一种氯霉素残留量的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种氯霉素残留量的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：1)样品预处理：向样品中加入乙酸乙酯，均质、离心后蒸发近干；2)样品的净化：依次利用正己烷和无水硫酸钠柱对步骤1)得到的样品进行净化；3)样品及标准品的衍生化：采用乙酸酐为衍生试剂、三乙胺为催化剂对样品和标准品进行衍生化处理；4)气相色谱检测：取步骤3)得到的样品溶液和标准品溶液，注入气相色谱仪进行检测。本发明的氯霉素残留量的检测方法，衍生步骤简单，检测效率高，所用的衍生试剂对环境的敏感度小，所用的催化剂便宜，对人员和环境的危害小。
【专利说明】
一种氯霉素残留量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及氯霉素检测领域，具体涉及一种水产品中氯霉素残留量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 氯霉素广泛应用于动物的传染性疾病的治疗，曾在水产养殖业中得到广泛的应 用，但同时也带来了严重的残留问题，氯霉素能够抑制人体骨髓造血功能，引起贫血等等。 因此对水产品的氯霉素的检测具有特殊意义。
[0003] 国内外文献报道氯霉素类药物的检测方法主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱 联用法(GC/MS)和液相色谱-质谱联用法(LC/MS)。气相色谱-质谱联用法(GC/MS)和液相色 谱-质谱联用法(LC/MS)灵敏度高，但价格昂贵，一般基层实验室不配备这样的仪器，因此不 适合于基层实验室大量检测市场上水产品中的氯霉素的含量。气相色谱仪价格便宜，适合 于我们日常生活中水产品中氯霉素的检测。
[0004] 国内外检测氯霉素的常用方法大多数是与国家标准SC/T3018-2004方法类似，利 用N，0-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA) /三甲基氯硅烷(TMSC1)作为衍生剂，啦啶作 为催化剂。但BSTFA对环境的湿度很敏感，需要严格控制反应条件，并且衍生后的氮-硅键和 氧-硅键在气相的加热环境下有可能分解，影响测定。吡啶是一个具有恶臭的有毒气体，应 用吡啶作为催化剂具有二次污染和对实验人员造成危害。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的旨在于提供一种氯霉素残留量的检测方法， 该检测方法的衍生步骤简单，检测效率高，所用的衍生试剂对环境的敏感度小，所用的催化 剂便宜，对人员和环境的危害小。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种氯霉素残留量的检测方法，包括如下步骤：
[0008] 1)样品预处理:取待测水产品，取肌肉部分3-6g置于离心管中，加入15-25mL乙酸 乙酯，均质成匀浆、离心后将乙酸乙酯层转移到容器中；再向离心管加入5_15mL乙酸乙酯， 均质、离心后，合并乙酸乙酯提取液，30-50°C水浴中蒸发近干;所述水产品为水生动物。
[0009] 2)样品的净化:将步骤1)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于l-2mL甲醇中，依次加 入10-20mL正己烷和20-30mL 4%氯化钠溶液，混合、离心后弃去正己烷相;再加入10-20mL 乙酸乙酯，混合、离心后吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤后，用2-5mL乙酸乙酯 淋洗无水硫酸钠柱，合并乙酸乙酯提取液，30-50°C水浴中蒸发近干；
[0010] 3)样品及标准品的衍生化：
[0011] 样品的衍生化:将步骤2)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于l-2mL乙酸乙酯并转 移到离心管中，再用l_2mL乙酸乙酯淋洗容器，合并乙酸乙酯于所述离心管中，加入100-400 此乙酸酐和100-400yL的三乙胺，用乙酸乙酯定容到4-6mL后混合l-3min，在50-80°C的条件 下反应20-40min;然后在50-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂；最后加入0.3-0.8mL乙酸乙 酯，混合5-20s，得到样品溶液，供气相色谱分析备用；
