一种唾液样本中痕量大麻的检测方法及使用的SPR芯片与流程

本发明涉及一种毒品大麻的检测方法，尤其涉及一种唾液样本中痕量大麻的检测方法及其使用的spr芯片，属于检测技术领域。

本发明中下列表达式的意义为：

thc：四氢大麻酚

klh：血蓝蛋白

ova：鸡卵白蛋白

背景技术：

大麻，其主要有效化学成份为thc，在吸食或口服后有精神和生理的活性作用，被认为是世界三大毒品之一，社会危害性非常严重。

目前，针对大麻的检验方法主要包括常规化学法、毛细管电泳法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱/质谱法、免疫检测法和生物检测法等。其中体内检材分析是当下法庭科学研究的热点，尿液是检测分析滥用毒品应用最为广泛的体内检材。但是，现有的尿检技术不能满足犯罪现场快速检测的需求，在此背景下，寻求一种可达到快速、准确、灵敏、经济的犯罪现场检测方法成为了科学工作者研究重点。

表面等离子共振技术(spr)是从20世纪90年代发展起来的一种新技术，其应用spr原理检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况，广泛应用于各个领域，已经成为生命科学和制药领域的一种重要的研究工具。与传统检测方法相比，具有高灵敏度、响应快、体积小、机械强度大、检测过程快、实时检测、能动态地监测生物分子相互作用的全过程和实时数据、无需标记样品、保持分子活性、对复合物的定量测定不干扰反应的平衡等优点，成为了检测大麻的较优选择。目前，关于使用表面等离子共振技术快速检测大麻的方法尚未见报道。中国发明专利(公开号：cn102057277a)公开了一种大麻使用的检测，该专利采用的是基于结合伴侣的非竞争性同源性免疫测定的时间分辩荧光共振能量转移(tr-fret)分析；应用基因工程方法制备能够结合四氢大麻酚(thc)和抗-thc-抗体之间的免疫复合物的抗体片段。结合伴侣均须进行荧光标记，以便实现荧光计的tr-fret荧光检测，检测灵敏。另外，中国发明专利(公开号：cn101580544a)公开了一种胶体金标记大麻、四氢大麻酚单抗免疫检测板，该专利描述了thc-klh的制备；以thc-klh为抗原，采用弗氏佐剂法(freund’sadjuvant)免疫balb/c小鼠；用单克隆抗体技术制备杂交瘤；用thc-klh包被的酶联板(elisa法)筛选出抗thc的杂交瘤细胞。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种利用唾液样本就可达到快速、准确的痕量大麻的检测方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种唾液样本中痕量大麻的检测方法，所述检测方法为利用spr芯片在spr仪上检测待测样本中的thc含量，所述spr芯片为抗thc抗体spr芯片，所述抗thc抗体spr芯片通过以下方法制得：

s1、将thc分别偶联于klh和ova，得到thc-klh和thc-ova；

s2、用上述thc-klh和快速免疫佐剂免疫balb/c小鼠，用thc-ova检测免疫小鼠抗thc的抗血清效价；

s3、取抗血清elisa效价在6k以上的小鼠，取脾脏的b淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，经单克隆筛选获得抗血清elisa效价在10k以上的抗thc抗体杂交瘤细胞株；

s4、将上述杂交瘤细胞株接种至balb/c小鼠腹腔，从腹水中制备纯化抗体；

s5、用本瓜蛋白酶将上述纯化抗体水解成fc段和fab段，将fab段包被于3d环氧spr芯片，获得抗thc抗体spr芯片。

在上述的一种唾液样本中痕量大麻的检测方法中，步骤s2中所述的快速免疫佐剂为quickantibody-mouse5w。

在上述的一种唾液样本中痕量大麻的检测方法中，步骤s2中所述的thc-ova检测在thc-klh和快速免疫佐剂免疫balb/c小鼠5周后进行，进一步优选5-8周后进行，以便获得更高效的亚克隆细胞株。

