一种伊曲茶碱有关物质的高效液相色谱分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种伊曲茶碱有关物质的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相色谱柱及紫外检测器，以乙腈?磷酸盐缓冲液为流动相，进行等度洗脱。本方法可同时分析伊曲茶碱原料及其制剂中的所有已知杂质，并且可通过加校正因子的主成分自身对照法有效控制各已知杂质含量，各杂质峰与主峰之间的分离度大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。本发明为伊曲茶碱原料及其制剂的质量控制分析提供了简易、专属性强的分析方法。
【专利说明】
一种伊曲茶碱有关物质的高效液相色谱分析方法 一、
技术领域
[0001] 本发明涉及一种化学药物纯度的分析方法，具体地说是一种伊曲茶碱有关物质的 高效液相色谱分析方法。 二、
【背景技术】
[0002] 伊曲茶碱（Istradefylline)，化学名为(E)-8_(3,4-二甲氧基苯乙烯基)_1，3_二 乙基-7-甲基-3，7-二氢-1H-嘌呤-2，6-二酮，化学结构式如下：
[0004] 伊曲茶碱是一种选择性的腺苷A2A受体诘抗剂，由日本Kyowa Hakko Kirin公司开 发。伊曲茶碱片（商品名Nouriast，规格20mg)于2013年3月获日本PMDA批准上市，临床用于 治疗帕金森病和改善帕金森综合症初期的运动障碍，尤其适用于改善因左旋多巴治疗引起 的剂末现象。
[0005] 伊曲茶碱杂质较多，从结构上看，杂质主要来源于取代嘌呤母核结构改变及其侧 基苯乙烯结构异构化有关，杂质均具有苯乙烯结构，极性相近杂质诸多；从来源看，伊曲茶 碱原料的杂质主要来源于合成过程中引入的反应原料(杂质H)、合成中间体(杂质D)、反应 副产物(杂质E、杂质F、杂质G)及降解杂质(杂质A、杂质B、杂质C)，伊曲茶碱制剂的杂质来源 于原料引入杂质（杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H)、工艺杂质（杂质B)及降解杂质（杂质 A、杂质B、杂质C)。
[0006] 目前建立在全面杂质谱分析基础上的伊曲茶碱原料及其制剂的分析方法还没有 相关的文献报道。 三、
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有文献对伊曲茶碱原料及其制剂杂质鉴定研究的缺失，旨在提供一 种伊曲茶碱有关物质的高效液相色谱分析方法。本发明通过工艺试制、强制降解试验对伊 曲茶碱杂质进行富集、分离提纯，鉴定了 8个主要已知杂质，并且对杂质进行了溯源归属，包 括伊曲茶碱反应原料(杂质H)、合成中间体(杂质D)、伊曲茶碱合成副产物(杂质E、杂质F、杂 质G)及降解杂质(杂质A、杂质B、杂质C)。
[0009] 发明人曾试图通过C18( 150 X 4.6mm，5wii)色谱柱分离各已知杂质，但各杂质与主 成分不能达到基线分离，不合适。因此，改用C18(250X4.6mm，5Mi)的色谱柱进行分离，经对 流动相组成及比例的优化筛选，确定本发明的分析方法。同时按中国药典2015年版四部通 贝1J〈0512>(高效液相色谱法)及通则〈9101〉(药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义 和验证方法，进行专属性验证，结果表明该方法可同时分析伊曲茶碱原料及其制剂中的所 有已知杂质，并且可通过加校正因子的主成份自身对照法有效控制各已知杂质含量，各杂 质峰与主峰之间的分离度大于1.5,主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。
[0010] 所述峰纯度是指采用配有相应分析软件的光二极管阵列检测器，采集、记录、分析 经色谱柱分离组份的光谱数据，自动生成的表征特定分离组份对应的光谱特征一致性的加 权值。
[0011] 本发明伊曲茶碱有关物质的高效液相色谱分析方法，采用反相色谱柱及紫外检测 器，是以乙腈-磷酸盐缓冲液的混合溶液为流动相，进行等度洗脱，包括如下步骤：
[0012] (1)样品配制:取伊曲茶碱原料或制剂粉末，用乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液超声 溶解，过滤或离心，配制成浓度为〇. 1-1.5mg/ml的伊曲茶碱溶液；
[0013] (2)色谱条件设置:采用反相C18柱，柱温设置在20-50°C;以乙腈和磷酸盐缓冲液 的混合液为流动相，进行等度洗脱;流速为0.5-2. Oml/min;检测波长为210-270nm;
