一种快速检测样品中靶核酸的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种快速检测样品中靶核酸的方法。
【背景技术】
[0002] 核酸分子杂交（简称分子杂交，hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验 技术，其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(或RNA)片 段，按碱基互补关系形成杂交双链分子。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与 DNA链之间形成。目前，分子杂交技术已经成为现代分子生物学实验室中最常用的非放射性 基因诊断技术之一，其不仅可用来检测引起癌变的基因突变和引起各种遗传性疾病（如地 中海贫血）的基因突变，而且可用来检测引起感染性疾病的细菌、病毒和寄生虫等。
[0003] 按照反应进行的环境不同，分子杂交可分为固相杂交和液相杂交两种类型。按照 在实验室内不同应用目的，分子杂交又可分为斑点（或狭缝）杂交、Southern印迹杂交、 Northern杂交、细胞以及染色体原位杂交等。
[0004] 固相分子杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固相支持物上，一条反应核酸 游离在溶液中。按照被检测样品分子所在位置不同，固相分子杂交可分为正向杂交（待测 样品分子固定在膜上，检测探针在溶液中）和反向杂交（待测样品分子在溶液中，而探检测 针固定在膜上）两种。其中，反向杂交是指用标记的样品核酸与未标记的固化核酸探针进 行杂交。这种杂交方法的优点是在一次杂交反应中，可同时检测样品中的多种核酸。
[0005] 现有的反向杂交技术操作繁琐，涉及的反应溶液和反应步骤众多，尤其当涉及检 测多个样品时，操作时间将会大大加长而且极易出错。例如，中国专利申请CN101768628A 中公开了一种检测核酸点突变的方法，具体公开了一种利用寡核苷酸探针对PCR产物进行 反向杂交以检测核酸点突变的方法，但是该方法需要借助价格高昂荧光检测设备进行杂交 结果的测试，不仅操作繁琐，而且成本较高。因此，亟需要一种快速检测样品中靶核酸的方 法。
[0006] 出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴 露出来的问题，期望提供一种耗时短、易操作、高通量、成本低的快速检测样品中靶核酸的 方法以及其在检测结核分枝杆菌耐药基因中的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种快速检测样品中靶核酸的方法，该方法一方面将 核酸反向分子杂交过程与酶联过程合二为一进行，可以在固相支持物表面直接形成碱性磷 酸酶标记标记核酸杂交体的偶联物；另一方面将洗涤与显色反应合二为一进行，直接在显 色溶液中通过酶促反应使底物形成有色产物而显色，从而在杂交反应后无需经过单独的洗 涤步骤就可以快速实现样品中靶核酸检测的目的。
[0008] 本发明的又一目的在于提供所述方法在检测结核分枝杆菌耐药基因中的应用。
[0009] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，其包括如 下步骤：
[0010] A)将固定于固相支持物表面的至少一种核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲 和素的杂交液中与生物素标记的靶核酸进行一步反应；
[0011] B)步骤A)中反应完成后，直接将固相支持物表面与包含底物的显色溶液接触进 行显色反应，以检测样品中的靶核酸。
[0012] 本发明的方法直接将碱性磷酸酶标记链霉亲和素加入到杂交液中，在核酸探针与 靶核酸杂交的过程中，同步实现了碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从而 可以在固相支持物表面形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，省去了传统反向分子杂 交方法中在杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤以及其他多个操作步骤，极大缩短了 传统方法检测靶核酸的耗时。
[0013] 在本发明的方法中，所述碱性磷酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锌的金属 酶。每分子酶至少含2个Zn原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结合 位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚单 位的磷酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。
[0014] 在本发明的方法中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪唑酮环， 是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链；生物素分子通过 其末端的羧基与本发明所述的靶核酸连接，从而标记在靶核酸分子上。
