专利名称：一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及采用细胞化学分析方法进行细菌分类的 方法。
背景技术：
早期的细菌学分类主要是采用以形态培养特征和生理生化特征为依据的传统细 菌学分类方法，直到现在形态特征和生理生化特征仍是细菌分类学的基石。但是由于细菌 的这种表面特征往往受很多人为因素的影响与限制，特别是人们主观判断的差异反而难以 反映出细菌的自然亲缘关系，这就体现了只建立在形态特征和生理生化特征基础上的传统 分类学的局限性。因此，Colweel提出了一个新的细菌分类学术语“多相分类(Polyphasic taxonomy)”，它是指综合利用微生物多种不同信息，包括表型和基因型的信息进行分类的 方法。在当时的技术条件下，实际上就是在原来分类的基础上更多的融入了化学分类的内 容。从70年代开始，化学分类被各国细菌分类学者所接受，逐步建立起一整套细胞化学分 析方法，如细胞壁化学组分、磷酸类脂、醌、枝菌酸、脂肪酸分析等。分子分类和系统发育信 息丰富了多相分类的内容，共同推动细菌分类向着自然分类系统靠近。应用于分类的分子 指标主要为DNA和RNA，而DNA同源性分析是确定正确的分类地位，建立自然分类系统的最 直接的方法。此类方法简便易行，分辨率高，在细菌系统分类学研究中起着越来越重要的作 用，然而分子分类的方法比化学分类的方法复杂，要求高，仪器操作精度要求较高。因此，化 学分析法更好更容易地应用于细菌分类学中。类脂是构成细胞的主要成分之一，脂类是细胞膜的主要组分。脂肪酸分析是化学 分类的重要指标之一。不同种属的细菌，其脂肪酸的组成和含量也表现出不同程度的差异， 并且这种差异是比较稳定的。脂肪酸分析具有快速、方便、自动化程度高的特点、适用于大 量菌株的快速分析。脂肪酸组分一般较为复杂，分别归属三种类型直链、支链和复杂形式 的脂肪酸。脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团等在细菌中具有分类学意义。脂肪酸 定性分析结果应用于属与属以上的分类水平；脂肪酸的定量分析结果可以为种和亚种分类 提供有用的基本资料。因此，利用气相色谱质谱分析方法(GC-MS)对细菌的脂肪酸进行分 析识别，不仅可以打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分类带来的误差， 同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具。
发明内容
本发明气相色谱质谱分析方法分析李斯特菌属标准菌株，得到了它们精确的脂肪 酸总离子流色谱图和相应的质谱图。通过脂肪酸甲酯的组成成分，可以获得不同李斯特菌 的脂肪酸信息并通过这个信息而对李斯特菌进行分类。本发明的方法包括以下步骤(1)在IOmL的灭菌李斯特菌EB培养液中加入李斯特菌，在37°C下培养Id ；(2)用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌， 在无菌条件下挑取单个典型菌落接种于IOmL的灭菌EB培养液中，在37°C下培养Id ；
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(3)在200mL EB培养液中加入由单个典型菌落培养的李斯特菌菌悬液200 μ L，在 37°C下140r/min转速下摇床培养l_2d ；(4)在经摇床培养的200mL菌悬液中加入3%的甲醛0. 6mL并摇勻，静置Id ；(5)把经甲醛处理后的200mL菌悬液平均分装在6个离心管中并平衡重量，在 3500r/min转速下离心lOmin，弃去上清后，重复洗涤3次，洗涤完成后，将菌体收集到小指 管中，加入适当的蒸馏水，平衡重量，在6000r/min转速下离心，去掉部分上清，所述的洗涤 步骤是加入IOmL蒸馏水于离心管中，涡旋震荡使菌分布均勻，在3500r/min转速下离心 lOmin，弃去上清；(6)从步骤(5)制得的菌体中取100 μ L菌体于玻璃离心管中，加入2mL盐酸和甲 醇的混合液，其中盐酸和甲醇的体积比是11 50，并摇勻、密封，放入烘箱在100°C下反应 3h直至液体颜色变为棕红色；(7)取出在烘箱内反应制得的棕红色液体冷却至室温，加入1.5mL正己烷，涡旋震 荡至充分混合，在3500r/min转速下离心lOmin，取上清，向下层溶液中再加入1. 5mL正己 烷，在3500r/min转速下离心lOmin，取上清，合并两次所取上清，向合并的上清中加入2mL 蒸馏水，涡旋震荡至充分混合，在3500r/min转速下离心lOmin，再取上清；(8)把步骤(7)制得的上清在流动氮气下吹干，用0. 5mL甲醇溶解吹干制得的脂肪 酸并装入进样瓶；(9)对进样瓶中的脂肪酸进行气相色谱质谱分析。在进行气相色谱质谱分析之前，还可以包括对流动氮气下吹干制得的脂肪酸进行 纯化的步骤(a)把流动氮气吹干制得的脂肪酸用100 μ L三氯甲烷溶解，再用毛细玻璃管蘸取 样品直接以打点成线的形式点样于尺寸50X200的硅胶G板，每点一次都用吹风机吹干再 点，直至样品全部点完，其中点样距离距硅胶G板下沿1. 5cm，板左右两边各留2cm ；(b)向层析缸中加入20mL体积比1 1的正己烷和无水二乙醚的混合液的展开 剂，放入已经点样的硅胶G板，当展开剂扩展到距硅胶G板上沿1-1. 5cm时迅速取出后，在 通风橱中吹干；(c)吹干后在紫外线下将带有荧光的脂肪酸甲酯的亮带刮下并收集于离心管中， 然后加入2mL无水二乙醚，充分震荡摇勻，在3500r/min转速下离心lOmin，收集上清，再次 加入2mL无水二乙醚，充分震荡摇勻，在3500r/min转速下离心lOmin，收集上清，合并两次 所获上清，把上清液用流动氮气吹干。由于本发明针对的菌种是致病菌，因而在收集菌体的过程中需要对菌体进行灭活 以安全的进行下一步的操作，这样可以确保实验人员的安全。本发明通过对菌体灭活条件 的摸索，最终采用3%的甲醛溶液0. 6mL/200mL菌悬液是最安全和理想的用量。由于各种脂质物质进行气相色谱质谱分析之前，必须首先加以甲酯化处理，才可 以在毛细管柱上被吸附和展开，在载气吹送下运动，才能达到检测的效果。因而本发明在脂 肪酸进样之前对脂肪酸进行甲酯化处理。本发明通过对标准菌株甲酯化的方法进行分析研 究，采用盐酸和甲醇的混合液进行甲酯化处理能提高最终的检测精度。本发明的方法不仅可以打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分 类带来的误差，同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具，而且还能够应用该
