立达霉有关物质的测定方法与流程

本发明涉及农药技术领域，具体地说，是立达霉有关物质的测定方法。

背景技术：

高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,hplc)是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱中，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法已在化学、医学、工业、农学、商检、法检等领域得到广泛的应用。

中国专利文献cn105223278a公开了一种固相萃取液质联用法测定葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的方法，包括先调节待测葡萄酒的ph值，用乙腈对酒样进行液液萃取，加入氯化钠待溶液盐析后用固相萃取柱萃取乙腈层，通过固相萃取柱洗脱，收集净化后的洗脱液，继而转入旋转蒸发仪浓缩，用氮气吹干浓缩液，通过乙腈水溶液回溶后，注入液质联用仪进行分析，获得葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的含量的步骤。中国专利文献cn104535671a公开了一种茄子中甲霜灵残留的检测方法，包括以下几个步骤：(1)样品处理：将采摘后的茄子置于破碎机中破碎，得到茄子浆；(2)提取：称取茄子浆20g于锥形瓶中，加入100ml的乙酸乙酯和丙酮混合液，在温度为35-40℃的条件下振荡提取60-70min，抽滤得清液，浓缩至近干，氮吹至干，用2ml乙腈复溶备用；(3)小柱分离：用5ml乙酸乙酯洗涤hlb小柱，再用5ml丙酮洗涤小柱，上样，用10ml体积比为1:2的乙腈和水混合液淋洗小柱，最后用10ml的乙腈洗脱，收集洗脱液，旋蒸至1ml，氮气吹干，采用乙腈定容至2ml，待检测；(4)检测：采用hplc进行检测。但是关于本发明的立达霉有关物质的测定方法目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种立达霉有关物质的测定方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种立达霉有关物质的测定方法，所述的测定方法包括：

(1)专属性试验，

(2)稳定性试验，

(3)最大的有关物质测定。

一种立达霉专属性试验方法，所述的试验方法包括：

(1)酸破坏试验：取样品加盐酸溶液，置热水浴中加热，取出后放冷，用氢氧化钠中和，加流动相稀释，然后进行hplc分析；

(2)碱破坏试验：取样品加氢氧化钠，置热水浴中加热，取出后放冷，用盐酸中和，加流动相稀释，然后进行hplc分析；

(3)氧化破坏试验：取样品加过氧化氢，放置一段时间后取出，加流动相稀释，然后进行hplc分析；

(4)加热破坏试验：取样品加流动相稀释，置100℃水浴中加热，取出后放至室温，然后进行hplc分析；

(5)光破坏试验：取样品置于紫外灯下照射，加流动相稀释，然后进行hplc分析。

所述的试验方法包括：

(1)酸破坏试验：取样品20mg加1mol/l盐酸溶液5ml，置热水浴中加热30min，取出后放冷，用1mol/l氢氧化钠溶液中和，加流动相稀释制成每1ml中含2mg样品的溶液，然后进行hplc分析；

(2)碱破坏试验：取样品20mg加1mol/l氢氧化钠溶液5ml，置热水浴中加热30min，取出后放冷，用盐酸中和，加流动相稀释制成每1ml中含2mg样品的溶液，然后进行hplc分析；

(3)氧化破坏试验：取样品20mg加30％过氧化氢5ml，放置1小时后取出，加流动相稀释制成每1ml中含2mg样品的溶液，然后进行hplc分析；

(4)加热破坏试验：取样品加流动相稀释制成每1ml中含2mg样品的溶液，置100℃水浴中加热2小时，取出后放至室温，然后进行hplc分析；

(5)光破坏试验：取样品置于紫外灯下照射24小时，称取20mg加流动相稀释制成每1ml中含2mg的溶液，然后进行hplc分析。

hplc分析的条件为：c18柱，柱温是30℃，检测波长225nm，流速1.5ml/min，流动相为甲醇：水＝5:95。

一种立达霉稳定性试验方法，所述的稳定性试验方法包括以下步骤：称取样品并用流动相溶解，在0-24h内在hplc进样分析，记录色谱图，以主峰峰面积考察溶液的稳定性。

一种立达霉最大的有关物质的测定方法，所述的测定方法为运用hplc测定2,6-二甲苯胺，色谱柱为c18柱，流动相为乙腈：磷酸水＝40：60，检测波长为225nm，检测温度为30℃，流速为1.25ml/min，进样量为10μl。

2,6-二甲苯胺的检出限为0.02μg/ml。

2,6-二甲苯胺的定量限为0.1μg/ml。

本发明优点在于：

1、本发明采用hplc对立达霉有关物质进行测定，具有高效、分离效能高，灵敏度高，分析速度快，准确度高等优点。

2、本发明提供了立达霉的专属性试验方法、稳定性试验方法和最大的有关物质的测定方法。

附图说明

附图1：未破坏的系统适应性溶液色谱图。

附图2：光破坏立达霉的色谱图。

附图3：酸破坏立达霉的色谱图。

附图4：碱破坏立达霉的色谱图。

附图5：氧化破坏立达霉的色谱图。

附图6：2,6-二甲苯胺的色谱图。

附图7。2,6-二甲苯胺和立达霉的色谱图。

附图8：0.1μg/ml的2,6-二甲苯胺的色谱图。

具体实施方式

下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

对照品：

立达霉(甲霜灵)对照品：购自北京世纪奥科生物技术有限公司，德国dr.ehrenstorfer，cas编号57837-19-1(watercontent0.1％,det.purity99.0％,tolerance/uncertainty+/-0.5％,determinedbykarl-fischertitration)。

