一种利用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法
【专利摘要】本发明涉及肽化合物的检测方法，具体涉及用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法。主要解决现有流动相为三氟乙酸体系对兰瑞肽分离中，分离度较低的技术问题。本发明方法包括以下步骤：1、高效液相色谱法所用的色谱柱中，固定相为混合模式色谱柱；2、流动相A为：磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐溶液:乙腈溶液的体积比=0.1:0.1:1；流动相B为：磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐水溶液:水的体积比=0.1:0.1:1；3、流动相A梯度范围为10?80%；4、所述兰瑞肽溶液的浓度为0.5?3mg/mL；5、取兰瑞肽溶液利用高效液相色谱进行兰瑞肽的分离和检测。本发明可以检测出三氟乙酸体系无法检测到的杂质，从而可以更好的控制兰瑞肽原料药的质量。
【专利说明】
一种利用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法
技术领域
[0001]本发明涉及肽化合物的检测方法，具体涉及用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法。
【背景技术】
[0002]兰瑞肽是一种新型的生长抑素(ST)八肽类似物，它是许多内分泌、神经内分泌、夕卜分泌和旁分泌机能的肽抑制剂。其序列为H-D-2-NAL-CYS-TYR-D-TRP-LYS-VAL-CYS-THR-NH2。生长抑素(SomatoStain，ST)可以抑制生长激素的释放，可用于肢端肥大症和生长激素型垂体腺瘤的治疗，但由于天然生长抑素体内半衰期非常短(I?7min)，且无器官特异性，停药后易引起生长激素等分泌过度，长期应用ST可导致肠道吸收不良和葡萄糖耐受性降低，因此ST的临床作用一直受到限制，妨碍了其在临床上的应用。肢端肥大症是由于生长激素过度生成而导致的一种罕见的疾病，临床呈慢性进展，主要表现为软弱乏力，通常是由于生长激素(GH)分泌性垂体细胞腺瘤所致。如果GH的过度生成发生在青春期之前，会导致巨大症，若发生在青春期之后，则疾病表现得较为隐匿。易见的疾病特征性表现为渐进性的骨骼生长，手足增大，皮肤增厚，颜面粗糙。而如心脏肥大、高血压、恶性睡眠呼吸暂停等这些威胁病人生命的情况则相对不易观察到。
[0003]因此，人们致力于研究合成生长抑素类似物(Somatostatinanalogue,STA)。与天然ST相比，SAT具有作用相对单一、血浆半衰期长、作用持久、使用方便等优点。这些生长抑素类似物有数百种之多，几乎均为多肽，依据残基个数为六肽、七肽、八肽、十四肽等。目前临床应用的主要是八肽，包括奥曲肽和兰瑞肽。
[0004]兰瑞肽在制备过程中，由于化学合成的多肽常常含有大量的杂质，由于小部分杂质与目的产物在结构和理化性质上十分相近，这些杂质会严重影响兰瑞肽的产品质量。为了去除这些杂质，通常采用高效液相色谱进行纯化，常用体系为三氟乙酸的水和乙腈进行梯度洗脱，但是分离度不够无法满足要求。所以需要寻求更合适的方法来分离检测兰瑞肽的纯度。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种采用采高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法，主要解决现有流动相为三氟乙酸体系对兰瑞肽分离中，分离度较低的技术问题。
[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案如下:
一种利用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法，其中包括:
1)高效液相色谱法所用的色谱柱中，固定相为混合模式色谱柱；
2)流动相A为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1(V/V);流动相B为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐水溶液:水=0.1:0.1: 1CV/V);
3)流动相A梯度范围为10-80%;
4)所述兰瑞肽溶液的浓度为0.5-3mg/mL; 5)取兰瑞肽溶液利用高效液相色谱进行兰瑞肽的分离和检测。
[0007]更为优选的方案是:所述固定相混合模式色谱柱为C18SAX、C18SCX、C18WCX中的一种。
[0008]更为优选的方案是:所述高效液相色谱进行兰瑞肽的分离和检测的方法，固定相混合模式为RPLC/IEX。
[0009]更为优选的方案是:所述磷酸三乙胺缓冲盐溶液摩尔浓度100M/L，pH2.9;高氯酸钠缓冲盐溶液摩尔浓度1M/L。
[0010]更为优选的方案是:所述色谱柱，其流速为ImL /min，检测波长为214nm，柱温为40。。。
[0011]本发明的有益效果是:本发明采用采高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法，
【申请人】在研究中意外发现，采用本发明的流动相体系，分离度大于1.5，而采用三氟乙酸流动相体系，分离度只有1.2左右，本发明可以检测出三氟乙酸体系无法检测到的杂质，从而可以更好的控制兰瑞肽的质量，样品纯度可以达到大于99%。
【附图说明】
[0012]图1实施例1的高效液相色谱图。
[0013]图2实施例2的高效液相色谱图。
[0014]图3实施例3的高效液相色谱图。
[0015]图4实施例4的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
仪器与条件:
