[0126]NaCl:购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0127] 正十二烷基葡萄糖苷：购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0128] 4. 2操作步骤：
[0129] 4. 2. 1 配制组分如下所示的显色溶液：ΡΗ9· 5、0·lmol/LTris-HCl、50mMMgCl2、 0· 33mg/mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和0· 07%正十二烷基葡萄糖苷，余量为水。
[0130] 4. 2. 2显色反应：用镊子夹住步骤（三）中反应后的硝酸纤维素膜，让固定有核酸 探针的硝酸纤维素膜表面向上，稍微倾斜膜，使得膜一端高于另一端。用移液器取显色溶液 从膜的上端的上方持续滴落显色溶液，使得显色溶液从上至下（从膜的上端滴入，从下端 流出滴落），连续流过硝酸纤维素膜的表面，流动时间为lOmin，观察显色结果。
[0131] 本实施例的显色结果如图1所示。
[0132] 结果表明：T533C突变探针点为强阳性，T533C野生型探针点为阴性，从而可以确 定此结核分枝杆菌基因组的rpoB基因在533位点发生了T-C的核酸碱基变异。同时阳 性对照点显示阳性，阴性对照点显示阴性，表明本次实验的检测结果正常。
[0133] 实施例2:
[0134] 同实施例1，不同之处在于将实施例1中杂交液的组成调整为：3XSSC、0. 1μg/ml SA-AP，5mMZnCl2、5mMMgCl2、0. 5%BSA、0. 03%Tween-20、0. 03%PLL和2%聚乙二醇8000， 余量为水。同时将显色溶液的组分调整为：PH9. 5、0.lmol/LTris-HCl、50mMMgCl2、0. 33mg/ mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和0.03%正十六烷基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。
[0135] 本实施例的显色结果如图2所示。
[0136] 实施例3:
[0137] 同实施例1，不同之处在于将实施例1中杂交液组成调整为dXSSCU.Sμg/ml SA-AP、50mMZnCl2、50mMMgCl2、7%BSA、l. 5%Tween-20、0. 3%CPAM和 4%聚乙二醇 8000， 余量为水。同时将显色溶液的组分调整为：PH9. 5、0.lmol/LTris-HCl、50mMMgCl2、0. 33mg/ mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和0. 2%正辛基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。
[0138] 本实施例的显色结果如图3所示。
[0139] 实施例4:
[0140]同实施例1，不同之处在于将实施例1中杂交液组成调整为：3XSSC，0.Sμg/ml SA-AP，20mMZnCl2,20mMMgCl2,1%BSA，0. 05%Tween-20,0· 05%CPAM，4%聚乙二醇 8000， 余量为水。同时将显色溶液的组分调整为：PH9. 5、0.lmol/LTris-HCl、50mMMgCl2、0. 33mg/ mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和0. 05%正十二烷基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。
[0141] 本实施例的显色结果如图4所示。
[0142] 实施例5 :
[0143] 同实施例1，不同之处在于将实施例1中杂交液组成调整为dyssca^yg/mi SA-AP，40mMZnCl2,40mMMgCl2,5%BSA，l%Triton父-100,0.2%?让，4%聚乙二醇 8000， 余量为水。同时将显色溶液的组分调整为：PH9. 5、0.lmol/LTris-HCl、50mMMgCl2、0. 33mg/ mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和0. 1%正十二烷基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。
[0144] 本实施例的显色结果如图5所示。
[0145] 实施例6:
[0146] 同实施例1，不同之处在于将实施例1中步骤3. 2. 2的一步反应条件变为：42°C反 应lOmin。其他条件不变。
[0147] 本实施例的显色结果如图6所示。
[0148] 实施例7 :
