一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法
【专利摘要】一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法，属于生物活性肽的制备纯化领域，本发明从真实细菌中提取细胞膜脂，并利用该膜脂在离体条件下组装模拟细胞膜。蛋白双酶水解后制备含抗菌肽的组分，采用模拟细胞膜亲和固定相吸附结合高效液相-质谱技术快速筛选、鉴定及分离纯化蛋白水解源抗菌肽；本发明的分离纯化方法采用细菌膜脂构建模拟细胞膜，并用此膜亲和吸附抗菌肽，整个分离过程仅涉及亲和吸附和RP-HPLC两个步骤，同传统的多步色谱分离抗菌肽的方法相比，具有操作简单，快速高效的优点，同时克服了真实细胞膜色谱中细胞膜易失活的缺点。本发明方法的建立为快速、高通量筛选新型、高纯抗菌肽提供了一条方便快捷的途径。
【专利说明】一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物活性肽的制备纯化领域，涉及一种利用来源于细菌细胞膜脂的模拟细胞膜亲和吸附联用质谱技术快速筛选抗菌肽的工艺，能够实现抗菌肽的靶向性快速筛选及分离鉴定，达到了提高抗菌肽分离纯化效率的目的。
【背景技术】
[0002]抗生素在世界范围内的持续使用已造成了多种抗性菌株的产生，成为全球公共卫生问题。抗菌肽以微生物的细胞膜为靶目标，引起细胞膜的裂解从而导致细胞死亡，具有广谱抗菌活性，且不易产生耐药性，可用于医药、食品、饲料加工业等领域，具有极大的开发应用前景。而目前在抗菌肽的生产方面存在一些问题:直接提取工艺繁琐，成本昂贵，且天然资源有限；化学合成法成本太高，产业化不易实现，同时难以保证合成肽类的生物活性；基因工程方法虽然使获得大量、廉价抗菌肽成为可能，但在实际操作中发现其获得的抗菌肽因空间结构上的差异而导致抗菌能力较弱，常用的细菌表达体系表达产量不高等缺点，因此，如何实现抗菌肽的高通量筛选，是抗菌肽生产和应用亟待解决的问题。
[0003]大多数已知的抗菌肽发挥其杀菌、抑菌作用的首要步骤均是与细菌细胞膜的吸附结合，通过其疏水性残基与细菌细胞膜的脂质双分子层相互作用，即抗菌肽与细菌细胞膜间同样存在着特异性的亲和作用。已有基于高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学的原理，利用模拟细胞膜(Mimic cell Membrane, MCM)研究抗菌肽与膜受体相互作用的相关报道，因此将模拟细胞膜应用于抗菌肽的快速、高效筛选理论上是可行的。
[0004]目前最常见的模拟细胞膜是由单一或有限种类的磷脂或磷脂类似物制备而成。因其能在水中自发形成模拟真实生物膜的脂双层结构，且具备生物膜的流动性特征，同时克服了真实细胞膜在操作过程中易失活的缺点，因此一直以来被研究者用作真实细胞膜的常用模型。然而抗菌肽在发挥作用的过程中，其吸附结合的真实细菌细胞膜中的磷脂构成、含量、电荷状态等远比目前广泛应用的模拟细胞膜复杂得多。基于真实细菌细胞膜的复杂性，可将其膜脂组分提取出来，在离体`条件下将其组装成模拟膜。采用来源于真实细菌的细胞膜脂构建的模拟细胞膜可更加真实的反应抗菌肽与细菌细胞膜脂之间的相互作用，同时克服了真实细胞膜在操作过程中易失活的缺点。目前，国内外尚未见采用来源于细菌的细胞膜脂构建的模拟细胞膜来筛选抗菌的肽相关文献报道。
[0005]本专利基于模拟细胞膜与抗菌肽的作用原理，采用细菌细胞膜脂构建模拟细胞膜固定相和色谱柱，同时结合质谱技术快速筛选抗菌肽。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的工艺，包括如下步骤:
