人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法，该方法以超高效液相色谱技术从待测样品中分离ACh成分，从而为准确检测ACh含量奠定了基础。该技术方案以实验手段发现HILIC柱更适于极性化合物的分离，可有效分离ACh与iso?ACh，且对Cho也具有较好的分离效果，在此基础上进一步设计了色谱条件及内标物类别，以同位素的d9?ACh同时作为ACh和iso?ACh的内标物，可最大限度地减少因样品损失造成的分析误差，有效保证了测定结果的准确性。在利用UPLC有效分离ACh的基础上，本发明以液质联用系统执行ACh信号检测，通过质谱条件的优化实现了对ACh的准确定量，所得结果稳定准确，线性及灵敏性良好，同时具有较低的检出限和较高的回收率，应用前景广阔。
【专利说明】
人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物化学技术领域，进一步涉及人体内痕量物质的定量分析，具体涉 及人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 乙酰胆碱(ACh)，是一种经典的胆碱能神经递质，通过结合特异性M型或N型胆碱能 受体，在神经细胞之间或神经细胞与效应器细胞之间中发挥着重要的电信息传递作用。乙 酰胆碱的生理功能非常广泛，对于调节肌力、睡眠、体温、血压，尤其是学习、记忆力、判断力 等高级认知功能方面起着关键的作用。传统上多数人认为乙酰胆碱主要存在于神经系统 中，且对于乙酰胆碱及其受体的研究主要集中于它们在神经系统中的作用。但近年来，越来 越多的证据表明机体除神经系统外，多种其它组织和细胞亦具有合成乙酰胆碱的能力，构 成"非神经性胆碱能系统"（non-neuronal cholinergic system)，如内皮细胞、上皮细胞、 生殖细胞、间质细胞等。
[0003] 研究发现胆碱能信息传递和调节功能在生命起源过程中发挥着重要的作用，胆碱 能系统存在于从原始单细胞生物(如细菌)到多细胞的高等动物(如人类）的广泛的生物系 统，提示乙酰胆碱不仅是一种与系统发生、发展密切相关的古老分子，而且具有调节非神经 性组织细胞与外环境（如激素、生长因子、细胞因子）之间相互作用的功能，参与细胞的增 殖、分化、细胞骨架的形成等基本活动。
[0004]由此可见，检测体内ACh的水平对于研究疾病的病理生理过程能够提供直接的有 价值的信息。然而，由于机体内存在丰富的AChE(乙酰胆碱脂酶），其水解乙酰胆碱的Km(50-lOOwnol/L)很高，ACh很快被AChE水解，组织、体液中乙酰胆碱的含量可能会很低，所以寻找 相对稳定、准确、合适的测定方法非常重要。
[0005]现有技术中，人们多利用对乙酰胆碱具有敏感性的组织与待测样品接触，再通过 组织的生理变化近似的考察待测样品中乙酰胆碱含量。例如，20世纪60年代以前有研究者 利用水蛭背肌、蛙腹直肌在低浓度ACh的作用下发生收缩，根据肌肉收缩的幅度计算ACh的 浓度;近年来有研究者利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物感受细胞来实时检测胰腺内分泌细 胞ACh的释放量。尽管上述方法具有一定的灵敏性，但特异性较差，体内类似的生物碱性分 子可产生同样的生物学效应，导致实验结果准确性较低，再加之每个样本需逐个进行测定、 耗时较长，因此此类方法难以实现定量分析。近年来，有研究者采用放射免疫法检测ACh，虽 然免疫反应具有一定的特异性，但测定结果容易出现假阳性，灵敏度低，且该方法在操作过 程中涉及放射性物质，因此目前已极少应用。此外，有报道称通过微透析技术，再结合化学 荧光法、紫外检测法、电化学法可测定动物脑脊液内ACh的含量，但此类方法并非直接检测 ACh分子，而是检测Ach参与化学反应后所得产物，通过反应产物量间接定量ACh的含量，这 导致检测结果受外界条件影响较大，尤其在Ach含量极小的状态下，难以获得准确结果。综 上所述，现有技术中ACh的定量方法缺陷较为明显，且普遍是针对神经系统内ACh的检测，而 对于神经系统外ACh的检测目前鲜有报道。
[0006] 高效液相色谱技术在Ach的定量分析中受到了广泛的关注，如果能利用HPLC将Ach 与其他物质进行有效分离，则有望实现Ach的准确定量。然而这一过程涉及三方面技术难 点，首先，人外周血单个核细胞内小分子生物碱众多，对Ach的色谱分离存在干扰，其中较为 典型的是ACh分子的同分异构体iso-ACh(丁基甜菜碱butyrobetaine)，iso-ACh作为肉毒碱 生物合成中的酶(G-甜菜碱羟化酶）的底物，是赖氨酸降解过程中左旋肉碱的前体，而左旋 肉碱对于长链脂肪酸在线粒体内外的转运起着非常重要的作用。因此ACh和iso-ACh的色谱 分离对于准确定量ACh至关重要，然而现有技术中所选用的色谱柱及色谱条件难以实现二 者的分离。此外，在对Ach进行有效分离的基础上，若实现定量分析必须匹配灵敏的检测手 段，采用何种检测器及操作条件才能保证检测的准确性、检测模式与HPLC的分离环节如何 匹配才能避免系统性误差，诸多问题在现有技术中尚未得到有效解决。另外，由于人外周血 单个核细胞中Ach极小，因此环境中所存在的AChE可能对检测结果造成影响，在这种情况 下，采取何种方式抑制其对Ach的降解作用，同时不影响分离效果及检测信号响应水平，应 当进行针对性设计。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱 含量的检测方法，以解决现有技术中相关方法普遍仅用于检测神经系统内ACh含量，而缺乏 一种检测人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的方法的技术问题。