[0012] 标准品的衍生化:取l-2mL标准品于离心管中，加入100-400yL乙酸酐和100-400yL 的三乙胺，用乙酸乙酯定容到4-6mL后混合l-3min，在50-80°C的条件下反应20-40min;然后 在50-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入0.3-0.8mL乙酸乙酯，混合5-20s，得到标准 品溶液，供气相色谱分析备用；
[0013] 4)气相色谱检测：分别吸取标准品溶液和样品溶液l-5yL，注入气相色谱仪中进行 测定。
[0014] 本发明中，优选的方案为在步骤1)中，样品预处理具体为：取待测水产品，取肌肉 部分5g置于离心管中，加入20mL乙酸乙酯，均质机均质lmin使其成匀浆，4000r/min离心 3min，将乙酸乙酯层转移到容器中；再向离心管加入10mL乙酸乙酯，均质lmin，4000r/min离 心3min，合并乙酸乙酯提取液，于40°C水浴中减压旋转蒸发近干。
[0015] 本发明中，优选的方案为在步骤2)中，样品的净化具体为:将步骤1)中经水浴蒸发 得到的提取物溶解于lmL甲醇中，依次加入15mL正己烷和25mL4 %氯化钠溶液，振荡混合 lmin后转移到离心管中，4000r/min下离心2min，弃去上层正己烧相;再向水相中加入10mL 正己烷，振荡lmin、4000r/min下离心后弃去正己烷相；向所述水相中加入15mL乙酸乙酯，旋 祸混合2min，3000r/min离心3min，吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤;再向水相 中加入5mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/min离心3min后吸取乙酸乙酯层，经无水硫酸钠 柱脱水过滤；用3mL乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱，合并所述乙酸乙酯提取液，40°C水浴中减 压旋转蒸发近干。
[0016] 本发明中，优选的方案为在步骤2)中，还包括C18柱净化，所述C18柱净化的步骤 为:给每个样品准备一根C18柱，依次用5mL甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗C18柱，弃去 淋洗液;将步骤2)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于5mL体积分数为5 %的乙腈水溶液中， 吸取水溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液；用lmL水淋洗容器2遍，并将淋洗液加入C18柱过 柱，弃掉流出液;然后用5mL水淋洗C18柱，让淋洗液完全流出C18柱，用氮气吹干;再用乙腈 淋洗C18柱2次，每次1.5mL，合并乙腈淋洗液于5mL具塞离心管中，在50-55°C的砂浴中，用氮 气吹除乙腈至近干。
[0017] 本发明中，优选的方案为在步骤3)中，所述样品的衍生化具体为:将经步骤2)处理 后得到的提取物溶解于2mL乙酸乙酯并转移到离心管中，再用2mL乙酸乙酯淋洗容器，合并 乙酸乙酯于所述离心管中，加入100-400yL乙酸酐和100-400yL的三乙胺，用乙酸乙酯定容 至lj5mL，旋涡混合2min，然后在70 °C的条件下中反应30min，再置于50-55°C的砂浴中，用氮气 吹干溶剂;最后加入〇. 5mL乙酸乙酯，旋涡混合10s，得到样品溶液，供气相色谱分析备用； [0018] 所述标准品的衍生化具体为:取2mL标准品于离心管中，加入100-400yL乙酸酐和 100-400此的三乙胺，用乙酸乙酯定容到5mL后旋涡混合2min，然后在70°C的条件下反应 3〇 min;再置于50-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入0.5mL乙酸乙酯，旋涡混合10s， 得到标准品溶液，供气相色谱分析备用。
[0019]本发明中，优选的方案为在步骤3)中，所述乙酸酐和三乙胺的添加量均为300yL。 [0020]本发明中，步骤4)中，所述气相色谱的条件为:采用RTX-5ms作为固定相的毛细管 柱，所述毛细管柱的柱长为30m、内径为0.25mm、膜厚度为0.25wii;柱温为程序升温，初始温 度 140-160°C，保持l_2min，以 15°C/min的速率升温至250-270°C，保持 10-llmin，再以30°C/ min的速率升温至270-290 °C，保持3-6min;总运行时间为24min;载气为氦气，纯度彡 99.99% ;采用恒流模式，线速度为31. lcm/s;进样口温度为250-260°C，进样量：1-5此，不分 离进样;检测器为63Ni电子捕获检测器。
