专利名称：一种单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种能表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的prfA 基因缺失重组单核细胞增生性李斯特菌(LM)，特别是提供了能够预防李氏杆菌病，而且可以表达外源性抗原来预防胞内感染的病原微生物引起的疫病的活载体，属于人畜共患病分子标记疫苗技术领域。
背景技术：
单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种能引起人和动物李斯特菌病的人兽共患病原菌。在家畜上，LM可引起脑膜脑炎、流产和急性败血病；在家禽上，LM可导致败血症和心肌坏死的发生，每年该病都对我国畜禽养殖业造成较大的经济损失。同时，作为一种重要的食源性细菌，该菌能污染肉、奶、蛋等动物性食品而引起食品中毒，并能导致孕妇、新生儿及免疫力低下的成年人发病，对人类的健康也构成极大的威胁， 被列为是四大食源性病原菌之一。1999年底，美国发生了历史上因食用带有李斯特菌的食品而引发的最严重的食物中毒事件。据美国疾病控制和防治中心资料显示，在美国密歇根州有14人因食用被该菌污染的“热狗”和熟肉而死亡，在另外22个州97人患此病，6名妇女流产。1992-1995年法国出产的奶酪及猪肉中发现LM。近年来，我国质检部门多次从国内和国外动物性食品加工厂生产的食品中检测出单核细胞增生性李斯特菌。因此，为了确保人们的身体健康，应该积极开展单核细胞增生性李斯特菌减毒活载体疫苗的研制工作。
参与LM感染和扩散的多种毒力因子都集中在其基因组一个9 Kb的致病岛 (Listeria pathogenicity island 1，LIPI_1)内。这个区域的DNA分别编码正调节因子 (prfA)、磷脂酶Ca (plcA)、溶血素(LL0)、依赖锌的金属蛋白酶(mlp)、肌动蛋白聚合蛋白 (actA)和磷脂酰肌醇特异性卵磷脂酶(plcB) 6个毒力因子。
由于LM具有较强的毒力，在将开发为活疫苗载体之前需要对其毒力基因进行分子改造，使之毒力减弱。近年来，随着对LM毒力基因研究的不断深入，国外学者开展了 LIPI-I致病岛毒力基因的改造研究。Angelakopoulos等(2002)对actA和plcB毒力基因进行了双重删除，获得的菌株在志愿者身上进行试验，结果大部分志愿者未发现不良反应，仅少数有轻微反应，经过14天的免疫监测，志愿者体内产生了坚强的体液免疫和细胞免疫。在对LM LIPI-I致病岛毒力基因进行改造的同时，一些学者还将外源性基因插入 LIPI-I致病岛编码基因中，获得的重组LM不但毒力减弱，而且表达的外源蛋白可有效地刺激机体产生细胞免疫应答。
目前，国内开展LIPI-I致病岛毒力基因改造的研究工作刚刚起步，在动物试验中获得了预期的结果，显示出良好的应用前景，但是到目前为止国内外还没有重组LM疫苗进入人临床试验的报告，也没有关于动物李氏杆菌商品化弱毒疫苗研制成功的报道，这与LM 重组菌本身的毒力仍然较强有关。
因此，要想将LM开发成表达外源基因的活疫苗载体和弱毒疫苗，必须对LM的毒力基因进行进一步的致弱改造。随着对LM毒力因子表达调控分子机制的深入研究，发现prfA 基因的编码蛋白作为一种转录活化因子能调控LM LIPI-I致病岛中大多数毒力因子和内化素的表达，而这些分子在LM入侵、扩散和致病力中起重要作用。因此，如果对该基因进行改造，就很有希望得到毒力进一步降低的重组LM，从而开发出具有使用价值的李氏杆菌活疫苗载体，不但可以有效地预防李氏杆菌病，而且可以表达外源性抗原来预防胞内感染的病原微生物引起的疫病。鉴于此，本项目以高致病性LM LIPI-I致病岛中的关键分子prfA基因为研究对象，拟采用分子生物学手段对其进行基因改造致弱，构建能表达GFP的LM prfA 基因重组菌，并开展重组菌生长特性、毒力、感染动力学、遗传稳定性和免疫原性研究，旨在为李氏杆菌病得有效防治提供一种安全、可靠、高效的疫苗。发明内容
本发明的目的在于提供一种利用以高致病性LM LIPI-I致病岛中的关键分子 prfA基因为研究对象，采用分子生物学手段对其进行基因改造致弱，构建能表达GFP的安全性高，稳定性强，免疫效果好的LM prfA基因缺失菌，为进一步开展缺失菌生长特性、毒力、感染动力学、遗传稳定性和免疫原性研究奠定基础。
