缺点是会造成样品的稀释（文献 3. Kuhlmann, F. E. ;Apffel,A. ；Fischer, S. M. et al. Signal enhancement for gradient reverse-ph曰Se high-perform曰nce liquid chrom曰togr曰phy-electrospr曰y ioniz曰tion mass spectrometry analysis with trifIuoroacetic and other strong acid modifiers by postcolumn addition of propionic acid and isopropanol. J Am Soc Mass Spectrom 1995,6(12)，1221-5.) ;Corradini等降低流动相中的S氣乙酸的浓度，在色谱分离与质谱 检测中需要寻找合适的浓度鉴定分析物（文献4. Corradini, D. ;Hube;r，C.G. Jimperio, A. M. ;Zolla, L.，民esolution and identification of the protein components of the photosystem II antenna system of higher plants by reversed-phase liquid chromatography with electrospray-mass spectrometric detection. Journal of C虹omatography. A 2000, 886(1-2), 111-21.);还有研究人员在流动相中额外加甲酸等挥 发性酸（文献5.化u,J. ;Wang,L. ;Saji,M.et al. Hi曲-sensitivity TFA-free LC-MS for profiling histones. Proteomics 2011, 11 (16), 3326-34.)，该方法其他添加剂仍存在于 流动相中不利于有效分离；刘虎威等在色质联用的接口中采用双极膜电渗析的方法去除流 动相的TFA(文献6.北京大学.一种S氣乙酸去除装置及其应用：中国，CN201110345371. X[P]. 2012-6-20.)，但搭建装置复杂，需要合适的流速电压，更换液体等缺点。
[0004] 本发明正是利用上述文献提及的酸能有效降低TFA的抑制效应，将挥发性的高浓 度酸气体直接引入密闭的电喷雾离子源处，在分析物的液滴爆裂的过程中，高浓度的酸竞 争性结合=氣乙酸根负离子并实现质子化，破坏=氣乙酸与分析物的作用，释放分析物，从 而尽可能地消除=氣乙酸对质谱离子信号的抑制作用，进而在有效分离的基础上实现分析 物的高效鉴定。
【发明内容】
阳〇化]本发明是向流动相添加剂为=氣乙酸的液相色谱中引入挥发性酸，来消除=氣乙 酸对质谱离子信号的抑制作用，达到液相色谱-质谱联用对分析物进行高效分离鉴定的目 的。 阳006] 本发明的技术方案为：
[0007] 本发明所述的液相色谱-质谱联用系统对分析物高效的分离鉴定方法为：使用= 氣乙酸作为液相色谱流动相添加剂，并在密闭的电喷雾离子源处引入挥发性酸气体消除= 氣乙酸对电喷雾质谱检测信号的抑制。
[0008] 所述的挥发性酸为甲酸、乙酸、丙酸、下酸等可用于质谱的挥发性酸中的一种或两 种W上混合，挥发性酸的纯度为98%-100%，挥发性酸的引入总量是离子化区域中=氣乙 酸的质量的7000倍至90 000倍。挥发性酸向液相色谱引入的方法是通过质谱抽真空的累 使得封闭的电喷雾离子源处于0.0 STorr甚至更低的负压，迫使空气协同挥发性酸气体进 入密闭电喷雾离子源处，所述的挥发性酸使用的液相色谱分离流动相为水和乙腊，其中添 加剂S氣乙酸浓度范围为0.001 % -20. 000%。
[0009] 挥发性酸对=氣乙酸的作用机理为：
[0010] 本发明提出的将挥发性酸气体引入密闭电喷雾离子源处，使得分析物离子化区域 中存在的高浓度的挥发性酸气体，竞争性结合并质子化=氣乙酸根负离子，破坏=氣乙酸 与分析物的作用，释放分析物，从而尽可能地消除=氣乙酸对质谱离子信号的抑制作用，有 效地提高分析物的离子信号强度，进而提高分析物的分离鉴定效率。
[0011] 本发明的有益效果为：
[0012] 该分离鉴定方法简单，只需要从密闭电喷雾离子源处引入挥发性酸即可W降低或 消除=氣乙酸对电喷雾质谱检测信号的抑制，提高质谱信号，进而提高检测的分辨率和灵 敏度。
【附图说明】
[0013] 图1为仪器的简略图，采用封闭离子源的液相色谱质谱联用，其中，挥发性酸气体 在负压下通过质谱抽真空的累进入密闭电喷雾离子源处。
