专利名称：两种用于检测氯霉素的免疫原和包被原的制备方法
技术领域：
本发明涉及两种用于检测氯霉素的免疫原和包被原的制备方法。具体的说，本发 明涉及两种用于免疫学快速检测氯霉素残留的免疫原和包被原制备方法。
背景技术：
氯霉素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，对立克次体、衣原 体也有抑制作用。因其效高价廉，曾在一段时期内作为细菌性疾病的治疗药物应用于人和 动物临床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。随着科学的发展，氯霉素被证明对 机体有很大的毒副作用，如骨髓造血机能抑制毒性，遗传毒性，生殖毒性，神经毒性，灰婴综 合症。此外长期微量摄入氯霉素，不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，而且会引起机 体正常菌群失调，使人们易感染各种疾病。鉴于健康原因，联合国粮农组织、世界卫生组织 和许多国家规定限制或禁止氯霉素用于食品动物，中国农业部已将氯霉素从2000年版《中 国兽药典》中删除并列为禁药。而欧盟的进口食品卫生标准是在进口动物产品中不得检 出氯霉素，其“不得检出”的含义是氯霉素含量在ι μ g/kg以下，即含量在十亿分之一以下。 2002年欧盟对我国出口到欧盟的动物源性产品实行禁运，就意味着我国将在欧盟市场丢掉 13万吨的市场份额和造成6亿多美元的经济损失。并且由于欧盟的禁令，美国和日本等国 已高度关注我国出口水产品的质量。因此，为了严格监控氯霉素的使用，抑制上述问题的发生发展，建立高效、灵敏、经 济的氯霉素残留分析方法是很有必要的。同现有技术比较，将本方法制备的高偶联比氯霉 素免疫原和包被原应用于畜产品中氯霉素残留的快速检测，结果会更加准确、快速。具有重 要的现实意义和极高的商业开发价值。
发明内容
本发明旨在提供两种用于检测氯霉素的免疫原和包被原的制备方法，用于建立免 疫学快速检测氯霉素残留的简便、准确、快速的方法提供基础。两种用于检测氯霉素的免疫原和包被原的制备方法，其特征在于采用以下步骤本发明提供了两种用于检测氯霉素的免疫原和包被原的制备方法(1)活性酯法合成氯霉素免疫原和包被原用活性酯法将含有羧基的半抗原琥珀 氯霉素(Hap)与载体蛋白质(BSA或OVA)进行偶联。(2)重氮化法合成氯霉素免疫原和包被原用重氮化法将含有芳香氨基的半抗原 (Hap)与载体蛋白质进行偶联。(3)半抗原-偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA)的鉴定偶联物溶液中偶联物的绝对含 量通常以蛋白质的质量浓度来表示(即每HiL偶联物溶液中含蛋白质多少mg)，所以可通过 测定偶联物溶液中蛋白质的相对含量(mgmL-1)来测定偶联物浓度。采用紫外分光光度法 测定交联比的原理是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例的关系，分别测定被偶联的两种 分子的浓度。在大分子和小分子的偶联物中，2种分子均有各自不同的最大紫外吸收峰，且在相应的最大吸收峰波长处的吸光度值(A)与其浓度成比例；但在偶联物的紫外扫描光谱 中，则表现为各自的光谱图呈叠加性质。该法操作简单且无样本损耗。(4)红外光谱分析将合成好的半抗原-偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA))、半抗原及 载体蛋白进行红外光谱检测。
图1为SDS-PAGE鉴定偶联产物 图2为重氮化法免疫原(Hap-OVA) 图3为活性酯法免疫原(Hap-BSA) 图4为活性酯法免疫原(Hap-BSA) 图5为重氮化法包被原(Hap-OVA) 图6为琥珀氯霉素的红外图谱 图7为琥珀氯霉素-BSA的红外图谱 图8为琥珀氯霉素-OVA的红外图谱
具体实施例方式实施例一本发明提供了两种用于检测氯霉素的免疫原和包被原的制备方法(1)活性酯法合成氯霉素免疫原和包被原用活性酯法将含有羧基的半抗原琥珀 氯霉素(Hap)与载体蛋白质(用Pro表示，本方法采用BSA或OVA)进行偶联。称取Hap 0. 40mmol、NHSO. 40mmol、DCC 0. 44mmol 溶解于 2mL 的 N，N- 二甲基甲酰胺，在 22 °C 搅拌 5h 后，离心，得“活性酯上清液”。将ftOlOOmg溶解于IOmL 0. 05mol · L-1，pH 8的磷酸缓冲 液(PBS)中，在4°C条件下，将上面得到的“活性酯上清液”缓慢地滴加入蛋白溶液中，同时 剧烈搅拌。反应得到的混合物在4°C缓慢搅拌Mh，以使偶联充分完成。反应后的溶液用 0. Olmol · Γ1, pH7. 4的磷酸缓冲盐溶液充分透析，每天换液2次。对透析外液进行紫外可 见光吸收波长扫描，直到不再出现Hap特征吸收峰为止。将透析后的Hap-Pro偶联物溶液 进行真空冷冻干燥，以Hap-BSA作为动物实验的免疫原，Hap-OVA作为免疫检测的包被原。实施例二(1)重氮化法合成氯霉素免疫原和包被原用重氮化法将含有芳香氨基的半抗原 (Hap)与载体蛋白质进行偶联。称取0. 20mmol的氯霉素半抗原，溶于700 μ L的无水乙醇中， 待半抗原完全溶解后，用lmol -L"1的盐酸调pH至1。加入0. 45mmol的锌粉，80°C还原反应 40min，离心得黄色清亮透明的上清液，冷却，即为含有芳香氨基的半抗原。