[0008] 本发明要解决的另一技术问题是现有技术的相关检测方法灵敏度较低。
[0009] 本发明要解决的再一技术问题是现有技术的相关检测方法准确性较低。
[0010] 本发明要解决的又一技术问题是现有技术的相关检测方法会受到乙酰胆碱酯酶 的影响导致检测结果不稳定。
[0011] 本发明要解决的又一技术问题是当采用液质联用方法检测人外周血单个核细胞 内乙酰胆碱含量时，液相色谱环节难以实现对ACh的有效分离。
[0012] 本发明要解决的又一技术问题是当采用液质联用方法检测人外周血单个核细胞 内乙酰胆碱含量时，质谱环节对ACh的定量不够准确。
[0013] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0014] 一种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法，该方法利用超高效液相色 谱分离待测样品中的乙酰胆碱，而后对分离出的乙酰胆碱进行定量;所述利用超高效液相 色谱分离待测样品中的乙酰胆碱，包括以下步骤：
[0015] 1)提取人外周血单个核细胞；
[0016] 2)向步骤1)提取得到的人外周血单个核细胞中加入含有0.01~1 % (v/v)甲酸的 去离子水溶液，混匀，而后加入含有ACh的内标物、i so-ACh的内标物、Cho的内标物的乙腈溶 液，混匀，固液分离取上清；
[0017] 3)取步骤2)所述上清液，向超高效液相色谱仪中进样检测;其中柱温为40~50°C， 流速为0.2~0.8mL/min，而后以甲酸铵的水溶液和乙腈为流动相进行线性洗脱。
[0018]作为优选，步骤2)中所述ACh的内标物是d9-ACh。
[0019] 作为优选，步骤2)中所述iso-ACh的内标物是d9-ACh。
[0020]作为优选，步骤2)中所述Cho的内标物是溴化乙酰-0-甲基胆碱。
[0021 ] 作为优选，步骤2)中所述的固液分离是以12000~18000rpm的转速离心5~15min; 更优的，是以15000rpm的转速离心10min。
[0022]作为优选，步骤2)是在0~8°C条件下进行的。
[0023] 作为优选，步骤3)中色谱柱为HILIC柱；更优的，选用ACQUITY CORTECS UPLC HILIC色谱柱。
[0024]作为优选，步骤3)中柱温为45°C。
[0025] 作为优选，步骤3)中样品流速为0.5mL/min。
[0026]作为优选，步骤3)所述线性洗脱具体包括以下操作：以含90% (v/v)乙腈、10% (v/ v)的100mm〇l/L甲酸铵水溶液的溶液为初始洗脱液，在0.75分钟内将乙腈成分线性减少至 60% (v/v)，保持0.25分钟，而后在0.25分钟内将乙腈成分线性减少至30% (v/v)，并保持 0.65分钟，最后在1.9分钟内将洗脱液成分调整成为含90 % (v/v)乙腈、10 % (v/v)的 100mmol/L甲酸铵水溶液。在此基础上进一步优选的，步骤3)中进样量为8~12yL;更优的进 样量是1〇此。
[0027]作为优选，向步骤1)提取得到的人外周血单个核细胞中加入水杨酸毒扁豆碱，再 执行步骤2)。
[0028] 在以上任一技术方案基础上优选的，所述对分离出的乙酰胆碱进行定量，是在超 高效液相色谱基础上串联四级杆质谱仪检测实现的，质谱检测的条件为：电离模式为ESI+， 离子源温度为150 °C，毛细管电压3. OkV，脱溶剂气温度450 °C，脱溶剂气流速500L/h，锥孔气 体流速150L/h。
[0029] 作为优选，以上质谱检测的检测模式为MRM。
[0030] 在以上技术方案中，所述人外周血单个核细胞是一类人体内细胞名称，而并非从 细胞数量层面限定为1个细胞;也就是说本发明并非限定从1个细胞中检测乙酰胆碱含量， 而通常应当是提取一定量的人外周血单个核细胞、以其作为待测样品。
[0031] 在以上技术方案中，所述d9-ACh是乙酰胆碱的同位素取代物氘代乙酰胆碱-d9 (acetylcholine_d9)，该物质可依据现有技术的常规制备方法获得，也可自市面购得。 [0032] 在以上技术方案中，所述ACQUITY CORTECS UPLC HILIC色谱柱仅限定为具有以下 特征的色谱柱：由waters公司出品，型号为0RTECS UPLC HILIC，其具体规格为1.6wn，2.1mm X 100mm，部件号为 186007106。
[0033]在以上技术方案中，人外周血单个核细胞的提取可以利用本领域公知的常规技术 方法实现，也可以利用以下方法实现：
[0034] 1、向15ml锥形管中加入5ml淋巴细胞分离液；
[0035] 2、取5ml EDTA抗凝静脉血与等量PBS缓冲液充分混匀，将离心管倾斜45度角，用滴 管吸取稀释血液，在离分层液面上1 cm处，沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的 界面;4°C或20 °C，水平离心2000rpm X 20分钟；
[0036] 3、离心后管内分为三层，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层 狭窄带；
[0037] 4、用毛细玻璃吸管插到云雾层，沿试管壁周缘吸取单个核细胞；