[0014] 图2为甲酸和=氣乙酸作为流动相添加剂时，核糖核酸酶、细胞色素 C、溶菌酶、肌 红蛋白的色谱基峰图；其中，A图为流动相中添加0. 1%体积分数的甲酸，B图为流动相中添 加0. 05%体积分数的=氣乙酸。
[0015] 图3为=氣乙酸作为添加剂的情况下，于分析物离子化区域引入不同挥发性酸的 色谱基峰图，其中，图3A为未引入酸，图3B为引入了甲酸，图3C为引入了乙酸，图3D为引 入了丙酸。
[0016] 图4为=氣乙酸作为添加剂的情况下，于分析物离子化区域引入丙酸与未引入丙 酸的色谱基峰图，其中，实线表示未引入丙酸，虚线表示引入了丙酸（PA)。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过实施例进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范 围之中，本发明使用的设备只是对本发明更好的公开，不限制本发明的应用范围。
[0018] 液相色谱采用化ermo公司的Accela 600HPLC系统，质谱采用Thermo公司的LTQ 化bitrap，封闭的离子源采用由好创生物开发的康达效应离子源CEESI，实施下述实验。
[0019] 实施例1流动相添加剂为甲酸或=氣乙酸对液相色谱质谱的影响 阳020] 选取标准蛋白核糖核酸酶（RNase)、细胞色素 C (切t C)、溶菌酶化ysozyme)、肌红 蛋白（Myoglobin)的混合样品作为分析物，液相色谱柱采用巧反相色谱柱（柱长130mm，内 径75 y m，填料孔径300 A )，流动相选择0. 1 %体积分数的甲酸或者0. 05 %体积分数的S 氣乙酸，流速约为20化L/min。分离梯度为：5min后乙腊相到达20 %，在45min上升至50 %， 在46111；[]1达到90%持续81]1；[]1，在551]1；[]1时水相平衡1〇1]1；[]1。离子源处不鼓入酸，质谱其他参 数如下：电压1.9kV，质谱范围500-2000m/z，分辨率60 000(在m/z 400处），采用数据依 赖模式将强度前5的母离子进入碰撞诱导裂解（CID)得到二级质谱的数据，碰撞能量设置 为35%。进样蛋白总量0. 6 y g，每个条件重复=次，观察其强度的变化。
[OOW 如图2A所示，当流动相添加剂是0. 1%体积分数的甲酸时，四种蛋白不能得到很 好的分离，如图2B所示，当流动相添加剂是0. 05%的=氣乙酸，四种蛋白得到很好的分离 并且峰形较好，但其信号强度大幅减弱。因此，=氣乙酸虽然能实现液相色谱的高效分离， 但是减弱了质谱信号，不利于分析物的高效鉴定。
[0022] 实施例2挥发性酸对S氣乙酸的去抑制作用
[0023] 选取标准蛋白核糖核酸酶（RNase)、细胞色素 C (切t C)、溶菌酶化ysozyme)、肌红 蛋白（Myoglobin)的混合样品作为分析物，液相色谱柱采用巧反相色谱柱（柱长130mm，内 径75 y m，填料孔径300 A )，流速约为200化/min。分离梯度为：5min后乙腊相到达20%， 在45min上升至50%，在46min达到90%持续8min，在55min时水相平衡lOmin。离子源处 分别鼓入空气，甲酸，乙酸，丙酸，S种酸的消耗量分别是4. 6血/min, 2. 64mL/min，0. 92血/ min。质谱参数如下：电压1.9kV，质谱范围500-2000m/z，分辨率60 000(在m/z 400处）， 采用数据依赖模式将强度前5的母离子进入碰撞诱导裂解（CID)得到二级质谱的数据，碰 撞能量设置为35%。进样蛋白总量0. 6 y g，每个条件重复=次，观察其强度的变化。
[0024] 从图3可W看出，在S氣乙酸作为流动相添加剂的情况下，鼓入了甲酸（图3B)、乙 酸（图3C)、丙酸（图3D)与不鼓入酸（图3A)的色谱基峰图相对比，随着酸的鼓入，S氣乙 酸的抑制作用减弱，强度得到有效的提高。其中，鼓入丙酸对应的色谱基峰图强度提高的最 多，乙酸次之，甲酸最弱，原因是由于酸的鼓入，竞争性结合了=氣乙酸根负离子，破坏=氣 乙酸与分析物的结合，释放分析物，从而使得信号提高。=种酸对整体蛋白的信号提高的比 值如表1所示，酸的鼓入提高了各个蛋白的强度，甲酸，乙酸，丙酸分别使蛋白的强度值平 均提高了 3倍，8倍，10倍。
[0025] 表1 S种酸对整体蛋白的信号提高的比值
[0026]
[0027] 实施例3、4为在流动相添加剂为S氣乙酸的基础上，引入酸后对分析物鉴定结果 影响的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。 阳0測实施例3