[0021] 本发明中，优选的方案为在步骤4)中，所述气相色谱的条件为:采用RTX-5H1S作为 固定相的毛细管柱，所述毛细管柱的柱长为30m、内径为0.25mm、膜厚度为0.25mi;柱温为程 序升温，初始温度150°C，保持lmin，以每15°C/min的速率升温至260°C，保持lOmin，再以30 °(：/1^11的速率升温至280°(：，保持5111111 ;总运行时间为24111111;载气为氦气，纯度彡99.99%; 采用恒流模式，线速度为31.1 cm/s;进样口温度为260°C，进样量：1此，不分离进样;检测器 为63Ni电子捕获检测器。
[0022] 本发明中，所用的主要试剂、仪器和耗材如下：
[0023]甲醇、正己烷、乙腈(色谱纯，瑞典欧森巴克化学公司）；毛细管气相色谱柱RTX-5ms (美国，Restek公司）；乙酸乙酯(色谱纯，天津市光复科技发展有限公司）。
[0024]气相色谱仪（日本，岛津公司）；旋转蒸发仪(RE52CS-1，上海亚荣生化仪器厂）；电 子天平(BS224S，德国赛多利斯公司）；旋涡混合器(XH-C，金坛市白塔新宝仪器厂）。
[0025] 在本发明中，氯霉素标准品来自于德国Dr.Ehrenstorfer标准品公司，CAS:56-75-7,纯度多99% ;检测的样品为鱼、奸和蟹。
[0026] 气相色谱图：取衍生后的氯霉素标准品溶液（lOOyg/L)和样品溶液，分别进样进行 检测，结果见附图1和附图2。从色谱图中可以看出，标准品和样品的色谱保留时间接近，分 别为15.655s和15.627s，峰形尖锐、对称，与邻近峰完全分离。
[0027] 标准曲线：取不同浓度的氯霉素标准品，按照上述制备方法和色谱操作条件进行 分析，以峰面积为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线，结果下表1。结果表明：在0.5-250yg/L范围内，浓度与峰面积呈现良好的线性关系，其线性回归方程为：Y = 8546.1X+ 22355,相关系数为0.9993。根据3倍信噪比（3/?计算氯霉素的检出限〇1)0)为0.3邱/1，满 足水产品检测氯霉素的要求。
[0028]表1氯霉素标准品溶液检测结果
[0030] 精密度和回收率:取不含氯霉素的4组空白样品，每组设5个平行样，向所述4组空 白样品中分别添加氯霉素至样品中氯霉素的浓度水平分别为〇. 2yg/kg、0.4yg/kg、lyg/kg 和l〇yg/kg。按照上述样品溶液的制备方法和色谱操作条件进行分析，计算回收率和相对标 准偏差。结果表明，氯霉素的平均回收率范围为75.0-92.4%，5次平行测定的相对标准偏差 范围为2.6%-5.4%，均满足定量分析要求。
[0031] 表2精密度和回收率测试结果(n = 5)
[0033] 阴性样品测定:取不含氯霉素的样品，按照上述样品溶液的制备方法和色谱操作 条件进行分析，结果显示对样品的测定无干扰(详见附图1、2、3)。
[0034] 由上述分析可知，本发明的对氯霉素残留量的检测方法各项指标均良好。
[0035] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0036] 1、本发明的氯霉素残留量的检测方法，采用乙酸酐为衍生试剂，三乙胺为催化剂， 而传统的氯霉素检测方法一般采用N，0-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯 硅烷(TMSC1)作为衍生剂，吡啶为催化剂。与BSTFA相比，乙酸酐对空气和环境的敏感度小， 衍生后的产物在加热环境下更加稳定，对检测结果的影响小;所需衍生步骤更加简单，提高 了检测的效率;价格便宜，且适用于有水环境;催化剂三乙胺比吡啶更便宜，毒性更小，减少 了对实验人员的危害，减少了对环境的二次污染，有利于环境保护。
[0037] 2、本发明的氯霉素残留量检测方法的效果良好，线性关系符合要求，并且能够达 到国家标准要求的检出限。气相色谱仪所得的色谱图峰型对称，实验重现性好。
【附图说明】
[0038]图1为氯霉素标准品（100yg/L)的气相色谱图；
[0039] 图2为测试样品的气相色谱图；
[0040] 图3为氯霉素阴性样品的气相色谱图。
【具体实施方式】
[0041] 下面，结合附图以及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0042] 实施例1