供试品：

“复方立达霉粉”(美婷)，长沙拜特生物科技研究所有限公司提供，样品编号分别为20111101、20111201、20120101、20120508、20120708、20120722、20120811、20120813、20120830、20121101、20121201和20130101。

溶液制备

供试品溶液取本品适量，加流动相稀释至每1ml中约含立达霉0.1mg的溶液，作供试品溶液。

对照品溶液精密称取立达霉对照品适量，加流动相溶解并稀释为每1ml中约含0.1mg立达霉的溶液，作为对照品溶液。

1、专属性试验

酸破坏试验：取立达霉20mg，加1mol/l盐酸溶液5ml，置热水浴中，加热30min取出，放冷，用1mol/l氢氧化钠溶液中和，加流动相稀释制成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

碱破坏试验：取立达霉20mg，加1mol/l氢氧化钠5ml，置热水浴中，加热30min取出，放冷，用1mol/l盐酸溶液中和，加流动相稀释制成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

氧化破坏试验：取立达霉20mg，加30％过氧化氢5ml，放置1h，取出，加流动相稀释制成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

加热破坏试验：取立达霉适量，加流动相溶解并稀释成每1ml中含有2mg的溶液，置100℃水浴中，加热2h，取出，放至室温。上hplc。

光破坏试验：取立达霉适量，置紫外灯下，照射24h，称取20mg，精密测定，加流动相溶解并稀释成每1ml中含有2mg的溶液，上hplc。

根据制剂处方及工艺，制备空白辅料样品，上hplc。

取系统适用性溶液，上hplc。

hplc条件：色谱柱是rp-ods柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱温是30℃，检测波长包括225nm，流速1.5ml/min，流动相为甲醇：水＝5:95(v:v)。

未破坏的系统适应性溶液色谱图见附图1，光破坏立达霉的色谱图见附图2，酸破坏立达霉色谱图见附图3，碱破坏立达霉色谱图见附图4，氧化破坏立达霉色谱图见附图5。

结果显示，立达霉经过酸/碱水浴、光和氧化破坏能产生明显的降解产物，立达霉在加热破坏时未出现降解产物。建立的hplc法能有效分离立达霉及其经酸碱、光和氧化破坏后产生的降解产物，立达霉峰与其它分解产物峰分离良好，说明本法专属性强。

2、稳定性试验

精密称取“复方立达霉粉”(批号20111101)适量，加流动相溶解，在0～24h内进样测定并记录色谱图，以主峰峰面积和杂质含量为指标考察溶液稳定性，结果见表1。立达霉主峰面积的rsd＝0.25％。结果表明立达霉供试品溶液24h内稳定性良好。

表1稳定性试验结果

3、样品测定

将不同批次的“复方立达霉粉”按照以上方法(稳定性试验的操作方法)进行测定，结果见表2。在有关物质方面，“复方立达霉粉”样品中单个最大杂质最高为3.48％，最低为1.97％，平均为2.75％。“复方立达霉粉”样品中总杂质最高为5.32％，最低为3.24％，平均为4.48％。

表2样品有关物质测定结果

根据有关物质测定结果，将单个杂质限度定为4.0％，杂质总量限度定为6.0％。

4、最大的有关物质

最大的有关物质为2,6-二甲苯胺。2,6-二甲苯胺是立达霉合成途径过程的中间产物(详见《立达霉(甲霜灵)生产工艺》)，有可能在生产立达霉原料过程中掺入到立达霉原料中。

2,6-二甲苯胺的分析方法采取高效液相色谱法，色谱条件为：c18rp-ods柱(150mm×4.6mm,5μm)；流动相【乙腈：磷酸水＝40：60(v/v)】；检测波长为225nm；检测温度30℃，流速为1.25ml/min。进样量10μl。该检测方法可以有效地将检测2,6-二甲苯胺，2,6-二甲苯胺保留时间约为1.68min(附图6)。将2,6-二甲苯胺和立达霉的混合液上hplc，2,6-二甲苯胺保留时间约为1.68min，立达霉的保留时间为4.97min(附图7)，证明该方法特异性良好。

以信噪比s/n≥3计算，确定2,6-二甲苯胺的检出限为0.02μg/ml，相当于总含量的0.01％。以信噪比s/n≥10计算，确定2,6-二甲苯胺的定量限为0.1μg/ml(附图8)，相当于总含量的0.05％。以上比例均远低于杂质的限度值。

将系列浓度梯度的2,6-二甲苯胺标准溶液上hplc。以2,6-二甲苯胺浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。2,6-二甲苯胺标准溶液在0.1μg/ml-1000μg/ml的线性范围内与峰面积的线性关系良好，线性回归方程为y＝5.5254x+6.1058，相关系数(r²)为0.9999。

将一定量2,6-二甲苯胺添加到空白溶液中，用以上方法，测定2,6-二甲苯胺的准确度和精密度。2,6-二甲苯胺的平均回收率为94.60％～99.02％，精密度为0.55％～4.45％，详细见表3。

表32,6-二甲苯检测的准确度和精密度(n＝5)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。