专利名称：化妆品中氯霉素的快速检测方法
技术领域：
本发明属于化妆品检测领域，涉及化妆品中氯霉素的快速检测方法。
背景技术：
氯霉素是一种高效广谱抗生素，能抑制细菌蛋白质的形成，同时对人类具有毒害作用，它对骨髓造血机能有抑制作用，可引起粒细胞缺乏病、再生障碍性贫血和溶血性贫血，对人产生致死效应。氯霉素化学性质相对稳定，在动物体内易于残留，从而对动物和人造成直接危害，更严重的是一定浓度的药物残留会诱发致病菌的耐药性。此外，长期微量摄入氯霉素不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，而且会引起机体正常菌群失调，使人们易感染各种疾病，如再生障碍性贫血症和原婴综合症可引起粒细胞及血小板减少，新生儿、 早产儿灰色综合症等。我国《化妆品卫生规范》、欧盟化妆品规程(Coucil DirectiVe76/768/EEC)规定抗生素类物质禁止在化妆品中使用。对化妆品中氯霉素的检测，国家虽然加大了监督力度，但现行的质量标准严重落后于监管需要，需要研发与实际监管需求相结合的快速筛查检测方法以弥补质量标准的空白和滞后，满足基层打假和监管的需求。目前，在氯霉素检测中应用的主要有微生物法、液相色谱法、气相色谱法、色谱-质谱联用法、放射性免疫分析法、酶联免疫分析法、免疫胶体金标记技术等。微生物法简单、费用低，可用于大量样品的筛选，但灵敏度低、特异性差，一般抗生素类药物都有此类反应；酶联免疫法是目前使用较普遍的方法，该法操作简便、灵敏度高、 特异性强、样品预处理简单，可以批量检测，分析成本低，是目前最理想的残留筛选分析方法之一。酶联免疫法的缺点在于影响因素较多，易出现假阳性结果，抗体批次不同，测定结果也会出现差异等。气相色谱法的特点是分离效能高，选择性强，灵敏度高，检出限低，常用于抗生素药物残留的检测，但一般需要进行衍生化。高效液相色谱法是一种灵敏度较高、可靠性较强的一种方法，此法重复性好、假阳性少，可以进行定量鉴定，但检出限较高。目前， 免疫胶体金技术已经发展为一项重要的免疫标记技术，其是将胶体金作为示踪标志物应用于抗原一抗体反应的一种新型免疫标记技术，免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向，是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。氯霉素胶体金试纸条目前有报道，一般直接将待测样品加于试纸条检测，但样品前处理方式较为复杂，需要配备50ml的离心管，样品提取液需要用离心机4000rpm离心，离心后上清液还需要电吹风或者在65°C下氮气吹干。实验所需50ml离心管、离心机、电吹风或氮气等不利于装配成小巧便携的试剂盒用于现场快速检测，且传统胶体金方法整个检测过程需要30分钟左右，而本发明因前处理方法简单快捷可装配成一个小巧便携的试剂盒用于现场快速检测
发明内容
本发明的目的在于提供化妆品中氯霉素的快速检测方法。本发明所采取的技术方案是
化妆品中氯霉素的快速检测方法，包括如下步骤
1)将待检样品加入含有提取液的提取管中，振摇，静置分层；
2)取提取管的底层溶液，加入含有缓冲液的样品检测管中，混勻；
3)吸取样品检测管中的溶液，滴加于氯霉素胶体金试纸条的加样孔中；
4)加样后开始计时，3 IOmin后即可根据胶体金试纸条的检测线(T)和控制线(C) 显色深浅对比，判断待检样品为阳性或者阴性。优选的，步骤1)提取液含有乙醇，正己烷。优选的，步骤2)底层溶液与缓冲液的体积比为1 :4 12。优选的，缓冲液为0.01M PBS。优选的，待检样品的质量、乙醇的体积和正己烷的体积比为1 :4 8 :8 16。优选的，乙醇的体积浓度为70%。优选的，氯霉素胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤
1)制备胶体金标记抗氯霉素单克隆抗体，将其包被在胶体金结合垫上；
2)制备氯霉素与BSA的偶联物，将其及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，干燥；
3)氯霉素胶体金试纸条组装氯霉素胶体金试纸条由PVC模板和PVC背板组成，在PVC 背板上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。本发明的有益效果是
本发明使用乙醇可将氯霉素从化妆品中充分提取出，同时加入正己烷除去化妆品基质中的脂溶性物质，沉淀蛋白，增加膜的流动性，提取效率高，检测灵敏度提高，排除了干扰因
