食品和餐饮具中单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物安全检验检测技术领域，具体涉及一种快速检测纸片，更具体 地说，本发明涉及一种专门用于食品和餐饮具中快速检测单增李斯特菌的定性和定量检测 的冷水凝胶试纸片及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 单增李斯特菌分布较广，单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核增生李斯 特菌（Listeriamonocytogenes)是一种常见的土壤细菌，在土壤中它是一种腐生菌，以死 亡的和正在腐烂的有机物为食。它也是某些食物（主要是鲜奶产品）中的一种污染物，能 引起严重食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、 畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界 中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4°C的环境中仍可生长繁殖， 是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单增李斯特菌是评价食品卫生质量的重要指 标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。我国已将其纳入"国家标准"。国标 方法检测单增李斯特菌需要配制新鲜培养基，操作方法繁琐，成本较高，检测时间长，达不 到快速一步法检测。因此，业内一直希望能有一种经济、简便、易行、快速、准确的方法和产 品。
[0003] 纸片法是上世纪80年代发展起来的一种快速检测食品及食品接触的物体表面、 餐具、茶具中单增李斯特菌污染情况的方法。目前，国内外对单增李斯特菌检测研究较多， 基于分子生物学检测方法，如PCR方法、LAMP法等；基于胶体金检测法；基于ELISA检测法； 特异性显色培养法等。但上述方法需要特殊的检测设备，不便于日常现场快速检测需求。 申请号为201510274726. 9的专利申请公开了一种"快速检测单增李斯特菌的检测试纸及 其制备和应用"，该检测试纸整体呈矩形，包括加样区，底物区及显色区三个功能区，相邻两 区之间设置着流体通道，在底物区边界中设置着含有底物5-溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸铵 X-InP的底物层，但是该现有技术中公开的检测试纸主要用于饮用水、肉食品、乳制品、蔬菜 中单增李斯特菌污染的定性检测，不能用于餐饮具表面单增李斯特菌的检测，且该检测试 纸只能进行定性检测，无法满足定量检测需求。
【发明内容】
[0004] 为了克服【背景技术】中所指出的问题及现有技术存在的已有检测产品和检测方法 的不足，本发明的第一个目的在于提供一种专用于食品和餐饮具中快速检测单增李斯特菌 并可定性、定量分析的冷水凝胶试纸片。该试纸片不仅适合于多种食品中单增李斯特菌的 检测，也可用于餐饮具中单增李斯特菌的快速检测。且该试纸片检测方法操作简便易行、快 速准确（一步法），特异性强，敏感性高，成本低廉，便于基层单位特别是边沿地区及条件差 的基层试验室使用。另外，本发明还提供了一种上述所述冷水凝胶试纸片的制备方法与应 用。
[0005] 为了实现本发明的第一个目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得 了如下技术方案：
[0006] -种单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片，所述试纸片中含有混合培养 基，所述混合培养基由基础培养基、显色剂和冷水凝胶组成，所述显色剂的名称为 (2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3,4, 5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯，分子量为 398,所述显色剂的结构式如式一所示：
[0007]
[0008] 进一步地，上述技术方案中所述的显色剂（21?，33,41?，51?，61?)-1，2,3,4,5-五羟基 环己基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯采用如下方法制备而成，包括如下步骤：
[0009] (1)将反应物A溶于无水二异丙胺及少量无水氯仿中，得到反应物A体系，然后将 所述反应物A体系置于-70~-80°C条件下冷冻；
[0010] (2)在低温-70~-80°C低温条件下，将反应物B在无水、氮气氛围中逐滴加入到 反应物A体系中，剧烈搅拌，反应5. 5~6. 5h;
[0011] (3)将步骤（2)反应后的体系置于室温环境中，待反应体系达到室温后，继续向体 系中加入溶有反应物C的无水氯仿溶液，室温继续搅拌反应12~14h，生成亚磷酸酯类物 质；