采用赛默飞UltiMate 3000 RSLC高效液相色谱系统;色谱柱为C18SCX(4.6*250mm)，柱温为40°C ;检测波长为214nm;流动相A为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1 (V/V);流动相B为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐水溶液:水=0.1:0.1:1(V/V);所述磷酸三乙胺缓冲盐溶液摩尔浓度100M/L，pH 2.9;高氯酸钠缓冲盐溶液摩尔浓度1M/L。流动相々%系统梯度为Omin时为20%，25min时为45%，35min时为80%，进样体积为10μ1。
[0017]实验步骤:
取杂质A适量，用水溶解制成lmg/ml样品溶液，做为待测溶液。取待测溶液，按照上述色谱条件进行高效液相色谱分析，其分析结果见图1。由图1可知杂质A的色谱保留时间为25.12min0
[0018]实施例2
采用赛默飞UltiMate 3000 RSLC高效液相色谱系统;色谱柱为C18SCX(4.6*250mm)，柱温为40°C ;检测波长为214nm;流动相A为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1 (V/V);流动相B为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐水溶液:水=0.1:0.1:1(V/V);所述磷酸三乙胺缓冲盐溶液摩尔浓度100M/L，pH 2.9;高氯酸钠缓冲盐溶液摩尔浓度1M/L。流动相々%系统梯度为Omin时为20%，25min时为45%，35min时为80%，进样体积为ΙΟμΙ。
[0019]实验步骤:
取杂质B适量，用水溶解制成lmg/ml样品溶液，做为待测溶液。取待测溶液，按照上述的条件进行高效液相色谱分析，其分析结果见图2。
[0020]图2可知杂质B的色谱保留时间为13.44min。
[0021]实施例3 仪器与条件:
采用赛默飞UltiMate 3000 RSLC高效液相色谱系统;色谱柱为C18SCX(4.6*250mm)，柱温为40°C ;检测波长为214nm;流动相A为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1 (V/V);流动相B为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐水溶液:水=0.1:0.1:1(V/V);所述磷酸三乙胺缓冲盐溶液摩尔浓度100M/L，pH 2.9;高氯酸钠缓冲盐溶液摩尔浓度1M/L。流动相々%系统梯度为Omin时为20%，25min时为45%，35min时为80%，进样体积为ΙΟμΙ。
[0022]实验步骤:
取杂质C适量，用水溶解制成lmg/ml样品溶液，做为待测溶液。取待测溶液，按照上述色谱条件进行高效液相色谱分析，其分析结果见图3。由图3可知杂质C的色谱保留时间为25.12min0
[0023]实施例4 仪器与条件:
采用赛默飞UltiMate 3000 RSLC高效液相色谱系统;色谱柱为C18SCX(4.6*250mm)，柱温为40°C ;检测波长为214nm;流动相A为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐溶液:乙腈溶液=0.1:0.1:1 (V/V);流动相B为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐水溶液:水=0.1:0.1:1(V/V);所述磷酸三乙胺缓冲盐溶液摩尔浓度100M/L，pH 2.9;高氯酸钠缓冲盐溶液摩尔浓度1M/L。流动相々%系统梯度为Omin时为20%，25min时为45%，35min时为80%，进样体积为ΙΟμΙ。
[0024]实验步骤:
取兰瑞肽适量，用水溶解制成lmg/ml样品溶液，做为待测溶液。取待测溶液杂质Α、杂质B、杂质C及兰瑞肽样品，按照上述色谱条件进行高效液相色谱分析，其分析结果见图4。由图4可知杂质六、杂质8、杂质(:及兰瑞肽样品的色谱保留时间分别为25.2311^11、13.601^11、8.31min、23.29min。本方法条件可以很好的分离检测杂质和兰瑞肽样品，从而有效的控制兰瑞肽的质量。
【主权项】
1.一种利用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)高效液相色谱法所用的色谱柱中，固定相为混合模式色谱柱； 2)流动相A为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐溶液:乙腈溶液的体积比=0.1:0.1:1；流动相B为:磷酸三乙胺缓冲盐溶液:高氯酸钠缓冲盐水溶液:水的体积比=0.1:0.1:1； 3)流动相A梯度范围为10-80%; 4)所述兰瑞肽溶液的浓度为0.5-3mg/mL; 5)取兰瑞肽溶液利用高效液相色谱进行兰瑞肽的分离和检测。2.根据权利要求1所述的一种利用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法，其特征在于:所述固定相混合模式色谱柱为C18SAX、C18SCX、C18WCX中的一种。3.根据权利要求2所述的一种利用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法，其特征在于:所述固定相混合模式为RPLC/IEX。4.根据权利要求1所述的一种利用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法，其特征在于:所述磷酸三乙胺缓冲盐溶液摩尔浓度为100 M/L，pH 2.9;高氯酸钠缓冲盐溶液摩尔浓度1M/L。5.根据权利要求1所述的一种利用高效液相色谱法分离检测兰瑞肽的方法，其特征在于:所述色谱柱，流速为I mL /min,检测波长为214nm，柱温为40°C。
【文档编号】G01N30/02GK105842362SQ201610189425
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】徐红岩, 秦敬国
【申请人】吉尔生化（上海）有限公司, 上海吉尔多肽有限公司