一种单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的酶联免疫试剂盒，它包括盒体，所述盒体内设有自封袋和衬垫，所述自封袋内设有包被了抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体的酶标反应板，所述衬垫上设有数个容器孔，所述容器孔内分别设有阳性对照溶液、阴性对照溶液、10×浓缩洗涤液、显色液、终止液、酶标抗体溶液和酶标抗体稀释液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体。本实用新型的试剂盒可特异、高效地检测单核细胞增生性李斯特菌。
【专利说明】一种单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物技术和免疫学领域，具体涉及一种检测单核细胞增生性李斯特菌的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002]单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种短小的革兰氏阳性无芽胞兼性厌氧杆菌，是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是唯一对人致病的、典型的胞内寄生菌，可以导致严重的人畜共患传染病，如脑膜炎、败血症、流产和单核细胞增多等症状。1988年，世界卫生组织(World Health Organizat1n, WHO)发表“食源性李斯特菌病劝告书”，指导全世界各国如何预防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成为新的重要的食源性疾病病原菌，WHO将其与E.coli 0157、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。该菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香肠、加工禽类、生肉、鱼、虾、烟熏鱼、生蔬菜。
[0003]目前单核细胞增生李斯特菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以单核细胞增生李斯特菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及单核细胞增生性李斯特菌快速检测产品。
实用新型内容
[0004]本实用新型的目的是提供一种检测单核细胞增生性李斯特菌的检测试剂盒。
[0005]具体而言，本实用新型提供了一种单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，所述盒体内设有自封袋和衬垫，所述自封袋内设有包被了作为捕捉抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体的酶标反应板，所述衬垫上设有数个容器孔，所述容器孔内分别设有阳性对照溶液、阴性对照溶液、10X浓缩洗涤液、显色液、终止液、酶标抗体溶液和酶标抗体稀释液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的作为检测抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体。
[0006]在一优选例中，所述酶标反应板由支撑架和设于支撑架上的可拆卸式微孔条构成，所述微孔条上设有微孔，所述微孔中包被有作为捕捉抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体。
[0007]在另一优选例中，所述的作为捕捉抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系1B4E7A6C9，CGMCC N0.8765产生，所述作为检测抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系6D4H7C8B6，CGMCC N0.8002产生。
[0008]此外，在本实用新型的试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
[0009]本实用新型的酶联免疫试剂盒的检测原理及有益效果如下:
[0010]本实用新型的试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫法。当在酶标反应板微孔条上预包被抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体(捕捉抗体)时，加入样品溶液或标准品后，再加入辣根过氧化物酶标记的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体(检测抗体)，样品或标准品中存在的单核细胞增生性李斯特菌与酶标反应板上包被的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体相结合，加入检测抗体后，会形成“抗体一抗原一酶标抗体”复合物，经过TMB(四甲基联苯胺)显色后会形成黄色物质，从而判断样品中单核细胞增生性李斯特菌的存在与否以及存在的量。
[0011]用酶标仪于450nm下测定吸光度值。阴性对照彡0.1、阳性对照彡0.3，实验结果有效，否则结果判定为无效；检测孔OD值> 0.2时，判定为阳性；检测孔OD值介于0.1-0.2之间时，判定为弱阳性；检测孔OD值< 0.1判定为阴性。