[0043] -种氯霉素残留量的检测方法，包括如下步骤：
[0044] 1)样品预处理：取待测水产品虾，取肌肉部分5g置于离心管中，加入20mL乙酸乙 酯，均质机均质lmin使其成勾衆，4000r/min离心3min，将乙酸乙酯层转移到细口鸡心瓶中； 再向离心管加入10mL乙酸乙酯，均质lmin，4000r/min离心3min，合并乙酸乙酯提取液，于40 °C水浴中减压旋转蒸发近干；
[0045] 2)样品的净化:将步骤1)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于lmL甲醇中，依次加入 15mL正己烧和25mL4%氯化钠溶液，振荡混合lmin后转移到离心管中，4000r/min下离心 2min，弃去上层正己烧相;再向水相中加入10mL正己烧，振荡lmin、4000r/min下离心后弃去 正己烧相；向所述水相中加入15mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/min离心3min，吸取乙酸 乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤;再向水相中加入5mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/ min离心3min后吸取乙酸乙酯层，经无水硫酸钠柱脱水过滤；用2mL乙酸乙酯淋洗无水硫酸 钠柱，合并乙酸乙酯提取液，40°C水浴中减压旋转蒸发近干；
[0046] 3)样品及标准品的衍生化：
[0047]样品的衍生化:将步骤2)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于2mL乙酸乙酯并转移 到离心管中，再用2mL乙酸乙酯淋洗容器，合并乙酸乙酯于所述离心管中，加入300iiL乙酸酐 和300此的三乙胺，用乙酸乙酯定容到5mL，旋涡混合2min，然后在70°C的条件下中反应 30min，再置于5〇-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入0.5mL乙酸乙酯，旋祸混合10s， 得到样品溶液，供气相色谱分析备用；
[0048] 标准品的衍生化：取2mL标准品于离心管中，加入300yL乙酸酐和300yL的三乙胺， 用乙酸乙酯定容到5mL后旋涡混合2min，然后在70°C的条件下反应30min;再置于50-55°C的 砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入〇. 5mL乙酸乙酯，旋涡混合10s，得到标准品溶液，供气相 色谱分析备用；
[0049] 4)气相色谱检测:分别吸取liiL标准品溶液和样品溶液，注入气相色谱仪中进行测 定，所述气相色谱的条件为:采用RTX-5ms作为固定相的毛细管柱，所述毛细管柱的柱长为 30m、内径为0.25mm、膜厚度为0.25_;柱温为程序升温，初始温度150°C，保持lmin，以15°C/ min的速率升温至260°C，保持lOmin，再以30°C/min的速率升温至280°C，保持5min;总运行 时间为24min;载气为氦气，纯度多99.99 % ;采用恒流模式，线速度为31.1 cm/s;进样口温度 为260°C，不分离进样;检测器为63Ni电子捕获检测器。
[0050] 实施例2
[0051] -种氯霉素残留量的检测方法，包括如下步骤：
[0052] 1)样品预处理：取待测水产品虾，取肌肉部分5g置于离心管中，加入20mL乙酸乙 酯，均质机均质lmin使其成勾衆，4000r/min离心3min，将乙酸乙酯层转移到细口鸡心瓶中； 再向离心管加入10mL乙酸乙酯，均质lmin，4000r/min离心3min，合并乙酸乙酯提取液，于40 °C水浴中减压旋转蒸发近干；
[0053] 2)样品的净化:将步骤1)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于lmL甲醇中，依次加入 15mL正己烧和25mL4%氯化钠溶液，振荡混合lmin后转移到离心管中，4000r/min下离心 2min，弃去上层正己烧相;再向水相中加入10mL正己烧，振荡lmin、4000r/min下离心后弃去 正己烧相；向所述水相中加入15mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/min离心3min，吸取乙酸 乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤;再向水相中加入5mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/ min离心3min后吸取乙酸乙酯层，经无水硫酸钠柱脱水过滤；用3mL乙酸乙酯淋洗无水硫酸 钠柱，合并乙酸乙酯提取液，40°C水浴中减压旋转蒸发近干；