[0012] (4)在步骤（3)反应后的体系中加入叔丁基过氧化氢，将亚磷酸盐氧化，并将得到 的磷酸盐置于三甲胺中，在50±0. 5°C条件下放置22~24h;
[0013] (5)除去三甲胺，得到粗产物后，再加入乙硫醇和三氟化硼-醚溶液进行去保护反 应，最终得到的目标产物即为所述显色剂，其中，所述反应物A为1，2,3,4,5,6-六甲氧基亚 甲基-肌醇，反应物B为二氯亚磷酸甲酯，反应物C为2-硝基-4-氟苯酚。
[0014] 进一步地，上述技术方案中所述反应物A、反应物B、反应物C的用量摩尔比为 1:1. 25:2〇
[0015] 进一步地，上述技术方案步骤（1)中所述反应物A与无水二异丙胺的用量摩尔比 为 1:2. 5〇
[0016] 上述所述显色剂在制备过程中发生的化学反应方程式如式二所示：
[0017]式二
[0018] 进一步地，上述技术方案中所述基础培养基由胰蛋白胨、牛肉粉、多价胨、氯化纳、 磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甘氨酸、氯化锂、苯乙醇、七叶苷组成；所述冷水凝胶由聚丙烯酸 钠、黄原胶和海藻糖组成。
[0019] 进一步地，上述技术方案中每升所述混合培养基中含有胰蛋白胨5. 0~6.0g、牛 肉粉5. 0~6. 0g、多价胨3. 0~5. 0g、氯化纳8.0~10. 0g、磷酸二氢钾1. 0~1. 5g、磷酸 氢二钠5. 0~7.Og、甘氨酸8. 0~10.Og、氯化锂1. 0~2.Og、苯乙醇2. 0~3.Og、七叶苷 1· 0~1. 5g;显色剂（2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3,4, 5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基） 磷酸酯2. 0~2. 5g;聚丙稀酸钠4. 0~6.Og、黄原胶1. 0~3.Og、海藻糖2. 0~4.Og。
[0020] 本发明的另一目的在于提供一种上述所述单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸 片制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0021] (1)载体纸片制备：将层析滤纸剪切成5cmX5cm规格，经辐照或高压灭菌，高压灭 菌后于50°C恒温真空干燥后备用；
[0022] (2)内包装袋：将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按试验要求压合成5. 2cmX5. 2cm 规格的联袋；
[0023] (3)基础培养基配制：每升混合培养基中含有胰蛋白胨5.0~6. 0g、牛肉粉5.0~ 6. 0g、多价胨3. 0~5. 0g、氯化纳8. 0~10. 0g、磷酸二氢钾1. 0~1. 5g、磷酸氢二钠5. 0~ 7. 0g、甘氨酸8. 0~10. 0g、氯化锂1. 0~2. 0g、苯乙醇2. 0~3. 0g、七叶苷1. 0~1. 5g;
[0024] (4)每升培养基中含有显色剂（2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3, 4, 5-五羟基环己 基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯2. 0~2. 5g;
[0025] (5)冷水凝胶配制：0·4~0·6%聚丙烯酸钠、0·1~0·3%黄原胶和0·2~0·4% 海藻糖，所述百分比均为质量体积百分比；
[0026] (6)混合培养基配制：将基础培养基、显色剂和冷水凝胶混合均勾，加去离子水定 容至1000ml，于115°C、高压条件下灭菌15min，调节pH至7. 2~7. 4;
[0027] (7)试纸片制作：将灭菌载体纸片依次放入灭菌的烧杯中，加入40°C~45°C的混 合培养基使之淹没纸片，浸泡8~10min，使培养基充分吸附于纸片，摆放于无菌不锈钢丝 网上，45 °C恒温真空干燥；
[0028] (8)试纸片包装：将浸渍烘干的纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内，其中 5cmX5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铀袋，封口后室温以下保存备用。
[0029] 本发明的还一目的在于提供上述所述的单增李斯特菌快速检测冷水凝胶纸片的 应用。
[0030] 如上所述的一种单增李斯特菌快速检测冷水凝胶纸片，所述试纸片可同时适用于 食品和餐饮具中单增李斯特菌的定量、定性检测。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0032] 1、本发明适用于食品和餐饮具中单增李斯特菌定量和定性检测分析，本发明利用 冷水凝胶以层析滤纸为载体，将培养基成分、显色剂和冷水凝胶混合，均匀地负载到层析滤 纸上，样品可均匀分布于冷水凝胶，在其表