[0038](或:先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液 交界面的PBMC，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆）；
[0039] 置入另一 15ml锥形管中，加入10ml PBS缓冲液，1500rpmX5分钟，洗涤细胞两次 (弃上清，加入上述体积的PBS缓冲液，1500bpm X 5分钟）；
[0040] 5、末次离心后，弃上清，加入lml PBS缓冲液，重悬细胞；
[00411 6、细胞计数:取10yl细胞悬液与20yl 0.4%台盼兰染液混合，3-5分钟后取样，直 接利用Countess自动细胞计数仪计数并检测细胞活力；
[0042]或者于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数；
[0043]单个核细胞浓度（细胞数/lml细胞悬液）=(4个大方格内细胞总数/4) X 104 X 2 (稀释倍数）；
[0044] 7、细胞活力检测:死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色;计数200个淋巴细胞;计 算出活细胞百分率；
[0045]活细胞百分率=(活细胞数/细胞总数）X 100% ;
[0046]用本法分离PBMC，两种方法计数和检测细胞活力，细胞纯度在98%以上，收获率可 达95%，活细胞百分率在95%以上；
[0047] 8、将细胞悬液再次离心，1500rpmX 5分钟，小心将上清液吸除干净；
[0048] 9、留取细胞团于离心管，4°C或25°C中保存，即得到用作为待测样品的人外周血单 个核细胞。
[0049]在以上技术方案中，披露了以人外周血单个核细胞为待测样品的乙酰胆碱检测方 法。实际应用中，为了计算其具体数值，通常需要用标准品利用上述方法执行检测以制备 ACh含量与峰面积的标准曲线。在已知上述检测方法的基础上，这种标准曲线的制作可以依 据本领域的一般技术常识加以实现，例如选择何种浓度的标准品溶液、选择几个梯度浓度、 内标物的浓度等，均可依据技术实际进行适应性选择。当然，该标准曲线的制备也可利用以 下方法实现：
[0050] 先分别准确称取ACh、i s o-ACh、Cho和内标d9-ACh、溴化乙酰-0-甲基胆碱5 Omg于定 容瓶中，以纯乙腈定容至50mL，配制成lmg/mL的单标储备液。
[00511用50 %乙腈配制至少5个不同浓度的ACh、BB、Cho用于制作标准曲线，分别为ACh: 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、5ng/ml;BB:0?5、1、2、3、5ng/mL;Cho:0.6、1.2、2.4、6.0、12.0、 24.0、60.0、120.0ng/mL。内标d9-ACh、溴化乙酰-0-甲基胆碱应用终浓度Ing/mL。
[0052]本发明提供了一种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法，该方法以超 高效液相色谱技术从待测样品中有效分离ACh成分，从而为准确检测ACh含量奠定了基础。 分析物的性质对于液相色谱和质谱方法的选择至关重要，本发明中，由于乙酰胆碱和其同 分异构体iso-ACh均为强极性亲水性小分子化合物，二者的物理性质极其相似，在脑中均以 较高浓度存在，因此在进行细胞内ACh的准确定量时确保二者的色谱分离度相当重要。为此 本发明对实验中所选用的色谱柱进行创新设计，通过实验发现由于ACh、is〇-ACh和Cho均为 强极性小分子化合物，因此反相色谱柱对于这些分析物的分离和保留效果较差，从而放弃 了 UPLC中常用的C18反相色谱柱。在此基础上，本发明创新性的发现HILIC柱（即亲水相互作 用色谱柱），更适于极性化合物的分离，应用于本发明发现，HILIC柱可有效分离ACh与iso-ACh ， 且对 Cho 也具有较好的分离效果。
[0053]在确定色谱柱的基础上，本发明进一步设计了色谱条件及内标物类别，以同位素 的d9-ACh同时作为ACh和iso-ACh的内标物，可最大限度地减少因样品损失造成的分析误 差，有效保证了测定结果的准确性。
[0054]此外，现有技术普遍认为乙酰胆碱酯酶的存在可能会影响细胞内ACh的含量的检 测，针对这一问题，本发明筛选了多种乙酰胆碱酯酶抑制剂，实验发现毒扁豆碱不影响分析 物的质谱反应，因此更适于本发明的检测方法。然而实验结果进一步发现，对于本发明提供 的检测方法，无论是否添加乙酰胆碱酯酶抑制剂均不影响检测结果的准确性及稳定性，这 也从侧面上表明本发明检测方法可免去乙酰胆碱酯酶抑制剂的添加环节，更加简便。
[0055]在利用UPLC实现有效分离的基础上，本发明以液质联用的方式执行ACh信号检测， 通过质谱条件的优化实现了对ACh的准确检测，所得结果稳定准确，线性及灵敏性良好，同 时具有较低的检出限和较高的回收率。
【附图说明】
[0056]图1是本发明实施例1中正离子电喷雾离子(ESI)模式下ACh及iso-ACh的解离图。 [0057] 图2是本发明实施例1中ACh、i so-ACh、d9-ACh在M冊模式下的质谱图。
[0058]图3是本发明实施例1中Cho及溴化乙酰-0-甲基胆碱在MRM模式下的质谱图。
[0059] 图4是本发明实施例1中添加不同浓度毒扁豆碱对ACh检出浓度的影响实验结果 图。
[0060] 图5是本发明实施例1中ACh，iso-ACh及Cho的浓度-峰面积标准曲线。
【具体实施方式】
