专利名称：一种检测氯霉素的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测分析技术领域中的一种检测氯霉素的试剂盒。
背景技术：
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是应用广泛的抗菌素，在畜禽疾病控制和治疗中起到了重要作用。但由于氯霉素存在严重的副作用，能抑制骨髓细胞内线粒体的蛋白质合成，造成骨髓细胞和肝细胞的毒性，从而引起人的再生性障碍性贫血，粒细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰婴综合症等疾病，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。2002年12月中国农业部公告第235号文规定，氯霉素及其盐、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于氯霉素价格便宜且为广谱抗生素，违法使用仍很普遍。因此加强对动物性食品中氯霉素的残留检测是非常必要的。
目前，常用于氯霉素残留检测的方法主要有微生物法和仪器分析法。微生物检测法虽然经济、操作简便，但在样本中有其他微生物抑制剂存在时，其灵敏度和特异性受到限制；高效液相色谱分析法、气谱、气质联机法等单纯的仪器分析方法，虽然灵敏度高，但样本前处理及测定操作烦琐，费用高，不适宜于大量样本筛查，可以作为残留的确证分析。免疫化学法，尤其是酶联免疫吸附测定法(ELISA)其灵敏度比微生物法高，样品前处理又比仪器分析法简单，，特别适于现场监控和大量样本筛查。
发明创造内容本发明的目的是提供一种检测氯霉素的试剂盒。
本发明所提供的检测氯霉素的试剂盒，包括酶标氯霉素特异性抗体及包被的载体蛋白与氯霉素偶联物。
其中，所述酶标氯霉素特异性抗体可为酶标氯霉素单克隆抗体或酶标氯霉素多克隆抗体，所述氯霉素单克隆抗体或多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源和豚鼠源抗体，所述氯霉素单克隆抗体优选为氯霉素鼠单克隆抗体，所述氯霉素多克隆抗体优选为氯霉素兔多克隆抗体。以上抗体均可用氯霉素与载体蛋白的偶联物作为免疫原按常规方法制备。所述氯霉素与载体蛋白的偶联物可通过将氯霉素和载体蛋白用混合酸酐法或活化酯法进行偶联得到。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白。所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。
可作为固定氯霉素与载体蛋白的偶联物的载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。
为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括氯霉素标准溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液和浓缩复溶液。
所述浓缩洗涤液为含有0.8-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液；所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述浓缩复溶液为含有0.8-1.2％吐温的柠檬酸盐缓冲液。
本发明的检测原理为将氯霉素与载体蛋白的偶联物作为包被原吸附于固相载体上，加入样品和酶标氯霉素特异性抗体，待测样品中残留的氯霉素和固相载体上包被的氯霉素与载体蛋白偶联物竞争特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中氯霉素残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出氯霉素的含量。
本发明的检测氯霉素的试剂盒主要采用直接竞争ELISA方法定性或定量检测动物组织(猪、鸡、牛、羊的肌肉组织及肝脏、鱼虾等)、尿样、血清血浆、饲料、蜂蜜、牛奶等样品中氯霉素的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；该试剂盒采用高特异性的氯霉素单克隆抗体或多克隆抗体，主要试剂均以工作液形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性食品氯霉素残留检测中发挥重要作用。
图1为检测氯霉素的试剂盒的结构示意图具体实施方式
实施例1、抗原及抗体的制备(1)抗原的合成将氯霉素和牛血清白蛋白(BSA)采用活化酯法进行偶联得到免疫原。
将氯霉素和卵清蛋白(OVA)采用活化酯法进行偶联得到包被原。
(2)氯霉素鼠单克隆抗体制备动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以氯霉素与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为80-100μg/只，首免时将抗原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5-10∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1-5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5-106个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