[0014] (3)检测:取步骤(1)配制的伊曲茶碱溶液，进样10-50iU，记录色谱图。
[0015] 步骤（2)中反相C18柱选自Grace Smart C18(250X4.6mm，5ym)、Agilent C18(250 X4? 6mm，5ym)或Diamonsil C18(250 X4? 6mm，5ym)，优选Diamonsil C18(250X4.6mm，5y m) 〇
[0016] 步骤(1)乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液中乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1。 [0017]步骤⑵流动相中乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为50:49-54，优选50:50。
[0018] 步骤(1)或步骤(2)中所用磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾的水溶液，磷酸二氢钾的浓 度为 0.01-0.5111〇1/1，优选0.05111〇1/1，用氢氧化钾调?11值至5.0-7.0，优选5.9-6.3。
[0019] 步骤(2)中流速为0.8-1.2ml/min，检测波长为225-235nm。
[0020] 步骤(3)中进样量为20yl。
[0021] 采用本发明方法可有效地控制伊曲茶碱原料及制剂中的有关物质，8个已知杂质 均能在一张图谱上分析出来，各杂质峰与主峰之间的分离度大于1.5,主峰与各杂质峰峰纯 度均为1.0。分析过程见实施例1，典型色谱图见图1，计算结果见表1。
[0022] 表1伊曲茶碱与各已知杂质色谱分离参数结果
[0024]采用本发明方法能够分析伊曲茶碱在各种复杂环境下的降解杂质，方法专属性 强。按中国药典2015年版四部通则〈0512>(高效液相色谱法)及通则〈9101 >(药品质量标准 分析方法验证指导原则）的定义和验证方法，将伊曲茶碱原料或制剂粉末分别用酸、碱、高 温、氧化、光照破坏，制得破坏样品，按本发明方法分别采集各破坏样品色谱图，分析过程见 实施例2,典型色谱图见图2-7。结果表明该方法能够分析经酸、碱、高温、氧化、光照破坏的 样品，主峰与各杂质峰均能达到基线分离，主峰纯度均为1.0。
[0025]采用本发明方法能对各已知杂质进行定量分析。按中国药典2015年版四部通则 0512(高效液相色谱法)及通则9101(药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义和验证 方法，采用杂质对照法对伊曲茶碱8个已知杂质的检测限、定量限进行检测，结果表明该方 法对各杂质的响应值高，能有效控制各已知杂质，结果见表2。
[0026]表2伊曲茶碱及其已知杂质定量分析验证参数结果
[0029] 本发明首次对伊曲茶碱原料及其制剂杂质进行溯源归属，鉴定了 8个已知杂质，为 伊曲茶碱原料及其制剂有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，具有较大的积极进步效果 和实际应用价值。 四、
【附图说明】
[0030] 图1是实施例1伊曲茶碱与已知杂质的混合色谱图。
[0031] 图2是实施例2酸破坏色谱图。
[0032]图3是实施例2碱破坏色谱图。
[0033]图4是实施例2高温破坏色谱图。
[0034]图5是实施例2氧化破坏色谱图。
[0035]图6是实施例2光照破坏色谱图。
[0036] 图7是实施例2伊曲茶碱片未破坏样品色谱图。
[0037] 图8是实施例3伊曲茶碱有关物质色谱图。
[0038]采用本发明分析方法定位已知杂质（杂质A-H，图1)，主峰与各杂质峰均能达到基 线分离。采用本发明分析方法伊曲茶碱及其片剂有关物质，结果伊曲茶碱原料仅检出微量 杂质B(保留时间：14.160min，图8)，伊曲茶碱片则检出微量杂质B和1个未知杂质(保留时间 依次为：13.935min、7.073min，图7)。采用本发明分析方法考察伊曲茶碱制剂样品在酸、碱、 高温、光照、氧化等因素影响下的降解产物，与降解前样品比较，结果表明本品对酸、高温较 稳定，酸破坏仅检出微量杂质A和杂质B(保留时间依次为:7.898min、13.949min，图2)，高温 破坏仅检出微量杂质B和1个未知杂质(保留时间依次为：13.8961^11、7.027111111，图4);本品 在碱、光、氧化条件下不稳定，其中碱破坏检出杂质A(保留时间：7.909min)、杂质B(保留时 间：13.962min)、杂质C(保留时间:4.560min)和1个未知杂质（图3)，光破坏检出杂质A(保留 时间：7.889min)、杂质B(保留时间：13.915min)、杂质C(保留时间：4.564min)和1个未知杂 质（图3)，氧化破坏检出杂质B(保留时间：13.984min)、杂质C(保留时间：4.563min)和3个未 知杂质（图5)。 五、
