，所述的"核酸探针"是指在含有与靶序列互补的碱基序列核酸 中，固定于固相支持物表面的核酸片段，核酸探针具有与所述靶序列至少一部分互补的序 列，由此，可在适宜的条件下与靶序列进行杂交。
[0055] 在本发明的方法中，所述的"靶核酸"是指通过本发明的方法检测的具有靶序列的 核酸。
[0056] 在本发明的方法中，所述的"靶序列"是指在靶核酸中包含的序列，靶序列用于检 测靶核酸。
[0057] 根据本发明的一个具体实施例，在本发明的方法中，可以使用常规核酸提取方法 或市售的核酸提取试剂盒从临床样品中提取靶核酸。
[0058] 本发明的方法对传统的反向分子杂交方法进行了显著的改进，建立了一步分子杂 交方法。本发明的方法不仅将核酸杂交与酶联反应合二为一进行，而且将洗膜与底物显色 过程合二为一进行，去除了大量的洗涤操作步骤和反应溶液，从而把反向分子杂交技术变 成了一项简易操作的模式，既为操作人员带来了便利，实验不再容易出错，又节省了大量实 验时间和试剂，此外还大幅度提高了样品中靶核酸的检测通量，能够使得检测结果保持较 高的特异性。
【附图说明】
[0059] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图做简单地介绍，显而易见，下面简述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本 领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的 附图。
[0060] 图1表示本发明实施例1的显色结果图。
[0061] 图2表示本发明实施例2的显色结果图。
[0062] 图3表示本发明实施例3的显色结果图。
[0063] 图4表示本发明实施例4的显色结果图。
[0064] 图5表不本发明实施例5的显色结果图。
[0065] 图6表示本发明实施例6的显色结果图。
[0066] 图7表示本发明实施例7的显色结果图。
[0067] 图8表示本发明实施例8的显色结果图。
【具体实施方式】
[0068] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0069] 在以下实施例中，牛血清白蛋白（以下简称BSA)、阳离子型聚丙烯酰胺（以下简称 CPAM)、碱性磷酸酶标记链霉亲和素（以下简称SA-AP)、多聚赖氨酸（以下简称PLL)、聚乙 二醇8000以及烷基葡萄糖苷的浓度是以g/ml计的质量体积百分比（w/v)浓度；Tween-20 和TritonX-100的浓度是指体积百分比（v/v)浓度。
[0070]实施例1 :
[0071](一）核酸探针在固相支持物表面的固定[0072] 1. 1实验材料：
[0073] 核酸探针：核苷酸序列如SEQIDNOs:1~2所示的结核分枝杆菌耐药基因突变检 测探针，用于检测结核分枝杆菌rpoB基因的533位点突变；核苷酸序列如SEQIDN0 :3所 示的阳性对照探针；核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示的阴性对照探针。将上述四种核酸探 针分别加水配制成100以1(即10(^111〇1/^1),备用。
[0074] 固相支持物：硝酸纤维素膜，密理博公司（Millipore)生产，0. 45μm孔径规格，裁 成尺寸为2cmXlcm的膜备用
[0075] 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）：5μ/μ1，100μ1购自上海江莱生物科技有限公 司。
[0076] 10XTdT缓冲液：与TdT酶配套使用，由上海江莱生物科技有限公司提供。
[0077]dTTP: 100mmol/L，购自promega公司
[0078] 1. 2实验步骤：
[0079] 1. 2. 1核酸探针加尾：对四种核酸探针溶液（100μM)，取2μ1，即200pmol的核 酸探针量，加入到100μ1含有60μTdT酶、1XTdT反应缓冲液、100nmol/L的dTTP溶液中， 37°C温育60min;然后加入100μ1的lOmmol/LEDTA终止反应（此时探针终浓度为lpmol/ μ1) 〇
[0080]1. 2. 2核酸探针在固相支持物表面的固定：对加尾后核酸探针（lpmol/μ1))、阳 性对照探针和阴性对照探针溶液，分别取1μ1 (含lpmol的探针量）点于硝酸纤维素膜上， 将膜置于用TE浸湿的纸上，经254nm紫外光照射10min固定。
[0081] 核酸探针在硝酸纤维素膜表面的排布顺序如下表1所述：
[0082]表1
[0083]
[0084](二）靶核酸的扩增