[0061] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0062] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准确 数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的范围 内变化，比如，"大约100"表示的可以是90至1」110之间的任何数值。此外，在"大约第一数值到 第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言 可能与测量仪器的精度有关。
[0063]除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0064]以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂;所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值;以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0065]实施例1(一种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法）
[0066] 1.1实验对象
[0067] 随机选取2013.3.1-2013.4.1在天津医科大学总医院健康体检中心22例健康成 人，男性12名，年龄(50.2±3.8)岁，女性10名，年龄(49.1 ±3.6)岁。晨起空腹取外周静脉血 (EDTA-K2抗凝血)5ml各2管。取血后1小时内分别在4°C或25°C条件下提取外周血单个核细 胞。所有操作程序由天津医科大学总医院伦理委员会批准。入选对象均签署了知情同意书。 [0068] 1.2仪器和材料
[0074] 1.3实验方法
[0075] 1.3.1人外周血单个核细胞的提取
[0076] 1、向15ml锥形管中加入5ml淋巴细胞分离液；
[0077] 2、取5ml EDTA抗凝静脉血与等量PBS缓冲液充分混匀，将离心管倾斜45度角，用滴 管吸取稀释血液，在离分层液面上1 cm处，沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的 界面;4°C或20 °C，水平离心2000rpm X 20分钟；
[0078] 3、离心后管内分为三层，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层 狭窄带；
[0079] 4、用毛细玻璃吸管插到云雾层，沿试管壁周缘吸取单个核细胞；
[0080] (或:先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液 交界面的PBMC，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆）；
[0081 ] 置入另一 15ml锥形管中，加入10ml PBS缓冲液，1500rpmX5分钟，洗涤细胞两次 (弃上清，加入上述体积的PBS缓冲液，1500bpm X 5分钟）；
[0082] 5、末次离心后，弃上清，加入lml PBS缓冲液，重悬细胞；
[0083] 6、细胞计数:取10yl细胞悬液与20yl 0.4%台盼兰染液混合，3-5分钟后取样，直 接利用Countess自动细胞计数仪计数并检测细胞活力；
[0084] 或者于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数；
[0085] 单个核细胞浓度（细胞数/lml细胞悬液）=(4个大方格内细胞总数/4) X 104 X 2 (稀释倍数）；
[0086] 7、细胞活力检测:死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色;计数200个淋巴细胞;计 算出活细胞百分率；
[0087]活细胞百分率=(活细胞数/细胞总数）X 100% ;
[0088]用本法分离PBMC，两种方法计数和检测细胞活力，细胞纯度在98%以上，收获率可 达95%，活细胞百分率在95%以上；
[0089] 8、将细胞悬液再次离心，1500rpmX 5分钟，小心将上清液吸除干净；
[0090] 9、留取细胞团于离心管，4°C或25°C中保存，即得到用作为待测样品的人外周血单 个核细胞。
[0091] 1.3.2细胞处理
[0092]细胞处理的操作分别在4°C和25°C中进行，每进行完一步后将离心管密封以避免 乙腈挥发。
[0093]向细胞样本中加入1 OOyL去离子水/0.1 %甲酸(体积:体积），充分涡匀，然后加入 300yL含有内标(ACh和i so-ACh的内标为d9-ACh，Cho的内标为溴化乙酰-0-甲基胆碱）的纯 乙腈，充分涡匀后，15000rpmX 10分钟，留取上清液并转移至质谱进样瓶中，上样检测。 [0094] 1.3.3标准储备液和内标溶液的配制
[0095] 先分别准确称取ACh、i s 〇 _ACh、Ch 〇和内标dg ~ACh、溴化乙酰-0-甲基胆碱5 Omg于定 容瓶中，以纯乙腈定容至50mL，配制成lmg/mL的单标储备液。
[0096]用50 %乙腈配制至少5个不同浓度的ACh、BB、Cho用于制作标准曲线，分别为ACh: 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、5ng/ml;BB:0?5、1、2、3、5ng/mL;Cho:0.6、1.2、2.4、6.0、12.0、 24.0、60.0、120.Ong/mL。内标d 9-ACh、溴化乙酰-0-甲基胆碱应用终浓度Ing/mL。