[0149] 同实施例1，不同之处在于将实施例1中步骤4. 2. 2显色反应中的显色溶液从上至 下连续流过硝酸纤维素膜表面的时间调整为5min。其他条件不变。
[0150] 本实施例的显色结果如图7所示。
[0151] 实施例8临床样本的检测
[0152] 本实施例中的临床样品来自一名对利福平耐药的临床结核病患者的痰样本（经 过提取核酸进行PCR测序实验证实其rpoB基因在533位点发生了T-C的核酸碱基变异）。
[0153] ( -）核酸探针在固相支持物表面的固定
[0154] 1.1实验材料：
[0155] 核酸探针：核苷酸序列如SEQIDNOs:1~2所示的结核分枝杆菌耐药基因突变检 测探针，用于检测结核分枝杆菌rpoB基因的533位点突变；核苷酸序列如SEQIDN0 :3所 示的阳性对照探针；核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示的阴性对照探针。将上述四种核酸探 针分别加水配制成100μΜ(即lOOpmol/μ1),备用；
[0156] 固相支持物：硝酸纤维素膜，密理博公司（Millipore)生产，0. 45μπι孔径规格，裁 成尺寸为2cmXlcm的膜备用；
[0157] 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT) :5μ/μ1，100μ1购自上海江莱生物科技有限公 司；
[0158] 10XTdT缓冲液：与TdT酶配套，由上海江莱生物科技有限公司提供；
[0159] dTTP: 100nmol/L，购自Promega公司。
[0160] 1.2实验步骤：
[0161] 1. 2. 1核酸探针加尾：对四种核酸探针溶液（100μM)，取2μ1即200pmol的核酸 探针量加入到100μ1含有60μTdT酶、1XTdT反应缓冲液、100nmol/L的dTTP溶液中，37°C 温育60min;然后加入100μ1的lOmmol/LEDTA终止反应（此时探针终浓度为lpmol/μ1)。
[0162]1. 2. 2核酸探针在固相支持物表面的固定：对加尾后核酸探针（lpmol/μ1))、阳 性对照探针和阴性对照探针溶液，分别取1μ1 (含lpmol的探针量）点于硝酸纤维素膜上， 将膜置于用TE浸湿的纸上，经254nm紫外光照射lOmin固定。
[0163] 核酸探针在硝酸纤维素膜表面的排布顺序如下表1所述：
[0164] 表 1
[0165]
[0166] (二）靶核酸的提取
[0167] 取1ml痰样本与1ml浓度为4M的NaOH溶液混匀，室温放置30min液化痰，混匀 后，取lml加到离心管内以12000rpm转速离心2min，弃上清，加入lml生理盐水悬浮，再以 12000rpm转速离心2min，弃上清。余下步骤参照专利EP1407051B1的方法进行：在离心管 内加入200μ1Tris-EDTA缓冲液（即TE缓冲液，PH8. 0)振荡悬浮；再分别加入两种规格 玻璃珠（200μm直径和900μm直径，4 : 1质量比例）；涡旋振荡5min，然后把经振荡处理 过的离心管置于90°C的水浴中加热lOmin，以12000转/分转速离心，取上清备用。
[0168] (三）靶核酸的扩增
[0169] 3.1实验材料：
[0170] 靶核酸：步骤（二）中提取的临床结核患者的痰样本核酸提取液。
[0171] 扩增结核分枝杆菌rpoB基因的引物对，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，上游引物的5'端用生物素标记，上游 引物和下游引物的浓度均为〇. 2μM。
[0172] 扩增人actin基因的引物对，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，下 游引物的核苷酸序列如SEQIDN0 :8所示，上游引物的5'端用生物素标记。
[0173] GoTaq酶：5μ/μ1，购自promega公司。
[0174] 10XTaq酶反应缓冲溶液：购自promega公司。
[0175] MgCl2 :25mM，购自promega公司。
[0176] dNTPsMix: 10mM，购自promega公司。
[0177] 2. 2操作步骤：
[0178] 2. 2. 1配制PCR反应体系（使用下列50μ1的PCR扩增体系，以结核分枝杆菌基 因组核酸和人基因组核酸为模板进行PCR扩增）：
[0179] GoTaq酶：1μ;
[0180] 酶反应缓冲溶液：1XTaq;
[0181] 上游引物 SEQIDNO :5 :0· 2μΜ ;
[0182] 下游引物 SEQIDNO :6 :0· 2μΜ ;
[0183] 上游引物 SEQIDNO :7 :0· 2μΜ ;
[0184] 下游引物 SEQIDNO :8 :0· 2μΜ ;
[0185] MgCl2 ：2.OmM；
[0186] dNT