[0054] 3)样品及标准品的衍生化：
[0055]样品的衍生化:将步骤2)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于lmL乙酸乙酯并转移 到离心管中，再用lmL乙酸乙酯淋洗容器，合并乙酸乙酯于所述离心管中，加入100此乙酸酐 和100此的三乙胺，用乙酸乙酯定容到5mL，旋涡混合lmin，然后在50 °C的条件下中反应 20min，再置于50-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入0.3mL乙酸乙酯，旋祸混合5s， 得到样品溶液，供气相色谱分析备用；
[0056] 标准品的衍生化:取lmL标准品于离心管中，加入100yL乙酸酐和100yL的三乙胺， 用乙酸乙酯定容到5mL后旋涡混合lmin，然后在50 °C的条件下反应20min;再置于50-55 °C的 砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入〇.3mL乙酸乙酯，旋涡混合5s，得到标准品溶液，供气相 色谱分析备用；
[0057] 4)气相色谱检测：分别吸取3yL标准品溶液和样品溶液，注入气相色谱仪中进行测 定，所述气相色谱的条件为:采用RTX-5ms作为固定相的毛细管柱，所述毛细管柱的柱长为 30m、内径为0.25mm、膜厚度为0.25wii;柱温为程序升温，初始温度140°C，保持lmin，以15°C/ min的速率升温至250°C，保持lOmin，再以30°C/min的速率升温至270°C，保持5min;总运行 时间为24min;载气为氦气，纯度多99.99 % ;采用恒流模式，线速度为31.1 cm/s;进样口温度 为250°C，不分离进样;检测器为63Ni电子捕获检测器。
[0058] 实施例3
[0059] -种氯霉素残留量的检测方法，包括如下步骤：
[0060] 1)样品预处理：取待测水产品虾，取肌肉部分5g置于离心管中，加入20mL乙酸乙 酯，均质机均质lmin使其成勾衆，4000r/min离心3min，将乙酸乙酯层转移到细口鸡心瓶中； 再向离心管加入10mL乙酸乙酯，均质lmin，4000r/min离心3min，合并乙酸乙酯提取液，于40 °C水浴中中减压旋转蒸发近干；
[0061] 2)样品的净化:将步骤1)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于lmL甲醇中，依次加入 15mL正己烧和25mL4%氯化钠溶液，振荡混合lmin后转移到离心管中，4000r/min下离心 2min，弃去上层正己烧相;再向水相中加入10mL正己烧，振荡lmin、4000r/min下离心后弃去 正己烧相；向所述水相中加入15mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/min离心3min，吸取乙酸 乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤;再向水相中加入5mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/ min离心3min后吸取乙酸乙酯层，经无水硫酸钠柱脱水过滤；用5mL乙酸乙酯淋洗无水硫酸 钠柱，合并乙酸乙酯提取液，40°C水浴中减压旋转蒸发近干;再准备一根C18柱，依次用5mL 甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗Cl 8柱，弃去淋洗液;将上述经水浴蒸发得到的提取物 溶解于5mL体积分数为5%的乙腈水溶液中，吸取水溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液;用lmL 水淋洗容器2遍，并将淋洗液加入C18柱过柱，弃掉流出液;然后用5mL水淋洗C18柱，让淋洗 液完全流出C18柱，用氮气吹干;再用乙腈淋洗C18柱2次，每次1.5mL，合并乙腈淋洗液于5mL 具塞离心管中，在50-55°C的砂浴中，用氮气吹除乙腈至近干；
[0062] 3)样品及标准品的衍生化：