4方法从其他细菌和食品中鉴定李斯特菌。说明书附1单核细胞增生李斯特菌ATCC 15313脂肪酸总离子流色谱2绵羊李斯特菌ATCC 19119脂肪酸总离子流色谱3格氏李斯特菌ATCC 25401脂肪酸总离子流色谱4英诺克李斯特菌ATCC 33090脂肪酸总离子流色谱5威尔斯李斯特菌ATCC35897脂肪酸总离子流色谱6西尔李斯特菌ATCC 35967脂肪酸总离子流色谱图
具体实施例方式采用本发明方法分析了来自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection, ATCC)的六种李斯特菌属标准菌株李斯特菌菌株。表1-1李斯特菌属菌株的来源及编号Table I-IThe origin and code of Listeria
权利要求
一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法，包括以下步骤(1)在10mL的灭菌李斯特菌EB培养液中加入李斯特菌，在37℃下培养1d；(2)用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌，在无菌条件下挑取单个典型菌落接种于10mL的灭菌EB培养液中，在37℃下培养1d；(3)在200mL EB培养液中加入由单个典型菌落培养的李斯特菌菌悬液200μL，在37℃下140r/min转速下摇床培养1 2d；(4)在经摇床培养的200mL菌悬液中加入3％的甲醛0.6mL并摇匀，静置1d；(5)把经甲醛处理后的200mL菌悬液平均分装在6个离心管中并平衡重量，在3500r/min转速下离心10min，弃去上清后，重复洗涤3次，洗涤完成后，将菌体收集到小指管中，加入适当的蒸馏水，平衡重量，在6000r/min转速下离心，去掉部分上清，所述的洗涤步骤是加入10mL蒸馏水于离心管中，涡旋震荡使菌分布均匀，在3500r/min转速下离心10min，弃去上清；(6)从步骤(5)制得的菌体中取100μL菌体于玻璃离心管中，加入2mL盐酸和甲醇的混合液，其中盐酸和甲醇的体积比是11∶50，并摇匀、密封，放入烘箱在100℃下反应3h直至液体颜色变为棕红色；(7)取出在烘箱内反应制得的棕红色液体冷却至室温，加入1.5mL正己烷，涡旋震荡至充分混合，在3500r/min转速下离心10min，取上清，向下层溶液中再加入1.5mL正己烷，在3500r/min转速下离心10min，取上清，合并两次所取上清，向合并的上清中加入2mL蒸馏水，涡旋震荡至充分混合，在3500r/min转速下离心10min，再取上清；(8)把步骤(7)制得的上清在流动氮气下吹干，用0.5mL甲醇溶解吹干制得的脂肪酸并装入进样瓶；(9)对进样瓶中的脂肪酸进行气相色谱质谱分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在进行气相色谱质谱分析之前，还包括对流 动氮气下吹干制得的脂肪酸进行纯化的步骤(a)把流动氮气吹干制得的脂肪酸用IOOyL三氯甲烷溶解，再用毛细玻璃管蘸取样品 直接以打点成线的形式点样于尺寸50X200的硅胶G板，每点一次都用吹风机吹干再点，直 至样品全部点完，其中点样距离距硅胶G板下沿1. 5cm，板左右两边各留2cm ；(b)向层析缸中加入20mL体积比1 1的正己烷和无水二乙醚的混合液的展开剂，放 入已经点样的硅胶G板，当展开剂扩展到距硅胶G板上沿1-1. 5cm时迅速取出后，在通风橱 中吹干；(c)吹干后在紫外线下将带有荧光的脂肪酸甲酯的亮带刮下并收集于离心管中，然后 加入2mL无水二乙醚，充分震荡摇勻，在3500r/min转速下离心lOmin，收集上清，再次加入 2mL无水二乙醚，充分震荡摇勻，在3500r/min转速下离心lOmin，收集上清，合并两次所获 上清，把上清液用流动氮气吹干。
全文摘要
一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法，属于生物工程技术领域，特别涉及采用细胞化学分析方法进行细菌分类的方法，主要包括以下步骤，李斯特菌复壮，用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌，培养单个典型菌落的李斯特菌并制成菌悬液，用甲醛灭活处理，把经甲醛处理后的菌悬液平均分装在离心管洗涤，用盐酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。本发明的方法不仅可以打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分类带来的误差，同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具，而且还能够应用该方法从其他细菌和食品中鉴定李斯特菌。
文档编号G01N30/02GK101936960SQ200910157210
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者冯汉利, 徐家文, 徐新生, 曾宪东, 李家勇, 李晶, 王振华, 赵晖, 郭明星, 郭爱玲, 陈建军 申请人:湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心