ο本发明操作步骤简单，所需样品量少，仅需提取、稀释两步即可完成样品前处理， 而且样品提取液和稀释液均已预先置于提取管中，现场可直接将化妆品加入提取管，5 10分钟即可完成样品的快速检测。本发明的氯霉素快速检测方法，专属性强、灵敏度高，准确度高，不需要专门设备， 避免了使用毒性较大或强腐蚀性的试剂，适合于现场操作，操作人员没有专业知识也可快速掌握，非常适合监督执法部门日常监督中使用，能够满足基层的监督检验需求。
图1是氯霉素胶体金试纸条操作示意图； 图2是氯霉素胶体金试纸条结果判定图3是阴性样品与氯霉素标准品检测结果对比图； 图4是阴性样品和阳性样品检测结果对比图。
具体实施例方式为便于对本发明进一步理解，现结合具体实施例对本发明进行详细描述。氯霉素胶体金试纸条的制备1.制备胶体金标记抗氯霉素单克隆抗体
胶体金颗粒的大小平均为30nm，在IOOml去离子水中加入1%柠檬酸三钠1ml，煮沸后迅速加入1%氯金酸1ml，继续煮沸lOmin，冷却后，得胶体金溶液，4°C下保存备用。取已制备好的胶体金溶液1001111，用0.111101/1碳酸钾溶液调？!1到8.0。边搅拌边加入抗氯霉素单克隆抗体1. 5mg,搅拌20min，再逐滴加入^iil 25mg/ml聚乙二醇 20000 (PEG20000)，搅拌 15min。20000r/min 离心 15min，弃上清液，加入 10mlpH7. 4 PBS 缓冲液(含0. 4mg/mlPEG)清洗2次。将沉淀用5ml含2%BSA的PBS缓冲液(ρΗ7· 4)溶解，用 0. 2 μ m无菌过滤器过滤后，得胶体金标记抗氯霉素单克隆抗体，4°C保存备用。2.制备氯霉素与BSA的偶联物
先将20mg氯霉素琥珀酸盐、15mgEDC及30mgBSA混合溶于ImlTris缓冲液中，O 4°C 下避光搅拌lh，再加入5mgEDC，在0°C下搅拌反应12h，静置过夜后，用Tris缓冲液透析3d， 得氯霉素与BSA的偶联物。3.包被抗体及偶联物
用BioJetXYBOOO型点膜仪将氯霉素与BSA的偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜 (NC膜)上，分别作为检测线(T)和控制线(C)，在37°C烘箱干燥他。以同样方法，将制备好的胶体金标记抗氯霉素单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。4.氯霉素胶体金试纸条组装
氯霉素胶体金试纸条由一个PVC背板和一个PVC模板组成。在PVC背板上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，各部分间有1 2mm的重叠。硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线、控制线。用带MARK胶带绕背板覆盖在样品垫、 胶体金结合垫及吸水垫上。用切割机将贴好的板切割成3mm宽的条。PVC模板包括加样孔 (S)、检测区、控制区，其盖于PVC背板上，加样孔(S)对应于样品垫，检测区能显示硝酸纤维素膜的检测线(T)，控制区能显示控制线(C)。将制成的试纸条放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。化妆品中氯霉素的快速检测方法，包括如下步骤
1)将待检样品加入含有提取液的提取管中，振摇，静置分层；
2)取提取管的底层溶液，加入含有缓冲液的样品检测管中，混勻；
3)吸取样品检测管中的溶液，滴加于氯霉素胶体金试纸条的加样孔中，如图1所示；
4)加样后开始计时，3 IOmin后即可根据胶体金试纸条的检测线(T)和控制线(C) 显色深浅对比，判断待检样品为阳性或者阴性。优选的，步骤1)提取液含有乙醇，正己烷。优选的，步骤2)底层溶液与缓冲液的体积比为1 :4 12。优选的，乙醇的体积浓度为70%。优选的，缓冲液为O. OlM PBS0优选的，待检样品的质量、乙醇的体积和正己烷的体积比为1 :4 8 :8 16。上述化妆品中氯霉素的快速检测方法的结果分析
1)阴性(-):τ线(测试线，靠近加样孔)比C线(对照线)深或一样深，表示样品中氯霉素浓度低于检出限，或不含氯霉素；
2)阳性(+) :Τ线比C线浅，或T线无显色，则表示样品中氯霉素浓度高于检出限；T线
5比C线越浅表示样品中氯霉素浓度越高；
3)无效未出现质控C线，表明操作过程不正确或检测卡已失效。可参照图2进行结果判定。实施例1
提取管中的提取液为70% (体积)乙醇:3ml，正己烷6ml ； 样品检测管的缓冲液为0. OlM PBS缓冲液細1 ； 化妆品中氯霉素的快速检测方法，包括如下步骤
1)取0.5g待检化妆品，加入提取管中，充分振摇30秒，静置aiiin使分层，分层后的底层溶液为提取溶液；
2)取提取溶液0.5ml，加入样品检测管中，混合均勻，得待检样品溶液；