[0097] 1.3.4超高效液相色谱一质谱条件
[0098]对分析物及其内标的质谱定性和定量采用美国Waters ACQUITY TQD串联三重四 极杆液质联用仪。样本中的物质在ACQUITY UPLC系统中，经⑶RTECS UPLC HILIC色谱柱 (1.6mi，2.1mm X 100mm，部件号186007106)进行分离。色谱分离的柱温为45 °C，流速为 0.5mL/min。流动相A为100mm〇l/L甲酸铵(pH 3.5)，流动相B为乙腈，采用线性洗脱，梯度为 初始90%乙腈，在0.75分钟内线性增加至60%，保持0.25分钟，然后在0.25分钟内线性减少 至30 %，并保持0.65分钟，最后在1.9分钟内返回至初始条件。进样体积10yL。单个样本运行 约3分钟。
[0099]分析物及其内标的鉴定和定量通过串联四级杆质谱(TQD)系统。电离模式为ESI+ (正离子电喷雾离子源），离子源温度为150°C，毛细管电压3.0kV，脱溶剂气温度450°C，脱溶 剂气流速500L/h，锥孔气体流速150L/h。在多反应检测(multiple reaction monitoring， MRM)模式下进行定量分析(见表1)。
[0100]表1UPLC-MS/MS分析物及内标的质谱参数
[0102] 1.3.5数据分析
[0103] 数据分析主要采用Waters MassLynx V4.1和QuanLynx软件。根据离子反应强度， 构建标准曲线，y =分析物面积/内标面积，x =对应的分析物浓度。标准曲线采取y=m X x+i (m为斜率，i为截距）。
[0104] 回收率（％)计算公式:实际浓度/(初始浓度+添加浓度）X 100%。
[0105] 依据特征离子质量色谱峰信噪比(RS/N)=3计算实验方法的检出限。
[0106] 应用SPSS17.0软件进行统计分析。多组之间的比较应用方差分析（1(^181?1-ffallis AN0VA)〇
[0107] 实施例2(实施例1检测方法中分析物及分析柱的优化过程及实验思路）
[0108] 2.1分析物及分析柱的优化
[0109] 2.1.1内标物的选择
[0110] 液质联用定量分析多采用内标法。ACh和iso-ACh为同分异构体，且在细胞内的内 源性含量非常低，同以d9-ACh同位说作内标物，由于它们的物理和化学性质相同，可以最大 限度地减少因样品损失造成的分析误差，提高了测定结果的准确性。而对于胆碱来说，细胞 内含量相对较高，采用同位素内标与本实验应用的醋甲胆碱(与胆碱的化学结构类似)作为 内标，同样可以得到稳定的结果，节省了成本。
[0111] 2.1.2色谱柱的选择
[0112] 本实验比较了ACQUITY UPLC BEH C18和ACQUITY CORTECS UPLC HILIC色谱柱。 BEH C18色谱柱是UPLC分离中的通用型色谱柱，但对于ACh、is〇-ACh和Cho这类水溶性的强 极性小分子化合物，保留较差，对于ACh和iso-ACh的分离效果欠佳。而CORTECS UPLC HILIC 色谱柱对极性化合物有很好地保留。在本实验条件下，三种物质能够良好分离，测定无干 扰。
[0113] 2.1.3胆碱酯酶抑制剂的选择
[0114]理论上讲，乙酰胆碱酯酶的存在可能会影响细胞内ACh的含量，所以我们预先设计 向外周血中加入足量的乙酰胆碱酯酶的抑制剂。最常用的乙酰胆碱酯酶抑制剂有新斯的明 和毒扁豆碱。我们对这两种抑制剂进行了对比。在实验中我们发现，新斯的明会明显降低 ACh和d9-ACh在质谱上的响应值，这在一定程度上势必影响ACh的定量分析，而毒扁豆碱不 影响分析物的质谱反应。所以选择毒扁豆碱作为乙酰胆碱酯酶的抑制剂，来研究其是否会 影响细胞内ACh的含量。
[0115] 实施例3(实施例1检测方法中质谱条件的优化过程及实验思路）
[0116] 正离子电喷雾离子(ESI)模式可通过高电压使分子解离后形成离子化的[M]+和[M +H] +。我们发现在Waters TQD质谱中，电喷雾电压范围2.0-3.OkV和锥孔电压在15-20V之间 时，可使大部分小分子有机化合物高效解离为[M+H]+离子。由于ACh，iso-ACh和Cho均具有 季胺离子功能基团，在酸性条件下携带阳离子，所以在TQD质谱上应用ESI模式可产生良好 的敏感性和最佳的MRM条件。
[0117] △(：11，&〇4〇1和(1 94(：11分子受到能量碰撞后只产生两个子离子（片段离子）：111/2 87为共同子尚子，还有分别对应的子尚子111/2 60(六〇1和18〇-六〇1)、111/2 69((19-六〇1)，解尚模 式如图1所示。而Cho和醋甲胆碱解离产生的相同离子为m/z 60,此外，Cho还解离为m/z 45， 醋甲胆碱还解离为m/z 101、m/z 43子离子。m/z 146-87和m/z 146-60同时用于定量ACh 和iso_ACh，m/z 146-87和m/z 146-69 同时用于定量dg-AClum/z 104-60 和m/z 104-45 同时用于定量Cho，m/z 160-101和m/z 160-60同时用于定量内标醋甲胆碱。
[0118]实施例4(实施例1检测方法中液相色谱条件的优化过程及实验思路）