【具体实施方式】 [0039] 实施例1:
[0040]检测仪器与色谱条件：
[0041 ] 高效液相色谱仪:Agilent PUMP，Agilent DAD检测器
[0042]色谱柱：01&111〇118；[1018色谱柱（250\4.61]1111，5_);流动相：体积比为50:50的乙 腈-0.05mol/L磷酸盐缓冲液(氢氧化钾调pH值至6.1);检测波长:230nm;流速：1 .Oml/min; 进样量:20iU。
[0043] 实验步骤：
[0044] (D样品配制：
[0045]取伊曲茶碱、已知杂质A-H各适量，用体积比1:1的乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸二 氢钾6.8g，加水1000ml使溶解，用氢氧化钾调节pH值至6.1)超声溶解并稀释制成含伊曲茶 碱约为0.5mg/m 1、杂质A-H均约为5yg/m 1的溶液，作为样品溶液。
[0046] (2)检测:取上述样品溶液，进样20yl，记录色谱图。
[0047] 典型色谱图见图1。
[0048] 实施例2:
[0049] 检测仪器与色谱条件：
[0050] 高效液相色谱仪:Agilent PUMP，Agilent DAD检测器
[0051 ] 色谱柱:Diamonsi 1 C18色谱柱（250 X 4 ? 6mm，5wn);流动相：同实施例1;检测波长： 230nm;流速：1.0ml/min〇 [0052] (1)样品配制：
[0053]酸破坏:取伊曲茶碱片，研细，取细粉适量(约相当于含伊曲茶碱10mg)，置20ml棕 色量瓶中，加lmol/L盐酸溶液2ml，置60°C水浴2小时，取出，放冷，加lmol/L氢氧化钠溶液 2ml，用体积比1:1的乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水1000ml使溶解，用氢氧化 钾调节pH值至6.1)溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为酸破坏样品。
[0054]碱破坏:取伊曲茶碱片，研细，取细粉适量(约相当于含伊曲茶碱10mg)，置20ml棕 色量瓶中，加lmo 1 /L氢氧化钠溶液2ml，置60 °C水浴2小时，取出，放冷，加lmo 1/L盐酸溶液 2ml，用体积比1:1的乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水1000ml使溶解，用氢氧化 钾调节pH值至6.1)溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为碱破坏样品。
[0055]高温破坏:取伊曲茶碱片，研细，于150 °C加热3小时，取细粉适量(约相当于含伊曲 茶碱10mg)，置20ml棕色量瓶中，用体积比1:1的乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加 水1000ml使溶解，用氢氧化钾调节pH值至6.1)溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为高温破 坏样品。
[0056]氧化破坏:取伊曲茶碱片，研细，取细粉适量(约相当于含伊曲茶碱10mg)，置20ml 棕色量瓶中，加30 %过氧化氢溶液2ml，置60°C水浴2小时，取出，放冷，用体积比1:1的乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水1000ml使溶解，用氢氧化钾调节pH值至6.1)溶解并 稀释至刻度，摇匀，过滤，作为氧化破坏样品。
[0057]光破坏:取伊曲茶碱片，研细，取细粉适量(约相当于含伊曲茶碱10mg)，置20ml棕 色量瓶中，用体积比1:1的乙腈_磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水1000ml使溶解，用 氢氧化钾调节pH值至6.1)溶解并稀释至刻度，置强光（10000LX)下照射72小时，摇匀，过滤， 作为光破坏样品。
[0058]未破坏:取伊曲茶碱片，研细，取细粉适量(约相当于含伊曲茶碱10mg)，置20ml棕 色量瓶中，用体积比1:1的乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水1000ml使溶解，用 氢氧化钾调节pH值至6.1)溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为未破坏样品。