本发明公开了一种单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤(一)、选择单核细胞增生性李斯特菌prfA及同源臂基因、gfp基因序列，根据选择的 PrfA基因和gfp基因的靶序列分别进行引物的设计，其中Pl和P2引物扩增prfA及同源臂基因片段，扩增长度为1519 bp;P3和P4引物扩增gfp基因片段，扩增长度为720bp，引物序列为Pl <210> 3，其酶切位点为Kpn I ； P2 <210> 4，其酶切位点为)(ba I ； P3 <210> 5，其酶切位点为EcoR I ； P4 <210> 6，其酶切位点为BamH I ；(二)、克隆载体pMD-T-Δ prfA-gfp的构建(1)提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA；(2)扩增含有prfA基因及同源臂片段、gfp基因，提取单核细胞增生性李斯特菌基因组 DNA 2 L和pGFP-Nl质粒0. 5 L作为模板；(3)克隆载体pMD19-T-prfA、pMD19-T-gfp的构建将上述PCR产物与pMD19_T载体连接；(4)pMD19-T- Δ prfA-gfp 载体的构建用 EcoR I、BamH I 分别将 pMD19_T_prfA 和 pMD19-T-gfp进行同步双酶切后将gfp连入pMD19-T- Δ prfA中；(三)、重组穿梭载体PKSV7-Δ prfA-gfp的构建用Kpn I和Xba I将穿梭载体pKSV7和pMD19_T_ Δ prfA-gfp进行同步双酶切后将 Δ prfA-gfp 连入 pKSV7 中；(四)、将穿梭载体PKSV7-Δ prfA-gfp电转化进入LM感受态细胞 (I)LM感受态细胞的制备；(a)接种活化LM转接入5 IOml BHI培养基中过夜培养；(b)于第二日按1 50 1 100稀释转接入新鲜BHI培养基中，37°C振荡培养2. 5h-3h, 至 0D600 为 0. 4-0. 5 ；(c)加入浓度为4 5μg/ml的Penicillin G，继续摇至0D6000. 8 1.0 ；(d)3. 5 4. 50C，4500 5500rpm,离心 10 12min,收集细菌；(e)用预冷的10 12ml蔗糖甘油缓冲溶液吹打重悬，8000 IOOOOrpm,3. 5 4. 5°C， 10 12min ；(f)沉淀用体积比1/50 1/100超纯水溶解；(g)感受态每100μ L 200 μ L分装一管，现做现用； (2)电转化在2. 45 2. 55kv、180 220 Ω和23 27 μ F电转参数下，用构建好的基因敲除质粒 PKSV7- Δ prfA-gfp电转化感受态细菌，电转结束后将细菌涂布于含40 60 μ g/ml青霉素的BHI平板，36. 9 37. 1°C培养46 50h，挑取所有的单菌落，用引物P1/P2进行单菌落 PCR鉴定；(五)、重组菌LM-Δ prfA-gfp的构建将含有基因敲除质粒的阳性克隆在BHI液体培养基中36. 9 37. 1°C培养至对数生长期，稀释后涂布于9 11 μ g/ml氯霉素固体培养基上，41. 9 42. 1°C条件下连续培养 48-7池，质粒载体与细菌DNA整合，通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组；从细菌菌落数最少的平板上挑取单菌落，36. 9 37. 1°C液体传代培养，传代时使用无抗生素BHI培养基，每传一次保一次菌，至传代30代确定质粒完全丢失后开始提取基因组DNA，用外围引物对P5:<210> 7 /P6 <210> 8进行PCR鉴定，直至出现基因组中插入gfp的重组菌；(六)、经过一定条件下连续传代，获得稳定遗传的重组菌将上述PCR产物进行电泳，若电泳后，PCR产物出现片段大小约为观00 bp，说明样品基因组中含有gfp插入基因；如果仅出现2200 bp大小的核酸片段，则表明样品中基因组DNA中并没有插入gfp，即没有发生同源重组。
上述步骤(二)中扩增含有prfA基因及同源臂片段、gfp基因，其PCR反应条件的确定最好采用相同的50 L PCR反应体系，PCR反应体系的组成为10XPCR缓冲液5 L， 25mmol/L MgCl2 4 ？ L,2. 5mmol/L dNTP 4 ？ L，P1、P2 或 P3、P4 (25 pmol/ L)各 1 L， 提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA 2 L和pGFP-Nl质粒0. 5 L作为模板，Taq DNA 聚合酶(1. 5U/ L)1 L，补加去离子水至50 L ；prfA及同源臂基因最佳循环参数为95°C， 150 s ；94°C,40 s ；59°C,40 s ;72°C，120s，最后 72°C延伸 IOmin ;gfp 基因最佳循环参数为 95°C, 150 s;94°C，30 s;55°C，40 s ;72°C，60s，最后 72°C延伸 IOmin0