[0119]根据流动相和固定相相对极性的不同，液相色谱分为正相色谱和反相色谱。流动 相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱。非极性键合相色谱可作反相色谱。反相液相 色谱柱效高、分离能力强、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种，用 于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析。反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基 于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离.在生物大分子分离中，多采 用离子强度较低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作 流动相。既往多数文献报道液相色谱分离和检测ACh用C18反相色谱柱。但由于ACh、is〇-ACh 和Cho均为强极性小分子化合物，我们认为应用反相色谱柱对于这些分析物的分离和保留 效果会较差，所以应用UPLC-MS/MS检测ACh、is〇-ACh和Cho时，选择合适的色谱分离柱和流 动相非常重要。
[0120] 我们选择性了多种色谱柱，如Agilent ZORBAX C18反相色谱柱、Phenomenex C18 色谱柱等，发现这些反相色谱柱均不能达到有效分离ACh和iso-ACh的结果，因ACh和其同分 异构体的化学极性极其相似，所以二者在反相色谱柱上的响应相同。所以我们换为HILIC柱 即亲水相互作用色谱柱。这类柱子的分析物通常是极性化合物，如极性代谢物，碳水化合物 或肽。固定相是强亲水性的极性吸附剂，如硅胶键合相，极性聚合物填料或离子交换吸附 剂。这些固定相的共同特点是它们和水的作用力很强，因此属于"亲水性"。为此，我们选择 了Waters C0RTECS色谱柱，成功实现了ACh和iso-ACh的色谱分离，且对Cho的分离效果也很 好。HILIC模式使用的梯度和反相模式相反。初始条件为高比例有机相，然后有机相比例逐 渐降低，达到有效分离ACh和iso-ACh的效果。如图2图3所示，ACh和iso-ACh分别在1.91min 和2.19min出峰，内标dg-ACh在1.91min出峰，但和ACh在不同的通道解离，所以可以有效与 ACh分离。Cho和醋甲胆碱分别在2. OOmin和1.74min出峰。样本和标准品均可得到相同的出 峰时间，排除了基质效应的影响。
[0121 ]实施例5(实施例1检测方法的有效性实验）
[0122] 5.1样品稳定性检验
[0123] 传统认为，检测生物样本中ACh的含量需要预先加入天然的乙酰胆碱酯酶抑制剂， 如有机磷化合物、钙离子螯合剂及氨基甲酸酯类等化合物。然后通过蛋白沉淀的方式祛除 乙酰胆碱酯酶。为此，我们用EDTA(钙离子螯合剂)抗凝采血管采集血样，且血样离体后立即 置于冰上抑制酶的活性。此外，为验证乙酰胆碱酯酶对细胞内ACh是否有影响，我们特别设 立对照试验，向采血管中预先加入不同浓度的毒扁豆碱抑制乙酰胆碱酯酶的活性。结果发 现，单个核细胞内ACh的含量不依赖于乙酰胆碱酯酶的变化而变化(如图4所示）。我们分析， 单个核细胞内ACh与乙酰胆碱酯酶可能存在于细胞的不同部位，后者存在于细胞浆中或细 胞膜上，而单个核细胞内ACh则可能与神经元相似，存在于某一特殊类型的细胞器，如囊泡 中。这一推论在本论文的第三部分中得以验证。
[0124] 5.2线性和敏感性
[0125] 分析物标准溶液的浓度和质谱上各种分析物的响应值呈线性相关。三重分析物的 标准曲线分别为:ACh，y = 2.2521x+0.0038，r2 = 0.9993; is〇-ACh，y=1.0037x+0.4152，r2 = 0.9995;Ch，y = 0.0262x+0.0248，r2 = 0.9996;标准曲线如图5所示，线性关系良好。
[0126] 5.3检出限和回收率
[0127] 在稳定的液相色谱-质谱条件下，通过检测低浓度标准溶液在质谱上的响应值，在 信噪比（S/N) = 3时确定各种分析物的检出限。结果ACh、is〇-ACh和Cho的检出限分别为 0.005ng/106细胞、0.003ng/10 6细胞和0.0036ng/106细胞，满足准确定量各种分析物的最低 要求。回收率测定时，向基础细胞量内加入低、中、高三个浓度(见表2 )，分析回收率范围在 94.60-104.73%。
[0128] 表2单个核细胞内ACh、iso_ACh和Cho的检出限和回收率
[0130] 5.4精确性和稳定性分析
[0131 ] 使用ACh的氘代稳定同位素标记标准品（ISTD)进行定量分析ACh和iso-ACh，用醋 甲胆碱进行Cho定量时，分别取三个不同浓度的样本进行精确性分析。各分析物的质控精确 度如表所示。组内和组间变异系数范围在2.1-7.1 %之间，为检测样本溶液的稳定性，取同 一供试品溶液分别于0,2,4,8，12,24,36,481!进样分析，考察共有峰的相对保留时间和峰面 积比值。结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD为0.37 %，峰面积比值RSD为1.32%，表明 供试样溶液在48h内基本稳定。良好的精确性和稳定性保证了该方法精密、准确，可用于定 量细胞内分析物的含量。
[0132] 表3单个核细胞内ACh、iso_ACh和Cho的精确性分析
[0134] 表3中各组符合具有以下含义：