[0063]样品的衍生化:将经步骤2)处理后得到的提取物溶解于2mL乙酸乙酯并转移到离 心管中，再用2mL乙酸乙酯淋洗容器，合并乙酸乙酯于所述离心管中，加入400yL乙酸酐和 400yL的三乙胺，用乙酸乙酯定容到5mL，旋涡混合3min，然后在80°C的条件下中反应40min， 再置于50-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入0.8mL乙酸乙酯，旋涡混合20s，得到样 品溶液，供气相色谱分析备用；
[0064] 标准品的衍生化：取2mL标准品于离心管中，加入400yL乙酸酐和400yL的三乙胺， 用乙酸乙酯定容到5mL后旋祸混合3min，然后在80 °C的条件下反应40min;再置于50-55 °C的 砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入〇.8mL乙酸乙酯，旋涡混合20s，得到标准品溶液，供气相 色谱分析备用；
[0065] 4)气相色谱检测：分别吸取5yL标准品溶液和样品溶液，注入气相色谱仪中进行测 定，所述气相色谱的条件为:采用RTX-5ms作为固定相的毛细管柱，所述毛细管柱的柱长为 30m、内径为0.25mm、膜厚度为0.25_;柱温为程序升温，初始温度160°C，保持2min，以15°C/ min的速率升温至270°C，保持llmin，再以30°C/min的速率升温至290°C，保持3min;总运行 时间为24min;载气为氦气，纯度多99.99 % ;采用恒流模式，线速度为31.1 cm/s;进样口温度 为260°C，不分离进样;检测器为63Ni电子捕获检测器。
[0066]上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种氯霉素残留量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 样品预处理:取待测水产品，取肌肉部分3-6g置于离心管中，加入15-25mL乙酸乙酯， 均质成勾衆、离心后将乙酸乙酯层转移到容器中；再向离心管加入5_15mL乙酸乙酯，均质、 离心后，合并乙酸乙酯提取液，30-50 °C水浴中蒸发近干； 2) 样品的净化:将步骤1)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于l_2mL甲醇中，依次加入 10-20mL正己烷和20-30mL 4%氯化钠溶液，混合、离心后弃去正己烷相;再加入10-20mL乙 酸乙酯，混合、离心后吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤后，用2-5mL乙酸乙酯淋 洗无水硫酸钠柱，合并乙酸乙酯提取液，30-50°C水浴中蒸发近干； 3) 样品及标准品的衍生化： 样品的衍生化:将步骤2)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于l-2mL乙酸乙酯并转移到 离心管中，再用l-2mL乙酸乙酯淋洗容器，合并乙酸乙酯于所述离心管中，加入100-400yL乙 酸酐和100_400yL的三乙胺，用乙酸乙酯定容到4-6mL后混合l-3min，在50-80°C的条件下反 应20-40min;然后在50-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂；最后加入0.3-0.8mL乙酸乙酯，混 合5-20s，得到样品溶液，供气相色谱分析备用； 标准品的衍生化:取I-2mL标准品于离心管中，加入100-400yL乙酸酐和100-400yL的三 乙胺，用乙酸乙酯定容到4-6mL后混合l-3min，在50-80°C的条件下反应20-40min;然后在 50-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入0.3-0.8mL乙酸乙酯，混合5-20s，得到标准品 溶液，供气相色谱分析备用； 4) 气相色谱检测：分别吸取标准品溶液和样品溶液l_5yL，注入气相色谱仪中进行测 定。2. 如权利要求1所述的氯霉素残留量的检测方法，其特征在于，在步骤1)中，样品预处 理具体为：取待测水产品，取肌肉部分的5g置于离心管中，加入20mL乙酸乙酯，均质机均质 Imin使其成勾衆，4000r/min离心3min，将乙酸乙酯层转移到容器中；再向离心管加入IOmL 乙酸乙酯，均质Imin，4000r/min离心3min，合并乙酸乙酯提取液，于40 °C水浴中减压旋转蒸 发近干。3. 