[0015] 在本发明的方法中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4 条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个 生物素分子。此外，每条肽链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肽链中的色氨 酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数（K)为 1015L/mol。在本发明的方法中，靶核酸与核酸探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也进 行亲和结合，因此杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面的 核酸探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的靶核酸分子。
[0016] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，将所述碱 性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，一方面能够使得碱性磷酸酶标记链霉亲和 素与生物素标记靶核酸充分的结合；另一方面还能够促进核酸杂交效率，缩短核酸杂交反 应的时间。
[0017] 根据本发明的一个具体实施例，步骤A)中所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂 交液中的浓度为〇· 05~2μg/ml，优选0· 1~1. 5μg/ml，更优选0· 5~1. 2μg/ml。在 本发明的方法中，可以列举的所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度包括但不 限于：〇· 05μg/ml、0. 06μg/ml、0. 07μg/ml、0. 08μg/ml、0. 09μg/ml、0. 1μg/ml、0. 2μg/ ml、0. 3μg/ml、0. 4μg/ml、0. 5μg/ml、0. 6μg/ml、0. 7μg/ml、0. 8μg/ml、0. 9μg/ml、 1μg/ml、L1μg/ml、L2μg/ml、L5μg/ml和 2μg/ml〇
[0018] 在本发明的方法中，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度是本发明 的重要方面。本发明的发明人经过大量试验与创造性劳动发现，如果碱性磷酸酶标记链霉 亲和素在杂交液中的浓度过低，那么影响靶核酸检测的灵敏度；如果碱性磷酸酶标记链霉 亲和素在杂交液中的浓度过高，那么容易带来非特异性吸附现象，影响靶核酸检测结果的 准确性。
[0019] 根据本发明的一个具体实施例，步骤A)中所述杂交液包括锌离子、镁离子、蛋白、 非离子型表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述蛋白选自白蛋白、酪蛋白和明胶，所述 非离子型表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多 聚赖氨酸和聚合氯化铝。
[0020] 根据本发明的一个具体实施例，在所述杂交液中，锌离子为0. 001~0.lmol/L，镁 离子为0. 001~0.lmol/L，蛋白占杂交液的1%~10% (w/v)，非离子型表面活性剂占杂交 液的0. 01~2% (v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0. 01~0. 5% (w/v);优选地，锌离子 为0· 005~0· 05mol/L，缓离子为0· 005~0· 05mol/L，蛋白占杂交液的1 %~5 % (w/v)，非 离子型表面活性剂占杂交液的〇. 05~1 % (v/v)，阳离子型聚合物占杂交液体积的0. 05~ 0. 2% (w/v) 〇
[0021] 根据本发明的一个具体实施例，所述锌离子可以选自含锌离子的可溶性盐。可用 作本发明的所述含锌离子的可溶性盐的实例包括：硫酸锌、氯化锌以及其他各种在溶液状 态可以解离出锌离子的盐。
[0022] 根据本发明的一个具体实施例，所述镁离子可以选自含镁离子的可溶性盐。可用 作本发明的所述含镁离子的可溶性盐的实例包括：硫酸镁、乙酸镁、氯化镁以及其他各种在 溶液状态可以解离出镁离子的盐。
[0023]根据本发明的一个具体实施例，所述吐温选自吐温20 (Tween-20)、吐温 21(Tween-21)、吐温 40(Tween-40)、吐温 60(Tween-60)、吐温 61(Tween-61)、吐温 80 (Tween-80)、吐温81 (Tween-81)和吐温85 (Tween-85)，其中吐温20是特别优选的。
[0024]根据本发明的一个具体实施例，所述曲拉通选自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲 拉通X-114(TritonX-114)和曲拉通X-200(TritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特别优 选的。
[0025] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，酸、碱、盐 离子或温度条件的变化都可能会改变甚至使碱性磷酸酶完全失去活性，因此为了实现本发 明的目的之一，杂交液成分的选择是极为重要的。在本发明的方法中，发明人通过在杂交液 中添加锌离子、镁离子、蛋白和非离子型表面活性剂，一方面有助于提高核酸杂交效率，另 一方面防止杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素因吸附而变性，再一方面防止碱性磷酸 酶