3)用滴管吸取待检样品溶液，垂直滴加3滴于上述氯霉素胶体金试纸条的加样孔(S)
中；
4)加样后开始计时，3 IOmin后即可根据胶体金试纸条的检测线(T)和控制线(C) 显色深浅对比，判断待检样品为阳性或者阴性。实施例2
提取管中的提取液为70% (体积)乙醇anl，正己烷細1 ； 样品检测管的缓冲液为0. OlM PBS缓冲液2ml ； 化妆品中氯霉素的快速检测方法，步骤同实施例1。实施例3
提取管中的提取液为70% (体积)乙醇細1，正己烷8ml ； 样品检测管的缓冲液为0. OlM PBS缓冲液6ml ； 化妆品中氯霉素的快速检测方法，步骤同实施例1。用实施例1的方法检测两种浓度的样品1)阴性样品无氯霉素的化妆品；2)氯霉素标准品氯霉素浓度为8ng/ml的化妆品。检测结果如图3所示，左边的氯霉素胶体金试纸条检测的是阴性样品，右边的氯霉素胶体金试纸条检测的是氯霉素标准品，如图可知， 左边结果显示为阴性，右边显示为阳性，结果一致，可见本发明的检测方法能检测到8ng/ml 的氯霉素。用实施例1的方法检测两种浓度的样品1)阴性样品无氯霉素的化妆品；2)阳性样品在1)阴性样品中添加氯霉素至浓度为lOOng/g。检测结果如图4所示，左边的氯霉素胶体金试纸条检测的是阴性样品，右边的氯霉素胶体金试纸条检测的是阳性样品，如图可知，左边结果显示为阴性，右边显示为阳性，结果一致。可见，本发明方法快速准确。用实施例1的方法分别检测浓度均为100 μ g/ml的β -内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、磺胺类等药物，结果均显示阴性，可见，待测物氯霉素与类似物无交叉反应，本发明方法具有较高的灵敏度及特异性。2011年，采用液相色谱-串联质谱测定方法共检测了 150批从市场上随机抽检的化妆品，确证13批为阳性样品，再用上述氯霉素胶体金试纸条对这150批化妆品样品全部进行检测，结果如表1所示，由表1可知，结果未发现假阳性样品和假阴性样品，试纸条检测正确率为100%，误检率为0，漏检率为0，灵敏度和特异度均为100%。
权利要求
1.化妆品中氯霉素的快速检测方法，包括如下步骤1)将待检样品加入含有提取液的提取管中，振摇，静置分层；2)取提取管的底层溶液，加入含有缓冲液的样品检测管中，混勻；3)吸取样品检测管中的溶液，滴加于氯霉素胶体金试纸条的加样孔中；4)加样后开始计时，3 IOmin后即可根据胶体金试纸条的检测线(T)和控制线(C) 显色深浅对比，判断待检样品为阳性或者阴性。
2.根据权利要求1所述的化妆品中氯霉素的快速检测方法，其特征在于步骤1)提取液含有乙醇，正己烷。
3.根据权利要求1所述的化妆品中氯霉素的快速检测方法，其特征在于步骤2)底层溶液与缓冲液的体积比为1 :4 12。
4.根据权利要求1所述的化妆品中氯霉素的快速检测方法，其特征在于缓冲液为 0.OlM PBS0
5.根据权利要求2所述的化妆品中氯霉素的快速检测方法，其特征在于待检样品的质量、乙醇的体积和正己烷的体积比为1 :4 8 :8 16。
6.根据权利要求2或5所述的化妆品中氯霉素的快速检测方法，其特征在于乙醇的体积浓度为70%。
7.根据权利要求1所述的化妆品中氯霉素的快速检测方法，其特征在于氯霉素胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤1)制备胶体金标记抗氯霉素单克隆抗体，将其包被在胶体金结合垫上；2)制备氯霉素与BSA的偶联物，将其及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，干燥；3)氯霉素胶体金试纸条组装氯霉素胶体金试纸条由PVC模板和PVC背板组成，在PVC 背板上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
全文摘要
本发明公开了化妆品中氯霉素的快速检测方法，将待检样品加入提取管中，振摇，静置分层；取底层溶液，加入样品检测管中，混匀；吸取样品检测管中的溶液，滴加于氯霉素胶体金试纸条的加样孔中；加样后开始计时，3～10min后即可进行结果判断。本发明提取效率高，检测灵敏度提高，排除了干扰因素，操作步骤简单，所需样品量少，5～10分钟即可完成样品的快速检测，操作人员没有专业知识也可快速掌握，非常适合监督执法部门日常监督中使用。
文档编号G01N33/577GK102507940SQ20111032755
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者李延志, 李杨杰, 欧国灯, 肖树雄 申请人:广东省药品检验所