在上述的一种唾液样本中痕量大麻的检测方法中，步骤s3中所述的抗thc抗体杂交瘤细胞株的灵敏度为0.3-3ng。灵敏度为0.3-3ng的抗thc抗体杂交瘤细胞株通过以下方法筛选得到：将thc-ova点样偶联于spri羧基芯片，thc-ova的量分别为30ng、3ng、0.3ng、0.03ng；另外，同样ova点样，作为阴性对照。用表面等离子共振spri高通量生物分子间相互作用仪分析抗血清elisa效价在10k以上的株杂交瘤细胞株的抗体与芯片上的样品结合反应情况，筛选出检测灵敏度能达到0.3ng-3ng的抗体杂交瘤细胞株。这个灵敏度使该抗体可应用于检测至少1周内吸食大麻毒品人员的唾液样品。

在上述的一种唾液样本中痕量大麻的检测方法中，步骤s4中所述的从腹水中制备纯化抗体的具体过程为：从腹水中获取抗体，然后用proteina柱吸附纯化得到纯化抗体。

本发明步骤s5在步骤s4用proteina柱吸附纯化洗脱前，直接用本瓜蛋白酶将proteina-抗体柱上的抗体水解成fc段和fab段。由于proteina是和抗体的fc段特异性的，因而酶切后，fab段即可游离纯化出来，收集、超滤脱盐浓缩此抗thc的fab，冻干保存。

本发明将抗thc的fab段包被于3d环氧spr芯片，同时以正常小鼠igg的fab片段为对照，获得抗thc抗体spr芯片，芯片上包括抗thc的fab段和正常小鼠igg的fab片段(阴性对照)。由于fab段的分子是完整抗体分子大小的1/3，加上没有y空间位阻，可以大大提高fab段在芯片上包被的密度，至少比完整抗体提高3-5倍的有效密度，对于像毒品这类小分子可大大提高其检测灵敏度。

本发明利用该抗thc的fab抗体spr芯片，在spr仪上检测吸食大麻人员唾液样本中的thc，取样、检测等操作更快速、方便，可在1-2分钟左右得知检测结果，检测灵敏度至少可达到0.3-3ng/ml，具有快速、准确、灵敏的效果。与目前常规的尿检方法相比，本发明的优势在于：

(1)取样方便，不受场地限制、降低被检人员的不配合度并避免其作弊的可能性，使毒驾临检成为可能。

(2)可在1-2分钟内判读阴性和阳性结果(尿检至少3-8分钟)。

(3)检测准确、灵敏度高，检测阈值至少可达0.3-3ng/ml，可应用于唾液快速实时检测。

与现有技术相比，本发明同样以thc-klh为抗原，但采用优于传统弗氏佐剂的新型快速免疫佐剂(quickantibody-mouse5w)法免疫balb/c小鼠；在筛选单克隆抗体杂交瘤细胞株时采用表面等离子共振spri高通量分析选株：将thc-ova点样偶联于spri羧基芯片，同样ova点样，作为阴性对照。用表面等离子共振spri高通量生物分子间相互作用仪分析抗血清elisa效价在10k以上的株杂交瘤细胞株的抗体与芯片上的样品结合反应情况，筛选出检测灵敏度能达到0.3ng-3ng/ml的抗体杂交瘤细胞株。具有如下优势：1)以thc-klh为抗原免疫，用thc-ova筛选保证了抗thc特异性杂交瘤细胞株的筛选；2)spri筛选不仅可实现高通量、快速、准确，而且更重要的是可以实时得到结合速率常数ka、解离速率常数kd、平衡解离常数kd等热动力学参数，以及灵敏度，可快速得到高质量的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

而在检测原理上，本发明采用的是不同的spr原理检测，该法快速、灵敏、可实现无标记检测，不受复杂样本中荧光杂质的干扰，既可实现非竞争性免疫测定，也可实现非竞争性免疫测定。采用的抗体可以用高亲和力的单抗直接用酶切获得的fab片段。

本发明另一个目的在于提供上述唾液样本中痕量大麻的检测方法中使用的spr芯片，所述的spr芯片为抗thc抗体spr芯片，所述抗thc抗体spr芯片通过以下方法制得：

s1、将thc分别偶联于klh和ova，得到thc-klh和thc-ova；

s2、用上述thc-klh和快速免疫佐剂免疫balb/c小鼠，用thc-ova检测免疫小鼠抗thc的抗血清效价；

s3、取抗血清elisa效价在6k以上的小鼠，取脾脏的b淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，经单克隆筛选获得抗血清elisa效价在10k以上的抗thc抗体杂交瘤细胞株；

s4、将上述杂交瘤细胞株接种至balb/c小鼠腹腔，从腹水中制备纯化抗体；

s5、用本瓜蛋白酶将上述纯化抗体水解成fc段和fab段，将fab段包被于3d环氧spr芯片，获得抗thc抗体spr芯片。

在上述的一种唾液样本中痕量大麻的检测方法中使用的spr芯片中，步骤s2中所述的快速免疫佐剂为quickantibody-mouse5w。

在上述的一种唾液样本中痕量大麻的检测方法中使用的spr芯片中，步骤s2中所述的thc-ova检测在thc-klh和快速免疫佐剂免疫balb/c小鼠5周后进行，进一步优选5-8周后进行。