[0012]试验表明，本实用新型的单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫试剂盒，有较高的灵敏度和准确度。板间误差小于5%，板内CV小于3%。与出血性大肠杆菌0157:H7、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等均无交叉反应。
[0013]总之，本实用新型的试剂盒对样品的前处理要求低，操作简便，检测极限为105cfu/ml，特异性和稳定性好，并与大多数食源性致病菌都没有交叉反应。
[0014]本实用新型各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本实用新型的特点、目的和优势将更为明显。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是本实用新型的检测试剂盒的结构示意图；
[0016]图2是本实用新型的检测试剂盒的酶标反应板的示意图。
[0017]附图标记释义:1.盒体；2.衬垫；3.容器孔；4.微孔板；5.支撑架；6.微孔条；
7.微孔。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0019]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本实用新型中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0020]实施例1.本实用新型的检测试剂盒的组成、制备及其应用
[0021]一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成(如图1、图2):
[0022](I)预包被抗体的酶标反应板(4):酶标反应板由支撑架(5)和设置在支撑架上的可拆卸式微孔条(6)构成，所述微孔条(6)上设有微孔(7)。用0.02M醋酸缓冲液(pH2.0)溶液稀释、抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9，CGMCC N0.8765包被96孔酶标反应板⑷上的微孔(7)，每孔ΙΟΟμ I。4°C孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤。酶标反应板装于铝箔自封袋内。
[0023](2)单核细胞增生性李斯特菌阳性对照标准品(灭活的单核细胞增生性李斯特菌菌液)一管和阴性对照标准品(李氏增菌肉汤)一管。
[0024](3)辣根过氧化物酶标记的抗单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体6D4H7C8B6, CGMCC N0.8002 溶液一管。
[0025](4)酶标抗体稀释液一管:0.0lM PBS，ρΗ7.6。
[0026](5) 1X浓缩洗涤液一管:含有0.5%吐温-20和0.2%叠氮钠的0.1M磷酸盐缓冲液，ρΗ7.4，使用时将浓缩洗液10倍稀释即可。
[0027](6)显色液A液一管,显色液B液一管。使用前将A液与B液等体积混合。
[0028](7)终止液一管:2Μ硫酸溶液。
[0029](8)设有数个容器孔(3)的衬垫(2)。
[0030]二、酶联免疫试剂盒中各组分的制备
[0031](一 )将单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9，CGMCC N0.8765作为捕捉抗体包被酶标反应板
[0032]用包被缓冲液将单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9稀释成5 μ g/ml，每孔加入100 μ I，4°C过夜，次日倾去包被液，用稀释好的洗液洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入220 μ I封闭液，37°C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝箔袋密封保存。
[0033]包被缓冲液:0.02M醋酸缓冲液，用5M HCl调节pH至2.0。
[0034]封闭液:含有0.3%牛血清白蛋白和10%蔗糖的0.0lM PBS0
[0035]( 二 )辣根过氧化物酶标记的单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6，CGMCCN0.8002 的制备
[0036]将单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是改良的过碘酸钠法，方法如下:
[0037]a、5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶解于0.5ml0.2M醋酸缓冲液(pH5.6)中。
[0038]b、加入现配制的 0.06M Na104 溶液 0.5ml，4°C氧化 20min。
[0039]C、加入含22% NaCl的0.4M乙二醇溶液0.5ml，室温静置30min。
[0040]d、用6ml预冷的无水乙醇沉淀酶，1500rpm离心lOmin。
[0041]e、去上清，将沉淀溶于2.5ml的0.0lM PBS (pH7.4)中。
[0042]f、加入1mg单克隆抗体GS2-D3，并立即用0.5M碳酸缓冲液(ρΗ9.6)调节pH至9.0。4°C静置过夜。
[0043]g、加入 10mg/ml 硼氢化钠 50 μ 1，4°C，静置 2h。
[0044]h、用 0.0lM PBS (ρΗ7.4) 4°C透析过夜。
[0045]1、纯化保存。
[0046]三、试剂盒的应用
[0047](一 )检测方法
[0048]1、样品前处理
[0049]取待检样品25g(ml)加入225ml李氏增菌肉汤于均质机下均质混匀，36°C ±1°C培养16h。将培养好的样品在100°C水浴中加热lOmin。取出冷却至室温待用。