(3)氯霉素兔多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以氯霉素与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1mg/kg·b.w.，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10d后采血，测定血清效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
实施例2、检测氯霉素的试剂盒(1)检测氯霉素的试剂盒的结构试剂盒的结构如图1所示，主要由盒体1、铝膜真空包装96孔/40孔酶标板2、6瓶氯霉素系列浓度标准品3、终止液4、酶标记物工作液5、底物显色液A液6、底物显色液B液7、浓缩洗涤液8、浓缩复溶液9和泡沫托架10，泡沫托架10上制有凹孔，上述试剂瓶3-9安放在泡沫托架的凹孔内，泡沫托架10及酶标板2安放在盒体内。其中酶标板2由塑料支架和可拆分的塑料条组成。
(2)所用试剂的配制a.氯霉素标准溶液∶氯霉素系列标准溶液6瓶，0、0.01、0.25、2.5、5.0、10.0ng/ml，1-3ml/瓶。
b.包被缓冲液pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。
c.封闭液3-10％小牛血清。
d.浓缩洗涤液含0.8-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.4)，为正常使用浓度的15-25倍，30-50ml/瓶，1瓶。
e.酶标记物工作液酶标氯霉素抗体工作液，使用蛋白浓度为0.5-5.0μg/L的酶标氯霉素抗体，5-8ml/瓶，1瓶。
f.底物显色液A液过氧化氢或过氧化脲，5-8ml/瓶，1瓶。
g.底物显色液B液邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)，5-8ml/瓶，1瓶。
h.终止液1-2mol/L硫酸或盐酸，5-8ml/瓶，1瓶。
i.浓缩复溶液含0.8-1.2％吐温的柠檬酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5-10倍，30-50ml/瓶，1瓶。
(3)酶标板的制备用氯霉素与卵清蛋白偶联物包被的酶标板，其制备方法如下用包被缓冲液将氯霉素与卵清蛋白偶联物稀释成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例3、样品的前处理(1)动物组织 称取5g匀浆后的样品，加入20ml乙酸乙酯，涡动，3000g离心5分钟，取有机相于鸡心瓶中。再向样品中加入20ml乙酸乙酯重复提取一次，3000g离心，取上清，将两次上清合并于鸡心瓶中。50℃减压蒸干，加入4.5ml蒸馏水溶解，加正己烷，混匀，静置，弃上层有机相。加入0.5ml浓缩复溶液，得到待测样品溶液，取50μl进行分析。
(2)尿样 取1ml尿液，加入0.5ml 100mM醋酸钠缓冲液，pH4.8，加入8μlβ-葡萄糖醛酸酶，37℃孵育3h，恢复至室温后加入2ml乙酸乙酯混合，3000g离心10分钟，取出1ml上层液体用氮气吹干，用浓缩复溶液稀释样品，得到待测样品溶液，取50μl进行分析。
(3)血清血浆 取1ml血清血浆，加入2ml乙酸乙酯，混合振荡，3000g离心10分钟，取1ml上层液用氮气吹干，用复溶液稀释样品，得到待测样品溶液，取50μl进行分析。
(4)饲料 取5g饲料加入20ml乙酸乙酯，混合，振荡，3000g离心10分钟。取1ml上层液用氮气吹干。用1ml异辛烷+氯仿(40+60)溶解残留物。用浓缩复溶液稀释样品，3000g离心10分钟，得到待测样品溶液，取50μl进行分析。
(5)蜂蜜 取1g蜂蜜，加入4ml蒸馏水，再加4ml乙酸乙酯，混合，振荡，3000g离心10分钟。取2ml上层液用氮气吹干，用浓缩复溶液稀释样品，得到待测样品溶液，取50μl进行分析。
(6)牛奶 将奶样6000g离心10分钟，吸除上层的脂肪，取0.5ml去除脂肪奶用复溶液稀释，得到待测样品溶液，取50μl进行分析。
实施例4、检测鸡肝样品中残留的氯霉素(1)样品前处理称取5g匀浆后的样品，加入20ml乙酸乙酯，涡动，静置20分钟，3000g离心5分钟，取有机相于鸡心瓶中。再向样品中加入20ml乙酸乙酯重复提取一次，3000g离心10分钟，取上清，将两次上清合并于鸡心瓶中。50℃减压蒸干，加入4.5ml蒸馏水溶解，加正己烷5ml，混匀，静置，弃上层有机相。加入0.5ml浓缩复溶液，得到待测样品溶液，取50μl进行分析。
(2)样品溶液的检测向氯霉素与卵清蛋白偶联物包被的96孔酶标板微孔中加系列标准溶液或样品溶液(各2孔)50μl，然后加入酶标氯霉素鼠单克隆抗体工作液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应1h。倒出孔中液体，每孔加入250μl浓缩洗涤液(含1.2％吐温的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.4))，1分钟后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。每孔加入底物显色液A液(过氧化氢)50μl，再加B液(邻苯二胺)50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色5-10min。每孔加入终止液(1mol/L硫酸)50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。