在上述的一种唾液样本中痕量大麻的检测方法中使用的spr芯片中，步骤s3中所述的抗thc抗体杂交瘤细胞株的灵敏度为0.3-3ng。

在上述的一种唾液样本中痕量大麻的检测方法中使用的spr芯片中，步骤s4中所述的从腹水中制备纯化抗体的具体过程为：从腹水中获取抗体，然后用proteing柱吸附纯化得到纯化抗体。

与现有技术相比，本发明制备的spr传感芯片是表面偶联了抗thc的特异性抗体，可特异性结合复杂样本中的thc分子，因而可应用于唾液样本中痕量大麻的检测。同时，利用本发明制备的抗thc抗体spr芯片在spr仪上检测吸食大麻人员唾液样本中的甲基苯丙胺时，可达到快速、准确、灵敏的效果，其检测灵敏度至少可以达到0.3-3ng/ml，满足犯罪现场快速检测的需求。

附图说明

图1为筛选出检测灵敏度能达到0.3ng的抗体杂交瘤细胞株的spr结果图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：

将thc通过酚羟基分别偶联于蛋白载体klh和ova，得到thc-klh和thc-ova。

用thc-klh和快速免疫佐剂quickantibody-mouse5w免疫balb/c小鼠15只，5周后用thc-ova检测免疫小鼠抗甲基苯丙胺的抗血清效价；取能产生高特异性和高亲和力抗体(抗血清elisa效价在6k以上)的小鼠5只。

分别取脾脏的b淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，经单克隆筛选获得高特异性和高亲和力的抗甲基苯丙胺抗体杂交瘤细胞株，elisa效价在10k以上100株。然后将thc-ova点样偶联于spri羧基芯片，thc-ova的量分别为30ng、3ng、0.3ng、0.03ng；另外，同样ova点样，作为阴性对照。用表面等离子共振spri高通量生物分子间相互作用仪分析初筛所得的100株杂交瘤细胞株的抗体与芯片上的样品结合反应情况，筛选出如图1所示的检测灵敏度能达到0.3ng的抗体杂交瘤细胞株。

将上述灵敏度能达到0.3ng的抗体杂交瘤细胞株接种至balb/c小鼠腹腔，从腹水中大量获取抗体，并用proteing柱吸附纯化。在洗脱前，直接用本瓜蛋白酶将proteing-抗体柱上的抗体水解成fc段和fab段。由于proteing是和抗体的fc段特异性的，因而酶切后，fab段即可游离纯化出来，收集、超滤脱盐浓缩此抗thc的fab段，并包被于3d环氧spr芯片，同明以正常小鼠igg的fab片段为对照，获得抗thc抗体spr芯片。

应用实施例1-5：

将实施例1制备得到的抗thc抗体spr芯片用于在spr仪上检测4个分别吸食大麻1天、3天、5天、和7天后的人员、1个正常人员唾液样本中的thc。

应用对比例1-5：

将上述应用实施例1-5同时进行常规尿检。

将应用实施例1-5和应用对比例1-5的检测结果进行对比，如表1所示。

表1：本发明与常规尿检比较

从表1可知，与常规尿检比，本发明更快速、准确、灵敏。

在实施例及其替换方案中，筛选出的抗ma抗体杂交瘤细胞株的灵敏度还可以为0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、1.1ng、1.2ng、1.3ng、1.4ng、1.5ng、1.6ng、1.7ng、1.8ng、1.9ng、2ng、2.1ng、2.2ng、2.3ng、2.4ng、2.5ng、2.6ng、2.7ng、2.8ng、2.9ng、3ng。

鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1和应用实施例1-5作为代表说明本发明申请优异之处。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。