上述步骤(一)中引物设计具体的要求最好为G+C含量为45 65%，引物长度 18 22nt，其不含保护性碱基和酶切位点， ιι值55 70°C，扩增产物长度1500 2000 bp。
单核细胞增生性李斯特菌prfA基因及上下游同源臂、gfp基因的克隆从GenBank (DQ309883. 2、AF303131. 1)中下载已经公布的单核细胞增生性李斯特菌基因及gfp基因序列。其中PrfA基因及上下游同源臂序列中第260位一第973位是prfA基因；从第879位一第949位缺失后插入gfp基因。
说明两段粗黑字符之间(第260位一第973碱基)的序列为完整的prfA基因，下划线的粗黑字符为缺失的基因片段(第879位一第949位碱基)；然后在这个部位插入完整的gfp基因。
prfA基因及上下游同源臂扩增的靶序列为1 AAAGTTTACG CATGTTGTTC GCACCCAGTT CTTTCAGGTC CTGCTATGAA ACGTATTGAA 61 GAATCGCCAA TCGAAAAATT AGTTGTTACA AACTCCATCG CTCTTCCAGA AGAAAAATGG121ATTGACAAAATGGAACAATTATCTGTTGCAGCTCTTCTTGGCGAAGCAATCGTTCGCGTT181CATGAAAATGCTTCTGTAAGTTCTTTATTCGAATAAAATATAAAACAGGATGCCTCATTG241AGACATCCTGTTTTTTGATTTAATTTAATTTTCCCCAAGTAGCAGGACATGCTAAATAAA301ACCATTCATCTAATTTAGGAGCATATCTTTTGAGATAATCAAGATTTTGTACATAAAAGC361ATGAATTTTTATACACGATAACTTTCTCTTGCTTTAATTTAGAAATAATTCTGCTAACAG421CTGAGCTATGTGCGATACCGCTTGAATAGCCTAACTCCTGCATTGTTAAATTATCCAGTG481TAATCTTGATGCCATCAGGAGTTTCTTTACCATACACATAGGTCAGGATTAAAAGTTGAC541CGCAAATAGAGCCGAGCTTCCCGTTAATCGAAAAATCATTAAATTTGGCTAGGCTGTATG601AAACTTGTTTTTGTAGGGTTTGGAAAACATAGAAAAAGTGCGTAAGATTCTTGCTCAGTA661GTTCTTTTAGTTCGTTTATTTTGATAACGTATGCGGTAGCCTGTTCGCTAATGACTTCTA721AATTATAATAGCCAACCGATGTTTCTGTATCGATAAAGCCAGACATTATAACGAAAGCAC781CTTTATAGTATTGTAAATTCATGATGGTCCCGTTCTCGCTAATACTTGTAAGCTTTGTAA841TACCATCATATAGGAAAATACAATATTCTTGTGGATCCCATTGGTTAAAAATAAGTTCTT901TTTTATGAAATTGTTTTGGTTTTATCCCGTTAGTTTCTAAATATTTTTTGAATTCTTCTG961 CTTGAGCGTT CATGTCTCAT CCCCCAATCG TTTTTTATCG CCCTTTTTTA