[0085] 2· 1实验材料：
[0086] 革Ε核酸：浓度为〇·Olng/μ1的结核分枝杆菌（已经通过测序证实其为rpoB基因 发生了T533C突变）基因组核酸以及浓度为50ng/μ1的人基因组核酸
[0087] 扩增结核分枝杆菌rpoB基因的引物对，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDΝ0 : 5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，上游引物的5'端用生物素标记，上游 引物和下游引物的浓度均为〇. 2μM。
[0088] 扩增人actin基因的引物对，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，下 游引物的核苷酸序列如SEQIDN0 :8所示，上游引物的5'端用生物素标记。
[0089] Go Taq酶：5 μ/μ1，购自promega公司。
[0090] 10 X Taq酶反应缓冲溶液：购自promega公司。
[0091] MgCl2 :25mM,购自promega公司。
[0092] dNTPsMix: 10mM，购自promega公司
[0093] 2· 2操作步骤：
[0094] 2. 2. 1配制PCR反应体系（使用下列50μ1的PCR扩增体系，以结核分枝杆菌基 因组核酸和人基因组核酸为模板进行PCR扩增）：
[0095] Go Taq酶：1U ;
[0096] 酶反应缓冲溶液：1X;
[0097] 上游引物 SEQIDN0 :5 :0· 2 μΜ ;
[0098] 下游引物 SEQIDNO:6 :0· 2 μΜ ;
[0099] 上游引物 SEQIDNO:7 :0· 2 μΜ ;
[0100] 下游引物 SEQIDNO:8 :0· 2μΜ;
[0101] MgCl2 ：2. OmM；
[0102] dNTPsMix：0. 2mM；
[0103] 模板1 :1 μ 1结核分枝杆菌基因组核酸；
[0104] 模板2 :1μ1人基因组核酸；
[0105] 余量为水。
[0106] 2. 2. 2PCR扩增反应：首先 95°C预变性 5min;然后 95°C1. 5min;55°C1. 5min; 72°C，lmin，35 个循环；最后 72°C延伸 5min。
[0107] 2. 2. 3PCR产物的变性：首先在95°C孵育10min，然后冰浴5min。
[0108](三）一步反应
[0109] 3. 1实验材料：
[0110] 20XSSC溶液：3·0 mol/LNaCl，0. 3mol/L柠檬酸钠，ρΗ7·0。
[0111] 碱性磷酸酶标记链霉亲和素：购自Gibcol公司。
[0112] 氯化锌（ZnCl2):购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0113] 六水氯化镁：购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0114] 牛血清白蛋白：购自Sigma-Aldrich。
[0115]Tween-20 :购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0116] 多聚赖氨酸（PLL):购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0117] 聚乙二醇8000 :购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0118] 3. 2操作步骤：
[0119] 3. 2. 1 配制组成如下所示的杂交液：PH7. 0,3XSSC，1μg/mlSA-AP，10mMZnCl2， 10mMMgCl2,2%BSA，0. 5%Tween-20,0· 1%PLL，2%聚乙二醇 8000,余量为水。
[0120] 3. 2. 2 -步反应：将步骤（一）中得到的表面固定有核酸探针的硝酸纤维素膜放 入lml杂交液中，同时加入10μ1的步骤（二）中变性后的PCR产物，混匀后于37°C反应 15min〇〇
[0121] (四）显色反应
[0122] 4.1实验材料：
[0123] 硝基蓝四氮唑（NBT):购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0124] 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP):购自生工生物工程（上海）股份有限公 司。
[0125]Tris:购自生工生物工程（上海）股份有限公司。