本实施例所用的试剂均按照实施例2中的试剂配制方法进行配制。
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100，即百分吸光度值。
公式中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准溶液的平均吸光度值。以氯霉素浓度(μg/L)的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，相对应每一个样品的浓度(μg/L)可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。整个检测过程只需1.5小时就可以完成。
实施例5、试剂盒灵敏度、特异性、精密度、准确度和保存期试验(1)试剂盒灵敏度试验50％抑制浓度(既IC50，指0标准溶液的吸光度值的50％处所对应的药物浓度)常作为评价竞争ELISA试剂盒灵敏度的指标。分别测定20次标准曲线的50％抑制浓度，确定该试剂盒标准曲线IC50应在1.5-4.0μg/L的范围之内。分别测定20份鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、鱼虾、血清血浆、尿样、蜂蜜、牛奶和饲料的空白样品及20份氯霉素0标准品。结果判定该试剂盒对氯霉素0标准品最低检测限为0.05μg/L。对肌肉、肝脏、鱼虾、血清血浆、尿样、蜂蜜和饲料的最低检测限均小于0.1μg/L；对牛奶样品的最低检测限为0.15μg/L。
(2)试剂盒特异性试验选择与氯霉素类似结构和类似功能的4种氯霉素类药物测定交叉反应率。通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应率愈小，表明试剂盒的特异性愈高。
表1.试剂盒的特异性
试剂盒特异性试验结果如表1所示，结果表明该试剂盒对氯霉素和琥珀氯霉素的交叉反应率高(注琥珀氯霉素进入体内经酶消解成为氯霉素发挥药理作用，所以在动物源食品中均以氯霉素形式存在)，可保证对动物源食品及饲料中氯霉素残留检测结果的可靠性。
(3)试剂盒精密度试验标准可重复性从三批酶联板中，每板各抽出20个微孔，测定同一浓度标准溶液的吸光度值(OD值)，重复测定10次，计算变异系数。变异系数范围在3.5-9.7％。
样品可重复性取不同浓度的氯霉素标样，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次。分别计算板内，批内，批间变异系数。动物肌肉、动物肝脏、鱼虾、血清血浆、尿样、牛奶和蜂蜜的变异系数均低于20.0％，饲料的变异系数均低于15.0％。
(4)试剂盒的准确度取4个浓度的氯霉素标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度设4个平行，分别计算回收率。动物肝脏、动物肌肉、鱼虾、血清血浆、尿样、蜂蜜、牛奶和饲料的添加回收率均在60.0-120.0％范围内。
(5)试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、氯霉素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。
权利要求
1.一种检测氯霉素的试剂盒，包括酶标氯霉素特异性抗体及包被的氯霉素与载体蛋白的偶联物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括氯霉素标准溶液、显色剂、浓缩洗涤液、终止液和浓缩复溶液。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述酶标氯霉素特异性抗体为酶标氯霉素单克隆抗体或酶标氯霉素多克隆抗体。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、血兰蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液为含有0.8％-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩复溶液为含0.8％-1.2％吐温的柠檬酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种检测氯霉素的试剂盒。本发明所提供的检测氯霉素的试剂盒，包括酶标氯霉素特异性抗体及包被的氯霉素与载体蛋白的偶联物。本发明的检测氯霉素的试剂盒能同时快速检测大批样品；主要试剂均以工作液形式提供，使用方便；具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性食品氯霉素残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/544GK1690708SQ20041003725
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月30日 优先权日2004年4月30日
发明者沈建忠, 丁双阳, 魏书林, 史为民, 张素霞, 江海洋, 刘金凤 申请人:中国农业大学