AAATACCCTA1021AAAACATTAGGCAGTAACAACAATTGTTAGCTGTTGAAAGAAAGTCACGCTAAATAATAT1081TTTTTACATATAGGATTTTATTATACAAATTTTGATTTCGCAAAAGAAATGCATACATAT1141TTAAAAACGGATTTATTTAGATGTTAAAATTGAAATAGGGTTAGTATATGGTTCCGATGG1201TTGCTCGGAGATATACTAACCCTTTTTTTGTAGGAATAATATATGTTAGTTGAATTTATT1261GTTTTTTATGATGTTTTTGATAGTTTGTTTTTCGGGGAAGTCCATGATTAGAATGCCTAA1321TCCTCGAACTTTTTCCGATGTTAAGTTGAGTACGAACTGCTCTACTTTGTTGTTTAATGC1381TGCAGCATACTGACGAGGTGTGAATGTTAATGAAGTGGCACTAATATGGTTAAGAAACAG1441TTTGTTGTCCGCTTTAGAAGCTTGATAAGCAGTCTGGACAATCTCTTTGAATTTTGTTTT1501CACACTCGGACCATTGTAG本发明与常规的检测技术相比具有如下优点1、本发明建立的表达GFP-Δ prfA基因重组菌，安全性高，稳定性强，免疫效果好。2、本发明另一个优点是将调控LM毒力基因表达的调控基因prfA缺失部分基因后插入 gfp，从而使各毒力基因的表达受到一定程度的抑制达到显著降低毒力的同时又不使免疫原性发生变化；可以用于防治李氏杆菌病，也可以进一步改造成活载体疫苗达到一苗防多病的效果。
图1为样品中单核细胞增生性李斯特菌未发生重组，M :D, L-5000, S :Sample。
图 2 为样品为重组菌 LM- Δ prfA-gfp, M :D, L-5000, S =Sample0
图3为样品中不含单核细胞增生性李斯特菌，M :D, L-5000, S :Sample。
图4为电转化穿梭载体pKSV7-AprfA-gfp后进行的菌落PCR鉴定结果，Μ: D, L-5000(5000，3000，2000，1500，1000，750，500，250，100) ；1，2，3，4 为电转阳性菌落(2168bp); 7, 8，9为未电转入质粒的菌落(1448bp)。
图5为确认穿梭质粒丢失以后提取细菌DNA进行的PCR检测结果，鉴定是否发生重组，M D, L-5000 (5000，3000，2000，1500，1000，750，500，250，100) ； 1 为 LM 标准株； 2，3，4，6，7，9，10 为 LM- Δ prfA-gfp 重组菌。
图6为重组菌LM- Δ prfA-gfp的构建PCR鉴定反应条件数据表格。
具体实施方式
实施例1参照图1一图6，本实施例分以下步骤操作1 选择单核细胞增生性李斯特菌PrfA及同源臂基因、gfp基因序列，用primer premier 6. 0软件分别设计特异性引物扩增目的片段；1.1单核细胞增生性李斯特菌PrfA及同源臂基因、gfp基因序列的选择从GenBank中下载已经公布的单核细胞增生性李斯特菌prfA及同源臂基因、gfp基因序列(GenBank 登录号DQ309883. 2 和 AF303131. 1)。
1.2特异性引物的设计及合成将选择的PrfA及同源臂基因、gfp基因的靶序列分别输入primer premier 6. 0软件程序中，分别设计两种基因的特异性引物。PrfA基因引物设计具体的要求为G+C含量为 45 65%，引物长度18 22nt (不含保护性碱基和酶切位点)，Tm值55 70°C，扩增产物长度1500 2000 bp。gfp基因引物要求与prfA基因大致相同。送上海生工生物工程技术服务有限公司进行引物的合成。
2 克隆载体pMD- Δ prfA-gfp的构建；2.1单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA的提取用液体培养基对标准的单核细胞增生性李斯特菌进行细菌培养，然后取1. 5mL培养物 12000rpm离心2min，在沉淀中加入200 ？ L的TE (pH8. 0)缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入100 L 10%SDS和15 L的蛋白酶K(20mg/mL)，混勻，于37°C温育30min。然后再加入100 L 5mol/L NaCl,充分混勻，再加入80 L CTAB/NaCl溶液，混勻后再65°C温育 IOmin0再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混勻，12000r/min离心5min，转入一只新管中， 加入2体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。沉淀用ImL的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇.在干燥的沉淀中加入适量的TE溶液溶解基因组DNA。