[0029] 分析物为大肠杆菌化12类）蛋白混合物，采用20mM DTT，40mM IAA的方法将二硫 键打开后，除盐冻干复溶。液相色谱柱采用巧反相色谱柱（柱长130mm，内径75 y m，填料孔 径30〇1)，流动相中含〇.〇5%体积分数的1。4，流速约为20化17111111。分析时间12〇111111，分 离梯度为：5min后乙腊相到达20 %，在95min上升至50 %，在97min达到80 %持续lOmin， 在IOSmin时水相平衡12min。离子源处分别鼓入空气，丙酸（消耗量是0. 92mL/min)。质 谱参数如下：电压1.9kV，质谱范围500-2000m/z，分辨率60 000(在m/z 400处），采用数 据依赖模式将强度前5的母离子进入碰撞诱导裂解（CID)得到二级质谱的数据，碰撞能量 设置为35 %。7 y g进样，通过ProSi曲tPC捜库，捜库设置半脫氨酸经过IAA处理，碎片容 忍度为20ppm，质量大于5000化。数据库采用化iprot中人的库。得到的结果选择E值小 于 1E-4。
[0030] 从图4可看出丙酸的鼓入，使整体蛋白的信号都得到大幅的提高，同时，通过 ProSi曲巧C捜库，=次重复鉴定的结果如表2所示，未鼓入丙酸的鉴定到58个蛋白，而鼓入 丙酸后提高到79个蛋白，蛋白的鉴定数目提高了 36%。因此，本方法在保持=氣乙酸流动 相体系对整体蛋白的高分离效率的同时降低或消除了其对电喷雾质谱检测信号的抑制，有 利于实现大规模整体蛋白的分析。 阳0川实施例4
[0032] 分析物是除盐后的BT474细胞蛋白的膜蛋白酶酶解样品，采用0. 05%体积分数的 TFA作为添加剂，液相色谱采用C18反相色谱柱（柱长130臟，内径75 y m，填料粒径5 y m)， 流速约为20化L/min。分析时间120min，分离梯度为：2min后B乙腊相到达10%，在92min 上升至35%，在98min达到100%持续7min，在106min时A水相平衡14min。离子源处分别 鼓入空气，乙酸（消耗量是2. 64mL/min)。质谱参数如下：电压1. 9kV，质谱范围400-2000m/ Z，分辨率60 000(在m/z 400处），采用数据依赖模式将强度前6的母离子进入碰撞诱导裂 解（CID)得到二级质谱的数据，碰撞能量设置为35%。2yg进样，通过Mascot软件捜库， 设置烷基化为固定修饰，氧化为可变修饰，质量偏差20ppm，二级质谱质量容忍度0. 8Da。数 据库采用化iprot中人的库。得到的结果选择得分值大于20,置信区间小于0. 01。
[0033] 通过Mascot捜库，S次重复鉴定的结果如表2所示，未鼓入乙酸时鉴定到343个 蛋白，1360个肤段，而鼓入乙酸时鉴定到616个蛋白，2511个肤段，蛋白和肤段的数目增加 接近一倍。综上，=氣乙酸实现了酶解肤段的高效分离，而乙酸的鼓入，降低或消除了=氣 乙酸对质谱检测信号的抑制，有利于实现大规模酶解肤段的分析。
[0034] 表2复杂样品中的鉴定结果对比
[0035]
【主权项】
1. 一种液相色谱-质谱联用系统对分析物的分离鉴定方法，其特征在于：使用三氟乙 酸作为液相色谱流动相添加剂，在密闭的电喷雾离子源处引入挥发性酸气体，通过向离子 化区域中引入挥发性酸气体来降低或消除三氟乙酸对电喷雾质谱检测信号的抑制，提高质 谱信号，进而提高检测的分辨率和灵敏度。2. 根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于： 所述的挥发性酸为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等可用于质谱的挥发性酸中的一种或两种以 上混合，挥发性酸的纯度为98% -100%，挥发性酸的引入总量是离子化区域中三氟乙酸质 量的7000倍至90000倍。3. 根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于： 挥发性酸向液相色谱引入的方法是通过质谱抽真空的栗使得封闭的电喷雾离子源处 于0.0 STorr甚至更低的负压，迫使空气协同挥发性酸气体进入密闭电喷雾离子源处。4. 根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于： 所述的挥发性酸使用的液相色谱分离流动相为水和乙腈，其中添加剂三氟乙酸浓度范 围为 0· 001% -20. 000%。5. 根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于： 所述的分析物为酶解肽段或整体蛋白质样品等生物样品。
【文档编号】G01N30/02GK105987964SQ201510064869
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月6日
【发明人】邹汉法, 陈津, 王方军
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所