[0135] LQC，low quality control，低控；MQC，medium quality control，中控；HQC，high quality control，高控；SD，standard deviation，标准差；％CV，percent coefficient of variation，变异系数。n = 20for all measurements〇
[0136] 以上实施例1~5结果表明，本发明方法对人外周血单个核细胞乙酰胆碱含量的检 测方法稳定可靠，细胞内ACh的浓度(含量)与其响应的线性关系良好，检测限可达0.005ng/ 1〇 6细胞，特异性高，可进行批量样本的检测;人外周血单个核细胞内ACh的含量约为0.08 ± 0.02ng/106细胞。细胞内ACh不依赖于胆碱酯酶的变化而变化，可能储存于某种细胞结构 中。这为进一步研究单个核细胞乙酰胆碱的功能奠定了基础。
[0137] 实施例6
[0138] -种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法，该方法利用超高效液相色 谱分离待测样品中的乙酰胆碱，而后对分离出的乙酰胆碱进行定量;所述利用超高效液相 色谱分离待测样品中的乙酰胆碱，包括以下步骤：
[0139] 1)提取人外周血单个核细胞；
[0140] 2)向步骤1)提取得到的人外周血单个核细胞中加入含有0.5% (v/v)甲酸的去离 子水溶液，混匀，而后加入含有ACh的内标物、iso-ACh的内标物、Cho的内标物的乙腈溶液， 混匀，固液分离取上清；
[0141] 3)取步骤2)所述上清液，向超高效液相色谱仪中进样检测;其中柱温为45°C，流速 为0.5mL/min，而后以甲酸铵的水溶液和乙腈为流动相进行线性洗脱。
[0142] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0143] 步骤2)中所述ACh的内标物是d9-ACh，所述i s〇-ACh的内标物是d9-ACh，所述Cho的 内标物是溴化乙酰-0-甲基胆碱。
[0144] 步骤2)中所述的固液分离是以15000rpm的转速离心10min。
[0145] 步骤2)是在4°C条件下进行的。
[0146] 步骤3)中色谱柱为HILIC柱。
[0147] 步骤3)所述线性洗脱具体包括以下操作：以含90% (v/v)乙腈、10% (v/v)的 100mm〇l/L甲酸铵水溶液的溶液为初始洗脱液，在0.75分钟内将乙腈成分线性减少至60% (v/v)，保持0.25分钟，而后在0.25分钟内将乙腈成分线性减少至30 % (v/v)，并保持0.65分 钟，最后在1.9分钟内将洗脱液成分调整成为含90%(v/v)乙腈、10%(v/v)的100mmol/L甲 酸铵水溶液。
[0148] 步骤3)中进样量为10yL。
[0149] 向步骤1)提取得到的人外周血单个核细胞中加入水杨酸毒扁豆碱，再执行步骤 2)〇
[0150] 所述对分离出的乙酰胆碱进行定量，是在超高效液相色谱基础上串联四级杆质谱 仪检测实现的，质谱检测的条件为：电离模式为ESI +，离子源温度为150°C，毛细管电压 3.OkV，脱溶剂气温度450°C，脱溶剂气流速500L/h，锥孔气体流速150L/h。质谱检测模式为 MRM〇
[0151] 实施例7
[0152 ] -种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法，该方法利用超高效液相色 谱分离待测样品中的乙酰胆碱，而后对分离出的乙酰胆碱进行定量;所述利用超高效液相 色谱分离待测样品中的乙酰胆碱，包括以下步骤：
[0153] 1)提取人外周血单个核细胞；
[0154] 2)向步骤1)提取得到的人外周血单个核细胞中加入含有0.01% (v/v)甲酸的去离 子水溶液，混匀，而后加入含有ACh的内标物、iso-ACh的内标物、Cho的内标物的乙腈溶液， 混匀，固液分离取上清；
[0155] 3)取步骤2)所述上清液，向超高效液相色谱仪中进样检测;其中柱温为40°C，流速 为0.2mL/min，而后以甲酸铵的水溶液和乙腈为流动相进行线性洗脱。
[0156] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0157] 步骤2)中所述ACh的内标物是d9-ACh，所述i s〇-ACh的内标物是d9-ACh，所述Cho的 内标物是溴化乙酰-0-甲基胆碱。
[0158] 步骤2)中所述的固液分离是以12000rpm的转速离心5min。
[0159]步骤2)是在0°C条件下进行的。
[0160] 步骤3)所述线性洗脱具体包括以下操作：以含90% (v/v)乙腈、10% (v/v)的 100mm〇l/L甲酸铵水溶液的溶液为初始洗脱液，在0.75分钟内将乙腈成分线性减少至60% (v/v)，保持0.25分钟，而后在0.25分钟内将乙腈成分线性减少至30 % (v/v)，并保持0.65分 钟，最后在1.9分钟内将洗脱液成分调整成为含90%(v/v)乙腈、10%(v/v)的100mmol/L甲 酸铵水溶液。
[0161] 步骤3)中进样量为8此。
[0162] 实施例8
[0163 ] -种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法，该方法利用超高效液相色 谱分离待测样品中的乙酰胆碱，而后对分离出的乙酰胆碱进行定量;所述利用超高效液相 色谱分离待测样品中的乙酰胆碱，包括以下步骤：
[0164] 1)提取人外周血单个核细胞；