[0050]2、用试剂盒检测
[0051]取出所需数量的微孔和所有试剂常温下放置30min。取200 μ I待检样品加到微孔中，37°C，孵育30min。倒去孔内液体，加入200 μ I洗液到每个微孔内，轻轻晃动数秒，快速翻转将微孔内液体倒尽，向一叠干净的吸水纸拍几下，如此重复操作共洗板3次。加入100 μ I酶标单克隆抗体6D4H7C8B6工作液，37°C，孵育60min。倒去孔内液体并洗板4次。将显色A液和显色B液等量混合配成底物显色液。每个微孔加入100 μ I的底物显色液，室温避光显色15-20min。加入终止液100 μ I，用酶标仪于450nm下测定吸光度值。
[0052]结果判定:阴性对照< 0.1、阳性对照彡0.3，实验结果有效，否则结果判定为无效；检测孔OD值彡0.2时，判定为阳性；检测孔OD值介于0.1-0.2之间时，判定为弱阳性；检测孔OD值< 0.1判定为阴性。
[0053]若无酶标仪，可用肉眼判定:阳性对照孔有肉眼可见的黄色，阴性对照孔无颜色，实验结果有效，否则判定为实验结果无效；当检测孔有明显肉眼可见的黄色时为阳性结果；有微弱黄色时，判定为弱阳性结果；无肉眼可见黄色时为阴性结果。
[0054]( 二)酶联免疫试剂盒效果的检测
[0055]1、试剂盒重复性和稳定性测试
[0056]板内精密度测试:取同一块酶标反应板上的6个微孔，用被单核细胞增生性李斯特菌污染过的牛奶进行测试，实验重复4次。
[0057]板间精密度测试:取同一批次的4块酶标反应板，用被单核细胞增生性李斯特菌污染过的牛奶进行测试，实验重复3次。
[0058]变异系数的计算方法:变异系数(CV)=测定结果的标准差与其平均值的百分比。
[0059]表1.板内重复性测试结果
[0060]
IlI ?L2 ?L3 ?L4 fl5 ?L6 板内 CV%^~? 0.573 0.567 058] 0.577 0581 0.5592.712
20.569 0.571 0.577 0.568 0,572 0.5712.214
30.564 0.563 0,571 0.581 0.582 0.5692.567
40.536 0.538 0.541 0.527 0.612 0.6022.349
[0061]表2.板间重复性测试结果
板I 板2板3板4板间CV (%)
? 0.52904710.4420.482234
[0062]
20.4610.4400.5330.4312.89
30.5670.4620.4220.5462.35
[0063]2、试剂盒交叉反应测试
[0064]用试剂盒去检测其他的食源性致病菌，验证试剂盒检测单核细胞增生性李斯特菌的特异性，观察是否与其他的致病菌有交叉反应和假阳性出现。
[0065]表3.试剂盒特异性测试菌种名称菌株编弓-吸光度值交叉反应
01出血性大肠杆菌 O丨57:H7ATCC 438950.0490.0510.0f1—
02出血性大肠杆|?-? OI57:H7ATCC43889().()570.0611).()72—
03阴沟肠杆菌CMCC (B) 45301().()7丨0.0710.074—
04粪肠球菌ATCC 292120.0770.0790.077—
05大肠埃希氏菌ATCC 87390.0750.0850.074—
06大肠埃希氏菌ATCC 259220.0770.0790.077—
07大肠埃希氏菌CMCC(B) 441020.0770.0750.0S5—
08大肠埃希氏菌80990.0770,0790.077—
09单增李斯特菌ATCC 432510.8710.8750.885+
单增李斯特菌ATCC 19115(λ77?^(?7?^0.874+
单增李斯特菌CMCC (B) 541)1)20.7770.7790.777+
单增李斯特菌ATCC 139320.7770.7790.777+
13单增李斯特菌ATCC 1?)!120.7770.7890.787+
14单增李斯特菌ATCC 191140.6950.7890.7Η7+
15单增李斯特菌ATCC 191160.6940.6950.695+
[0066] 16 单增李斯特菌AICC 191170.7870.7850.695+
17单增李斯特菌ATCC 19 丨丨50.6970.6970.699+
18单增李斯特菌ATCC 191110.6970.69*)0.697+
IV 伊氏李斯特氏菌ATCC 19 丨 190.0810.0850.085+
20格氏李斯特氏菌ATCC 2541)10.1)870.0890.087+
21威氏李斯特氏菌Α._’(Χ 358970.081?.0850.0S5+
22无害单增李斯特菌CICC 102970.0850.0850.087+
23肠炎沙门氏菌ATCC 130760.0810.0810.084—
24猪霍乱沙门氏菌CICC 214930.0870.0870.087—
~25 鼠伤寒沙门氏菌CMCC (B) 50115~0,0870,0890.087=
26鼠伤寒沙门氏菌CTCC 229560.0860.0850.087—
27鼠伤寒沙门氏菌ATCC 140280.0810.0850.085—
屮型副伤寒沙门氏菌CMCC (B) 50093~0.081 ~0.0810.084-
29 乙型副伤寒沙门氏菌CMCC (B) 500940.0870.0890.087—
伤寒沙门氏菌CMCC (B) 50071~0.0870.0890.087二
31 圣保罗沙门氏菌IQCC 105290.0860.0850.087—
^2 海徳堡沙门氏菌TQCC105310,0710,0750.075=
33肯塔基沙门氏菌IQCC 105300,0710,0710.074—
34布洛克利沙门氏菌IQCC105320.0770.0790.077—