2.2扩增prfA及同源臂基因、gfp基因PCR反应条件的确定采用相同的50 L PCR反应体系。PCR反应体系的组成为10XPCR缓冲液5 L， 25mmol/L MgCl2 4 ？ L,2. 5mmol/L dNTP 4 ？ L，P1、P2 或 P3、P4 (25 pmol/ L)各 1 L， 提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA 2 L和pGFP-Nl质粒0. 5 L作为模板，Taq DNA 聚合酶(1. 5U/ L)1 L，补加去离子水至50 L。prfA及同源臂基因最佳循环参数为95°C， 150 s ；94°C,40 s ；59°C,40 s ;72°C，120s，最后 72°C延伸 IOmin ;gfp 基因最佳循环参数为 95°C, 150 s;94°C，30 s;55°C，40 s ;72°C，60s，最后 72°C延伸 IOmin2. 3 克隆载体 pMD19-T-prfA、pMD19_T-gfp 的构建； PCR产物与pMD19-T载体连接，其反应体系如下10μ L 连接体系prfA 及其同源臂 PCR 回收产物3，pMD19-T :0. 5，Sollution I :5， ddH20 :1.5。
IOyL连接体系如下gfp PCR回收产物4，pMD19_T: 0.5，Sollution I :5，ddH20 :0· 5。2. 4 pMD19-T- Δ prfA-gfp 载体的构建用EcoR I ,BamH I分别将pMD19_T-prfA和pMD19_T-gfp进行同步双酶切后将gfp连入pMD19-T- Δ prfA中。其酶切和连接反应如下10μ L 酶切体系pMD19-T-prfA / pMD19_T_gfp 5, IOXK buffer 1, EcoR I 和 BamH I 各 0. 5，dd H20 :3。
IOyL 连接体系pMD19-T-Δ prfA :3，gfp 酶切产物4，10XT4 连接酶 1，dd H20 :2。
3 重组穿梭载体pKSV7- Δ prfA-gfp的构建；用Kpn I和Xba I将穿梭载体pKSV7和pMD19_T_ Δ prfA-gfp进行同步双酶切后将 Δ prfA-gfp连入pKSV7中。其酶切和连接反应如下10 μ L 酶切体系:pMD19-T- Δ prfA-gfp / pKSV7 :4，Kpn I 禾口 Xba I 各 0. 5，IOXM buffer :1, dd H20 :4。
10 μ L 连接体系pMD19-T- Δ prfA-gfp 酶切产物3. 5，pKSV7 酶切产物1， 10XT4 连接酶1，dd H20 4.5。
4将穿梭载体pKSV7- Δ prfA-gfp电转化进入LM感受态细胞 4.1 LM感受态细胞的制备(1)接种活化LM转接入5mlBHI培养基中过夜培养；(2)于第二日按1:50稀释转接入新鲜BHI培养基中，37°C振荡培养2.5h至0D600约0. 4 ；(3)加入PenicillinG (至终浓度为5 μ g/ml)继续摇至0D600为0. 8 ；(4)4°C 5000rpm,离心 IOmin,收集细菌；(5)用预冷的IOml蔗糖甘油缓冲溶液吹打重悬，8000rpm，4°C,IOmin ；(6)沉淀用1/100超纯水溶解；(7)感受态每IOOyL分装一管，现做现用。
4.2电转化在2. 5kv、200Q和25 μ F电转参数下，用构建好的基因敲除质粒pKSV7-Δ prfA-gfp电转化感受态细菌，电转结束后将细菌涂布于BHI平板(含50 μ g/ml青霉素)，37°C培养48h， 挑取所有的单菌落，用引物P1/P2进行单菌落PCR鉴定。
5 重组菌 LM- Δ prfA-gfp 的构建将含有基因敲除质粒的阳性克隆即上述获得的阳性菌落在BHI液体培养基中37°C培养至对数生长期，稀释后涂布于10 μ g/ml氯霉素固体培养基上，42°C条件下连续培养48h， 质粒载体与细菌DNA整合，通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组；从细菌菌落数最少的平板上挑取单菌落，37°C液体传代培养，传代时使用无抗生素BHI培养基，每传一次保一9次菌。至传代30代确定质粒完全丢失后开始提取基因组DNA，用外围引物对P5/P6进行 PCR 鉴定，所述 P5: <210> 7; P6: <210> 8，PCR 反应条件95°C 4min; 30 X (94°C 45s, 60°C 40s, 72°C 2min30s), 72°C IOmin0参照图6，直至出现基因组中插入gfp的重组菌。