用lmol -L L—1的 盐酸将上清液PH调至1，4°C条件下搅拌，向获得的上清液中缓慢滴加0.7mL的0. lmol -L"1 的NaNO2溶液，继续搅拌30min，直至反应使淀粉碘化钾试纸变灰蓝。再加入0. 5mg尿素，分 解过量的HNO2,4°C条件下搅拌30min，得到Hap的重氮盐用Imol · L—1氢氧化钠将pH调至 8，离心取上清液，放入4°C备用。将0. 002讓ol的Pro溶解于2mL 0. 02mol ·Ι^ρΗ 8的PBS 中。4°C避光下搅拌，将重氮盐缓慢滴加入Pro溶液中，为保持加入过程中pH的稳定，同时 滴加Imol · L-1氢氧化钠，继续搅拌过夜。反应后的溶液用0. Olmol · L-1，ρΗ7· 4的PBS充 分透析，方法同实施例一中(1)。(2)半抗原-偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA)的鉴定偶联物溶液中偶联物的绝对含 量通常以蛋白质的质量浓度来表示(即每HiL偶联物溶液中含蛋白质多少mg)，所以可通过测定偶联物溶液中蛋白质的相对含量(mgmL-1)来测定偶联物浓度。采用紫外分光光度法 测定交联比的原理是，利用物质对光的吸收与其浓度呈比例的关系，分别测定被偶联的两 种分子的浓度。在大分子和小分子的偶联物中，2种分子均有各自不同的最大紫外吸收峰， 且在相应的最大吸收峰波长处的吸光度值(A)与其浓度成比例；但在偶联物的紫外扫描光 谱中，则表现为各自的光谱图呈叠加性质。该法操作简单且无样本损耗。紫外可见光吸收 波长扫描将半抗原(Hap)、载体蛋白质(BSA和OVA)、半抗原-蛋白质偶联物(Hap-BSA和 Hap-OVA)分别用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至合适浓度，在200 400nm波长处进行紫外可 见光吸收波长扫描，观察三者紫外可见光吸收光谱的关系，计算半抗原与载体蛋白质的结 t 匕。(3)红外光谱分析将合成好的半抗原-偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA))、半抗原及 载体蛋白进行红外光谱检测。采用活性酯法和重氮化法，将半抗原氯霉素与小牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋 白(OVA)偶联，用紫外光谱、红外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定偶联结果并计算结合 比。紫外扫描结果表明通过活性酯法和重氮化法研制的半抗原与BSA，OVA偶联物的摩尔消 光系数分别为1.64X105,49402 ；3. 73X 105、46601，显著大于半抗原和载体蛋白。活性酯 法制备的半抗原与BSA，OVA的偶联比分别为12，2 ；重氮化法制备的半抗原与BSA，OVA的偶 联比分别为30，1。红外光谱分析确证了偶联成功。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，偶联物 纯度较高。
权利要求
1.两种用于检测氯霉素的免疫原和包被原的制备方法，其特征在于采用以下步骤(1)活性酯法合成氯霉素免疫原和包被原用活性酯法将含有羧基的半抗原琥珀氯霉 素(Hap)与载体蛋白质进行偶联。(2)重氮化法合成氯霉素免疫原和包被原用重氮化法将含有芳香氨基的半抗原 (Hap)与载体蛋白质进行偶联。(3)采用紫外分光光度法测定交联比。(4)红外光谱分析将合成好的半抗原一偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA))、半抗原及载体 蛋白进行红外光谱检测、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定偶联结果并计算结合比。
2.根据权利要求1所述氯霉素免疫原和包被原的合成方法，其特征在于步骤(1)中采 用摩尔比1 1 1的Hap、NHS、DCC溶解于N，N-二甲基甲酰胺中。在22°C搅拌5h。
3.根据权利要求1所述氯霉素免疫原和包被原的合成方法，其特征在于步骤O)中 0. 20mmol琥珀氯霉素溶于700 μ L的无水乙醇中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)(2)所述蛋白质是指常规的可作为 免疫载体使用的可溶性蛋白质(牛血清白蛋白和卵清白蛋白)。
全文摘要
两种方法制备用于氯霉素快速免疫分析的免疫原和包被原，为氯霉素免疫学快速检测方法的建立提供基础。方法分别采用活性酯法和重氮化法，将半抗原氯霉素与载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联，用紫外光谱、红外光谱鉴定偶联结果并计算结合比。结果上述两种方法与BSA，OVA的偶联物摩尔消光系数分别为164523、49402；372723、44601，显著大于半抗原和载体蛋白。红外光谱分析进一步证实偶联成功。结论全抗原偶联成功，活性酯法和重氮化法使氯霉素半抗原与BSA，OVA的偶联比值分别为12，2；30，1。
文档编号G01N33/68GK102043059SQ20091007095
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者刘楠, 孙思明, 宁保安, 王红勇, 高志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所