35阿伯丁沙门氏菌IQCC1051 丨0.0770.0790.077—
^6 乙型副伤寒沙f j 氏菌IQCC 105040.0760.0750.077=
37都柏林沙门氏菌IQCC 105230.0710.0750.075—
38鹈沙门氏菌IQCC105090.0710.0710.074—
39病牛沙门氏菌IQCC 105100.0770.0790.077—
40甲型副伤寒沙门氏菌IQCC 105180.0770.0790.077—
鸡沙门氏菌'IQCC 105250.0760.0750.077=
42 火鸡沙门氏菌IQCC 105260.0710.0750.075—
丙型副伤寒沙门氏菌IQCC 105270.0710.0710.074=
^4 肠炎沙门氏菌IQCC 105280.0770.0790.077二
^5 甲型副伤寒沙门氏菌IQCC 105800.0870.0890.087二
"^6 甲型副伤寒沙f j 氏菌TQCC 305370.0860.0850.087二
^7 甲型副伤寒沙门氏菌IQCC 305380.0810.0810.084=
48乙型副伤寒沙门氏菌CMCC 500040.0870.0890.087—
49丙型副伤寒沙门氏菌CMCC 501180.0870.0890.087—
[0067] 50 福氏志贺ATCC 120220.0860.0850.087—
宋内氏志贺ATCC 259310.0860.0850.087=
52 单核细胞增生性李期特菌ATCC 87000.0860.0850.087—
单核细胞增生性李斯特菌ATCC 92070.0820.0880.089二
~^4~单核细胞增生性李斯特菌CMCC 513460.0870.0890.087=
~^5 痢疾志贺氏菌CMCC (B) 51105~0.0860.0850.087二
~~56 糊疾志贺氏歯野生分离株0.0820.0880.089=
57 福氏志贺氏菌CMCC (B) 515720.0870.0890.087—
^8 福氏志贺氏菌ATCC 120220.0810.0860.081=
59宋内氏志贺氏菌CMCC (B) 515920.0810.0860.081—
60宋内氏志贺氏菌ATCC 259310.0820.085?.080—
^61 副溶血弧歯ATCC 178020.0810.0850.088=
62单核细胞增生性李斯特菌ATCC 290040,0810.0800.088—
63单核细胞增生性李斯特菌ATCC 295540.0870.0890.086一
^~64~举核细胞增生性李斯特菌ATCC 128580.0S70.0890.086
65小肠耶尔森氏菌AICX’237150.0890.0820.087—
66小肠耶尔森氏歯CMCC 522070.0870.0890.086—
67小肠耶尔森氏菌CMCC (B) 522040.0890.0820.087—
68乙型溶血性链球菌 ATCC 210590.0840.0870.081—
69乙型溶血性链球菌 ATCC 210600.0870.0890.086—
70蜡样芽孢杆菌 ATCC 117780.0870.0850.086—
71蜡样芽孢杆菌CMCC (B) 633010.0870.0890.086—
72蜡样芽孢杆菌CMCC (B) 633030.0870.0850.086—
[0〇68] 73金黄色葡萄球菌 ATCC 65380.0870.0850.086—
74金黄色葡萄球菌 ATCC 259230,0890.0850.086—
75金黄色葡萄球菌 ATCC 232130.0870.0890.086—
76金黄色葡萄球菌 ATCC 276600.0850.0850.086一
77表皮葡萄球菌CMCC (B) 260690.0830.0850.086—
78空肠弯曲菌 CICC 229370.0890.0860.087—
[0069]注“ + ”表示检测结果呈阳性；“一”表示检测结果为阴性。
[0070]3、试剂盒保存期实验
[0071]试剂盒保存条件为2—8°C，经过12个月后，试剂盒的检测结果与新批次的试剂盒结果一致。考虑到运输和使用过程中会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存的条件下放置8天，进行加速老化试验，结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。因此试剂盒可以在2 — 8°C至少可以保存12个月以上。
[0072]在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，其特征在于，所述盒体内设有自封袋和衬垫，所述自封袋内设有包被了作为捕捉抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体的酶标反应板，所述衬垫上设有数个容器孔，所述容器孔内分别设有阳性对照溶液、阴性对照溶液、1X浓缩洗涤液、显色液、终止液、酶标抗体溶液和酶标抗体稀释液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的作为检测抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标反应板由支撑架和设于支撑架上的可拆卸式微孔条构成，所述微孔条上设有微孔，所述微孔中包被有作为捕捉抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体。
【文档编号】G01N33/577GK203941171SQ201420271796
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】刘箐, 郭慧琴, 吴淑燕 申请人:上海理工大学