6、重组菌LM- Δ prfA-gfp的分子生物学鉴定取10 L PCR产物在1%琼脂糖凝胶上，120V电泳30分钟，用溴化乙锭染色，然后在紫外光透射仪下观察拍照，以标准DNA marker (D，L-5000)作参考。若电泳后，琼脂糖凝胶中出现片段大小约为观00 bp，说明样品基因组中含有gfp插入基因(图1);如果仅出现2200 bp大小的核酸片段(图2)，则表明样品中基因组DNA中并没有插入gfp，即没有发生同源重组。
实施例2 参照图1 一图6，本实施例与实施例1不同地方在于将穿梭载体pKSV7- Δ prfA-gfp 电转化进入LM感受态细胞。
所述LM感受态细胞的制备中(1)接种活化LM转接入8mlBHI培养基中过夜培养；(2)于第二日按1:80稀释转接入新鲜BHI培养基中，37°C振荡培养2.8h至0D600约0. 5 ；(3)加入PenicillinG (至终浓度为4 μ g/ml)继续摇至0D600为0. 9 ；(4)3. 50C 4500rpm,离心 llmin,收集细菌；(5)用预冷的Ilml蔗糖甘油缓冲溶液吹打重悬，9000rpm，3.5°C, llmin ；(6)沉淀用1/50超纯水溶解；(7)感受态每200μ L分装一管，现做现用。
所述电转化中在2. 45kv、180 Ω和23 μ F电转参数下，用构建好的基因敲除质粒pKSV7_ Δ prfA-gfp 电转化感受态细菌，电转结束后将细菌涂布于BHI平板(含40 μ g/ml青霉素)，37°C培养 50h，挑取所有的单菌落，用引物P1/P2进行单菌落PCR鉴定。
所述重组菌LM- Δ prfA-gfp的构建将含有基因敲除质粒的阳性克隆即上述获得的阳性菌落在BHI液体培养基中37. I0C 培养至对数生长期，稀释后涂布于9 μ g/ml氯霉素固体培养基上，42°C条件下连续培养 55h，质粒载体与细菌DNA整合，通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组；从细菌菌落数最少的平板上挑取单菌落，36. 9°C液体传代培养，传代时使用无抗生素BHI培养基，每传一次保一次菌。至传代30代确定质粒完全丢失后开始提取基因组DNA，用外围引物对P5/P6 进行 PCR 鉴定，所述 P5: <210> 7 ； P6: <210> 8，PCR 反应条件95°C 4min; 30X (94°C 45s, 60°C 40s, 72°C 2min30s), 72°C IOmin0参照图6，直至出现基因组中插入gfp的重组菌。
实施例3 参照图1 一图6，本实施例与实施例1不同地方在于将穿梭载体pKSV7- Δ prfA-gfp 电转化进入LM感受态细胞。
所述LM感受态细胞的制备中(1)接种活化LM转接入IOmlBHI培养基中过夜培养；(2)于第二日按1:100稀释转接入新鲜BHI培养基中，37°C振荡培养2.9h至0D600约0. 5 ；(3)加入PenicillinG (至终浓度为4 μ g/ml)继续摇至0D600为1. 0 ；(4)4. 50C 5500rpm,离心 12min,收集细菌；(5)用预冷的12ml蔗糖甘油缓冲溶液吹打重悬，IOOOOrpm,4. 5°C,12min ；(6)沉淀用1/80超纯水溶解；(7)感受态每200μ L分装一管，现做现用。
所述电转化中在2. 55kv、220 Ω和27 μ F电转参数下，用构建好的基因敲除质粒pKSV7_ Δ prfA-gfp 电转化感受态细菌，电转结束后将细菌涂布于BHI平板(含60 μ g/ml青霉素)，37. 1°C培养 46h，挑取所有的单菌落，用引物P1/P2进行单菌落PCR鉴定。
所述重组菌LM- Δ prfA-gfp的构建将含有基因敲除质粒的阳性克隆即上述获得的阳性菌落在BHI液体培养基中36.9°C 培养至对数生长期，稀释后涂布于11 μ g/ml氯霉素固体培养基上，42. 1°C条件下连续培养 65h，质粒载体与细菌DNA整合，通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组；从细菌菌落数最少的平板上挑取单菌落，37. 1°C液体传代培养，传代时使用无抗生素BHI培养基，每传一次保一次菌。至传代30代确定质粒完全丢失后开始提取基因组DNA，用外围引物对P5/P6 进行 PCR 鉴定，所述 P5: <210> 7 ； P6: <210> 8，PCR 反应条件95°C 4min; 30X (94°C 45s, 60°C 40s, 72°C 2min30s), 72°C IOmin0参照图6，直至出现基因组中插入gfp的重组菌。