[0165] 2)向步骤1)提取得到的人外周血单个核细胞中加入含有l%(v/v)甲酸的去离子 水溶液，混匀，而后加入含有ACh的内标物、i so-ACh的内标物、Cho的内标物的乙腈溶液，混 匀，固液分离取上清；
[0166] 3)取步骤2)所述上清液，向超高效液相色谱仪中进样检测;其中柱温为50°C，流速 为0.8mL/min，而后以甲酸铵的水溶液和乙腈为流动相进行线性洗脱。
[0167] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0168] 步骤2)中所述的固液分离是以18000rpm的转速离心15min。
[0169] 步骤2)是在8°C条件下进行的。
[0170] 步骤3)中色谱柱为HILIC柱。
[0171] 步骤3)所述线性洗脱具体包括以下操作：以含90% (v/v)乙腈、10% (v/v)的 100mm〇l/L甲酸铵水溶液的溶液为初始洗脱液，在0.75分钟内将乙腈成分线性减少至60% (v/v)，保持0.25分钟，而后在0.25分钟内将乙腈成分线性减少至30 % (v/v)，并保持0.65分 钟，最后在1.9分钟内将洗脱液成分调整成为含90%(v/v)乙腈、10%(v/v)的100mmol/L甲 酸铵水溶液。
[0172] 步骤3)中进样量为12此。
[0173] 实施例9
[0174] -种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法，该方法利用超高效液相色 谱分离待测样品中的乙酰胆碱，而后对分离出的乙酰胆碱进行定量;所述利用超高效液相 色谱分离待测样品中的乙酰胆碱，包括以下步骤：
[0175] 1)提取人外周血单个核细胞；
[0176] 2)向步骤1)提取得到的人外周血单个核细胞中加入含有0.7% (v/v)甲酸的去离 子水溶液，混匀，而后加入含有ACh的内标物、iso-ACh的内标物、Cho的内标物的乙腈溶液， 混匀，固液分离取上清；
[0177] 3)取步骤2)所述上清液，向超高效液相色谱仪中进样检测;其中柱温为47°C，流速 为0.4mL/min，而后以甲酸铵的水溶液和乙腈为流动相进行线性洗脱。
[0178] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法，该方法利用超高效液相色谱 分离待测样品中的乙酰胆碱，而后对分离出的乙酰胆碱进行定量;所述利用超高效液相色 谱分离待测样品中的乙酰胆碱，包括以下步骤： 1) 提取人外周血单个核细胞； 2) 向步骤1)提取得到的人外周血单个核细胞中加入含有0.01~1%(v/v)甲酸的去离 子水溶液，混匀，而后加入含有ACh的内标物、iso-ACh的内标物、Cho的内标物的乙腈溶液， 混匀，固液分离取上清； 3) 取步骤2)所述上清液，向超高效液相色谱仪中进样检测；其中柱温为40~50°C，流速 为0.2~0.8mL/min，而后以甲酸铵的水溶液和乙腈为流动相进行线性洗脱。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤2)中所述ACh的内标物是d9-ACh， 所述iso-ACh的内标物是d9-ACh，所述Cho的内标物是溴化乙酰-β-甲基胆碱。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤2)中所述的固液分离是以12000~ 18000rpm的转速离心5~15min。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤2)是在0~8°C条件下进行的。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤3)中色谱柱为HILIC柱。6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤3)所述线性洗脱具体包括以下操 作：以含90 % (v/v)乙腈、10 % (v/v)的IOOmmoI/L甲酸铵水溶液的溶液为初始洗脱液，在 0.75分钟内将乙腈成分线性减少至60 % (v/v)，保持0.25分钟，而后在0.25分钟内将乙腈成 分线性减少至30% (v/v)，并保持0.65分钟，最后在1.9分钟内将洗脱液成分调整成为含 90% (v/v)乙腈、10% (v/v)的100mmol/L甲酸铵水溶液。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤3)中进样量为8~12yL。8. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于向步骤1)提取得到的人外周血单个核 细胞中加入水杨酸毒扁豆碱，再执行步骤2)。9. 根据权利要求1~8所述的检测方法，其特征在于所述对分离出的乙酰胆碱进行定 量，是在超高效液相色谱基础上串联四级杆质谱仪检测实现的，质谱检测的条件为：电离模 式为ESI+，离子源温度为150 °C，毛细管电压3. OkV，脱溶剂气温度450 °C，脱溶剂气流速 500L/h，锥孔气体流速150L/h。10. 根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于质谱检测模式为MRM。
【文档编号】G01N30/02GK105891368SQ201610311989
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】郝峻巍, 张超, 夏义平, 蒋薇, 王春阳
【申请人】天津医科大学总医院