[0059] (2)检测:取上述各样品溶液，分别进样20yl，分别记录色谱图。
[0060] 典型色谱图见图2-7。
[0061 ] 实施例3:
[0062]检测仪器与色谱条件：
[0063] 高效液相色谱仪:Agilent PUMP，Agilent DAD检测器
[0064] 色谱柱：01&111〇118；[1018色谱柱（250\4.61]1111，5_);流动相：体积比为50:50的乙 腈-0.05mol/L磷酸盐缓冲液(氢氧化钾调pH值至6.1);检测波长:230nm;流速：1 .Oml/min; 进样量:20iU。
[0065] 实验步骤：
[0066] (1)样品配制:取伊曲茶碱适量，用体积比1:1的乙腈-0.05mol/L磷酸盐缓冲液(氢 氧化钾调pH值至6.1)溶解并稀释制成每lml中约含0.5mg的溶液，摇匀，作为样品溶液。 [0067] (2)检测:取上述样品溶液，进样20yl，记录色谱图。
[0068] 典型色谱图见图8。
【主权项】
1. 一种伊曲茶碱有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 样品配制：取伊曲茶碱原料或制剂粉末，用乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液超声溶 解，过滤或离心，配制成浓度为0.1-1.5mg/ml的伊曲茶碱溶液； (2) 色谱条件设置:采用反相C18柱，柱温设置在20-50°C;以乙腈和磷酸盐缓冲液的混 合液为流动相，进行等度洗脱;流速为0.5-2. Oml/min;检测波长为210-270nm; (3) 检测:取步骤（1)配制的伊曲茶碱溶液，进样10-50μ1，记录色谱图。2. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤（2)中反相C18 柱选自 Grace Smart C18(250X4.6mm，5ym)、Agilent C18(250X 4.6mm，5ym)或DiamonsiI C18(250X4.6mm，5ym)〇3. 根据权利要求1或2所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤（2)中反相C18柱为Diamonsil C18(250X4.6mm，5ym)〇4. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(1)乙腈和磷酸盐缓冲液的混合液中乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1。5. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(2)流动相中乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为50:49-54。6. 根据权利要求1或5所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(2)流动相中乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为50:50。7. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾的水溶液，磷酸二氢钾的浓度为〇. 01-0.5mol/L，用氢 氧化钾调pH值至5.0-7.0。8. 根据权利要求7所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 所述磷酸盐缓冲液中磷酸二氢钾的浓度为〇. 〇5mol/L，用氢氧化钾调pH值至5.9-6.3。9. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(2)中流速为0.8-1.21111/1^11，检测波长为225-23511111。10. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(3)中进样量为20μ1。
【文档编号】G01N30/02GK105891377SQ201610475927
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】吴标, 崔红晓, 施伶俐, 王娟
【申请人】合肥久诺医药科技有限公司