实施例4 参照图1 一图6，本实施例与实施例1不同地方在于将穿梭载体pKSV7- Δ prfA-gfp 电转化进入LM感受态细胞。
所述LM感受态细胞的制备中(1)接种活化LM转接入5mlBHI培养基中过夜培养；(2)于第二日按1 50稀释转接入新鲜BHI培养基中，37°C振荡培养池至0D600约0. 5 ；(3)加入PenicillinG (至终浓度为5 μ g/ml)继续摇至0D600为0· 8 ；(4)4°C5000rpm,离心 IOmin,收集细菌；(5)用预冷的IOml蔗糖甘油缓冲溶液吹打重悬，IOOOOrpm,4. 5°C,12min ；(6)沉淀用1/100超纯水溶解；(7)感受态每100μ L分装一管，现做现用。
所述电转化中在2. 5kv、220Q和25 μ F电转参数下，用构建好的基因敲除质粒pKSV7-Δ prfA-gfp电转化感受态细菌，电转结束后将细菌涂布于BHI平板(含65 μ g/ml青霉素)，37°C培养48h， 挑取所有的单菌落，用引物P1/P2进行单菌落PCR鉴定。
所述重组菌LM- Δ prfA-gfp的构建将含有基因敲除质粒的阳性克隆即上述获得的阳性菌落在BHI液体培养基中37°C培养至对数生长期，稀释后涂布于10 μ g/ml氯霉素固体培养基上，42°C条件下连续培养72h，11质粒载体与细菌DNA整合，通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组；从细菌菌落数最少的平板上挑取单菌落，37°C液体传代培养，传代时使用无抗生素BHI培养基，每传一次保一次菌。至传代30代确定质粒完全丢失后开始提取基因组DNA，用外围引物对P5/P6进行 PCR 鉴定，所述 P5: <210> 7; P6: <210> 8，PCR 反应条件95°C 4min; 30 X (94°C 45s, 60°C 40s, 72°C 2min30s), 72°C IOmin0参照图6，直至出现基因组中插入gfp的重组菌。
权利要求
1. 一种单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤(一)、选择单核细胞增生性李斯特菌PrfA及同源臂基因、gfp基因序列，根据选择的 PrfA基因和gf/7基因的靶序列分别进行引物的设计，其中Pl和P2引物扩增/TTi^及同源臂基因片段，扩增长度为1519 bp;P3和P4引物扩增基因片段，扩增长度为720bp，引物序列为Pl <210> 3，其酶切位点为幻W I ；P2 <210> 4，其酶切位点为损a I ；P3 <210> 5，其酶切位点为I ；P4 <210> 6，其酶切位点为I ；(二)、克隆载体pMD-T-Δ prfA-gfp的构建(1)提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA；(2)扩增含有prfA基因及同源臂片段、gfp基因，提取单核细胞增生性李斯特菌基因组 DNA 2 μ L禾口 pGFP-m质粒0. 5 μ L作为模板；(3)克隆载体pMD19-T-prfA、pMD19-T-gfp的构建将上述PCR产物与pMD19_T载体连接；(4)pMD19-T- Δ prfA-gfp 载体的构建用 EcoR I、BamH I 分别将 pMD19_T_prfA 和 pMD19-T-gfp进行同步双酶切后将gfp连入pMD19-T- Δ prfA中；(三)、重组穿梭载体PKSV7-Δ prfA-gfp的构建用Kpn I和损a I将穿梭载体pKSV7和pMD19_T_ Δ prfA-gfp进行同步双酶切后将 Δ prfA-gfp 连入 pKSV7 中；(四)、将穿梭载体PKSV7-Δ prfA-gfp电转化进入LM感受态细胞(1)LM感受态细胞的制备；(a)接种活化LM转接入5 IOmlBHI培养基中过夜培养；(b)于第二日按1 50 1 100稀释转接入新鲜BHI培养基中，37°C振荡培养2. 5h-3h, 至 OD600 为 0. 4-0. 5 ；(c)加入浓度为4 5μg/ml的Penicillin G，继续摇至OD600O. 8 1. 