[0007](I)将经三代试管斜面活化培养的细菌转接入液体培养基中培养至对数期，离心弃培养基取得菌体，无菌水清洗菌体数次以除去残留培养基；[0008](2)将步骤⑵中得到的菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液(25mM，pH7.5)中，向此菌悬液中加入氯仿-甲醇(1: 2，V / V)混合溶液，室温下搅拌60~90min后，依次加入等体积氯仿和无菌水，继续搅拌20min~30min,收集氯仿提取物,旋蒸除去氯仿,通氮气除去残留溶剂，得到细菌细胞膜脂；
[0009](3)硅胶在20% HCl中回流6~10h，用去离子水洗至中性，110~120°C干燥，制得活化硅胶；
[0010](4)将步骤⑵中得到的细菌细胞膜脂溶于氯仿/甲醇(19: Lv / V)中，将步骤(3)中得到的活化硅胶加入到上述溶液中，4°C振摇30~60min，旋转蒸发除去溶剂，通氮气除去残留溶剂，细胞膜脂即包覆在硅胶表面形成干的细胞膜脂薄膜，将其用pH7.2的IOmM磷酸盐缓冲液溶胀6h~10h，细胞膜脂自发形成模拟细胞膜脂质体，上清液离心去除，用磷酸盐缓冲液洗涤包裹有模拟细胞膜的硅胶，至洗涤液中无磷检出为止，离心沉降物即为细菌膜脂源模拟细胞膜亲和固定相；
[0011](5)将蛋白以两种蛋白酶进行复合酶解，控制料液比1: 8~1: 20，37~60°C下调节ρΗ2.0~9.0，水解结束后，调回pH到6.8~7.0，100°C煮沸灭酶lOmin，随后将其快
速冷却至室温；
[0012](6)将步骤(5)中所得蛋白酶解液进行离心操作，离心条件为:温度4~25°C，时间10~15min，转速8000~12000r，离心结束后，取上清液，经IOODa透析袋透析，再将其置于预冷温度为_86°C超低温冰箱中预冻，预冻时间为2~6h，随后进行真空冷冻干燥，设置参数为-55~-45°C，压力0.03~0.2mBar，冻干时间为48~72h，冻干粉配成等浓度溶液进行抗菌试验，取抗菌能力最好的组分_20°C保存留用；
[0013](7)将步骤(4)中得到模拟细胞膜亲和固定相和抗菌能力最强的蛋白酶解物组分混合置于2~50ml离心管中，25~37°C下保温孵育30~120min，离心后留取上清液，沉淀用缓冲液淋洗6~10次，保留洗涤液，合并洗涤液和上清液，并命名为模拟细胞膜吸附后流出液，利用高效液相-质谱技术检测抗菌能力最强的蛋白酶解物组分和模拟细胞膜吸附后流出液的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积减小的差异峰，并对其进行抗菌能力验证和肽序分析，制备得到的差异峰即为抗菌肽。
[0014]本发明方法的优点:
[0015]1、本专利技术是以细菌膜脂构建的模拟细胞膜亲和吸附技术为核心技术，特别强调的是，将该技术应用于抗菌肽的筛选鉴定中，其优势突出体现在:(I)采用模拟细胞膜克服了真实细胞膜在操作中易失活的缺点；(2)该模拟细胞膜采用细菌细胞膜脂构建，其磷脂构成、特性最大程度接近于真实细胞膜；(3)该法可提高抗菌肽筛选的靶向性，即通过比较模拟细胞膜吸附前后的差异峰，快速锁定具有抗菌活性的目标组分，大大简化了活性肽的分离纯化步骤，降低生产成本。
[0016]2、本专利技术可以各种蛋白为原料，产品来源广泛，成本低廉，可适用于食品工业副产品的增值化开发。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属【技术领域】的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
[0018] 实施例1大肠杆菌膜脂源模拟细胞膜快速筛选鸡蛋卵清蛋白胃、胰蛋白酶复合酶解液中的抗菌肽