如权利要求1所述的氯霉素残留量的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，样品的净 化具体为:将步骤1)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于ImL甲醇中，依次加入15mL正己烷和 25mL4%氯化钠溶液，振荡混合Imin后转移到离心管中，4000r/min下离心2min，弃去上层正 己烧相;再向水相中加入IOmL正己烧，振荡Imin、4000r/min下离心后弃去正己烧相；向所述 水相中加入15mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/min离心3min，吸取乙酸乙酯层，经过无水 硫酸钠柱脱水过滤;再向水相中加入5mL乙酸乙酯，旋祸混合2min，3000r/min离心3min后吸 取乙酸乙酯层，经无水硫酸钠柱脱水过滤；用3mL乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱，合并所述乙 酸乙酯提取液，40°C水浴中减压旋转蒸发近干。4. 如权利要求1所述的氯霉素残留量的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，还包括C18 柱净化，所述C18柱净化的步骤为：给每个样品准备一根C18柱，依次用5mL甲醇、5mL氯仿、 5mL甲醇和5mL水淋洗C18柱，弃去淋洗液;将步骤2)中经水浴蒸发得到的提取物溶解于5mL 体积分数为5%的乙腈水溶液中，吸取水溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液;用ImL水淋洗容 器2遍，并将淋洗液加入C18柱过柱，弃掉流出液;然后用5mL水淋洗C18柱，让淋洗液完全流 出C18柱，用氮气吹干;再用乙腈淋洗C18柱2次，每次1.5mL，合并乙腈淋洗液于5mL具塞离心 管中，在50-55°C的砂浴中，用氮气吹除乙腈至近干。5. 如权利要求1或4所述的氯霉素残留量的检测方法，其特征在于，在步骤3)中，所述样 品的衍生化具体为:将经步骤2)处理后得到的提取物溶解于2mL乙酸乙酯并转移到离心管 中，再用2mL乙酸乙酯淋洗容器，合并乙酸乙酯于所述离心管中，加入100-400yL乙酸酐和 100-400yL的三乙胺，用乙酸乙酯定容到5mL后旋涡混合2min，然后在70°C的条件下中反应 30min，再置于50-55°C的砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入0.5mL乙酸乙酯，旋祸混合IOs， 得到样品溶液，供气相色谱分析备用； 所述标准品的衍生化具体为：取2mL标准品于离心管中，加入100-400yL乙酸酐和100-400yL的三乙胺，用乙酸乙酯定容到5mL后旋涡混合2min，然后在70°C的条件下反应30min; 再置于50-55Γ的砂浴中，用氮气吹干溶剂;最后加入0.5mL乙酸乙酯，旋涡混合10s，得到标 准品溶液，供气相色谱分析备用。6. 如权利要求5所述的氯霉素残留量的检测方法，其特征在于，在步骤3)中，所述乙酸 酐和三乙胺的添加量均为300yL。7. 如权利要求1所述的氯霉素残留量的检测方法，其特征在于，在步骤4)中，所述气相 色谱的条件为：采用RTX-5ms作为固定相的毛细管柱，所述毛细管柱的柱长为30m、内径为 0.25mm、膜厚度为0.25μπι;柱温为程序升温，初始温度140-160°C，保持l_2min，以15°C/min 的速率升温至250-270°(：，保持10-11111丨11，再以30°(：/1^11的速率升温至270-290°(：，保持3-6min;总运行时间为24min;载气为氦气，纯度彡99.99% ;采用恒流模式，线速度为31. Icm/ s;进样口温度为250-260°C，进样量:l_5yL，不分离进样;检测器为63Ni电子捕获检测器。8. 如权利要求7所述的氯霉素残留量的检测方法，其特征在于，在步骤4)中，所述气相 色谱的条件为：采用RTX-5ms作为固定相的毛细管柱，所述毛细管柱的柱长为30m、内径为 0.25mm、膜厚度为0.25μπι;柱温为程序升温，初始温度150°C，保持lmin，以每15°C/min的速 率升温至260 °C，保持IOmin，再以30 °C/min的速率升温至280 °C，保持5min;总运行时间为 24min;载气为氦气，纯度多99.99% ;采用恒流模式，线速度为31. lcm/s;进样口温度为260 °C，进样量:IyL，不分离进样;检测器为63Ni电子捕获检测器。
【文档编号】G01N30/06GK105891359SQ201610207292
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】罗杰鸿, 覃东安, 吴济舟, 黄云生
【申请人】广州京诚检测技术有限公司