0 ；(d)3. 5 4. 50C，4500 5500rpm,离心 10 12min,收集细菌；(e)用预冷的10 12ml蔗糖甘油缓冲溶液吹打重悬，8000 IOOOOrpm,3. 5 4. 5°C， 10 12min ；(f)沉淀用体积比1/50 1/100超纯水溶解；(g)感受态每100μ L 200 μ L分装一管，现做现用；(2)电转化在2. 45 2. 55kv、180 220 Ω和23 27 μ F电转参数下，用构建好的基因敲除质粒 PKSV7- Δ prfA-gfp电转化感受态细菌，电转结束后将细菌涂布于含40 60 μ g/ml青霉素的BHI平板，36. 9 37. 1°C培养46 50h，挑取所有的单菌落，用引物P1/P2进行单菌落 PCR鉴定；(五)、重组菌LM-Δ prfA-gfp的构建将含有基因敲除质粒的阳性克隆在BHI液体培养基中36.9 37. 1°C培养至对数生长期，稀释后涂布于9 11 μ g/ml氯霉素固体培养基上，41. 9 42. 1°C条件下连续培养 48-7池，质粒载体与细菌DNA整合，通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组；从细菌菌落数最少的平板上挑取单菌落，36. 9 37. 1°C液体传代培养，传代时使用无抗生素BHI培养基，每传一次保一次菌，至传代30代确定质粒完全丢失后开始提取基因组DNA，用外围引物对P5:<210> 7 /P6 <210> 8进行PCR鉴定，直至出现基因组中插入gfp的重组菌；(六)、经过一定条件下连续传代，获得稳定遗传的重组菌将上述PCR产物进行电泳，若电泳后，PCR产物出现片段大小约为观00 bp，说明样品基因组中含有gfp插入基因；如果仅出现2200 bp大小的核酸片段，则表明样品中基因组DNA中并没有插入gfp，即没有发生同源重组。
2.如权利要求1所述的单核细胞增生性李斯特菌PrfA基因缺失菌的构建方法，其特征在于步骤(二)中扩增含有PrfA基因及同源臂片段、gfp基因，其PCR反应条件采用相同的50yL PCR反应体系，PCR反应体系的组成为10 X PCR缓冲液5 μ L，25mmol/L MgCl2 4 μ L,2. 5mmol/L dNTP 4 μ L，P1、P2 或 P3、P4 (25 pmol/μ L)各 1 μ L，提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA 2 μ L和pGFP-Nl质粒0. 5 μ L作为模板，Taq DNA聚合酶(1. 5U/ μ L) lyL，补加去离子水至50yL ;prfA及同源臂基因最佳循环参数为95°C，150 s ；94°C,40 s ； 59°C,40 s ；72°C，120s，最后 72°C延伸 IOmin ；gfp 基因最佳循环参数为 95°C，150 s ；94°C, 30 s;55°C，40 s ;72°C，60s，最后 72°C延伸 IOmin0
3.如权利要求1或2所述的单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的构建方法，其特征在于步骤(一)中引物设计具体的要求为G+C含量为45 65%，引物长度18 22nt， 其不含保护性碱基和酶切位点，Tm值55 70°C，扩增产物长度1500 2000 bp。
全文摘要
本发明为单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的构建方法，主要包括以下步骤根据选择的prfA基因和gfp基因的靶序列分别进行引物的设计；克隆载体pMD-T-△prfA-gfp的构建；重组穿梭载体pKSV7-△prfA-gfp的构建；将穿梭载体pKSV7-△prfA-gfp电转化进入LM感受态细胞；重组菌LM-△prfA-gfp的构建；经过一定条件下连续传代，获得稳定遗传的重组菌。本发明是将调控LM毒力基因表达的调控基因prfA缺失部分基因后插入gfp建立的表达GFP-ΔprfA基因重组菌，安全性高，稳定性强，免疫效果好。
文档编号C12R1/01GK102533829SQ20111045851
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者丁波, 乔军, 孟庆玲, 张再超, 杨丽红, 田振中, 蔡扩军, 陈创夫 申请人:石河子大学