[0019]将培养至对数期的大肠杆菌液体培养物1500ml，5000r / min离心15min，弃培养基得菌体。菌体用无菌水清洗8次，以除去培养基残留物。将清洗干净的菌体重悬于60mlTris-HCl缓冲液(25mM，pH7.5)中。向此菌悬液中加入60ml氯仿-甲醇(I: 2,V / V)混合溶液。室温下搅拌90min后,依次加入30ml氯仿和无菌水,继续搅拌20min。收集氯仿提取物，旋蒸除去氯仿，通氮气除去残留溶剂，得到大肠杆菌细胞膜脂。将该膜脂溶于60ml氯仿/甲醇(19:1, V / V)中。0.2g活化硅胶加入到上述溶液中，4°C振摇45min。旋转蒸发除去溶剂，采用氮气除去残留溶剂，细胞膜脂即包覆在硅胶表面形成干的细胞膜脂薄膜。硅胶-细胞膜脂干物质，用PH7.2的IOmM磷酸盐缓冲液溶胀6h，细胞膜脂自发形成模拟细胞膜脂质体。上清液离心(1000g，IOmin)去除，用磷酸盐缓冲液洗涤包裹有模拟细胞膜的硅胶，至洗涤液中无磷检出为止，得到大肠杆菌膜脂源模拟细胞膜固定相。鸡蛋卵清蛋白按料液比1: 20配成悬浊液，利用胃蛋白酶(37°C，pH2.0)和胰蛋白酶(37°C，pH7.5)先后各酶解lh，反应结束后调回pH到7.0,100°C煮沸灭酶lOmin。随后将其快速冷却至室温。4°C条件下12000r离心15min。上清液经IOODa透析袋透析,置于_86°C超低温冰箱中预冻，随后将其置于真空冷冻干燥机中冻干(_45°C，0.016mBar, 48h)。水解物的冻干粉配成IOmg /ml溶液进行抗菌试验。取抗菌能力最好的组分与模拟细胞膜固定相混合置于IOml离心管中，37°C下保温孵育120min，离心后留取上清液。沉淀用缓冲液清洗10次，保留洗涤液。合并洗涤液和上清液，作为模拟细胞膜吸附后流出液。将抗菌能力最强的蛋白酶解物组分和模拟细胞膜吸附后流出液，利用高效液相-质谱技术，检测其指纹图谱，纯化制备差异峰，并对其进行抗菌能力验证和肽序分析，制备得到的差异峰即为抗菌肽。
[0020]实施例2金黄色葡萄球菌膜脂源模拟细胞膜快速筛选乳清蛋白碱性、木瓜蛋白酶复合酶解液中的抗菌肽
[0021]将培养至对数期的金黄色葡萄球菌液体培养物2000mi，8000r / min离心lOmin，弃培养基得菌体。菌体用无菌水清洗6次，以除去培养基残留物。将清洗干净的菌体重悬于50mlTris-HCl缓冲液(25mM，pH7.5)中。向此菌悬液中加入50ml氯仿-甲醇(I: 2, V /V)混合溶液。室温下搅拌60min后,依次加入25ml氯仿和无菌水,继续搅拌30min。收集氯仿提取物，旋蒸除去氯仿，通氮气除去残留溶剂，得到金黄色葡萄菌细胞膜脂。将该膜脂溶于50ml氯仿/甲醇(19: I, V / V)中。0.1g活化硅胶加入到上述溶液中，4°C振摇60min。旋转蒸发除去溶剂，采用氮气除去残留溶剂，细胞膜脂即包覆在硅胶表面形成干的细胞膜脂薄膜。硅胶-细胞膜脂干物质，用PH7.2的IOmM磷酸盐缓冲液溶胀10h，细胞膜脂自发形成模拟细胞膜脂质体。上清液离心(2000g，8min)去除，用磷酸盐缓冲液洗涤包裹有模拟细胞膜的硅胶，至洗涤液中无磷检出为止，得到金黄色葡萄球菌膜脂源模拟细胞膜固定相。乳清蛋白按料液比1: 20配成悬浊液，利用碱性蛋白酶(60°C，pH9.0)和木瓜蛋白酶(55°C，pH6.5)先后各酶解2h，反应结束后调回pH到7.0,100°C煮沸灭酶lOmin。随后将其快速冷却至室温。25°C条件下1000Or离心lOmin。上清液经IOODa透析袋透析,置于-86°C超低温冰箱中预冻，随后将其置于真空冷冻干燥机中冻干(_50°C，0.01OmBar, 72h)。水解物的冻干粉配成8mg / ml溶液进行抗菌试验。取抗菌能力最好的组分与模拟细胞膜固定相混合置于50ml离心管中， 30°C下保温孵育180min，离心后留取上清液。沉淀用缓冲液清洗8次，保留洗涤液。合并洗涤液和上清液，作为模拟细胞膜吸附后流出液。将抗菌能力最强的蛋白酶解物组分和模拟细胞膜吸附后流出液，利用高效液相-质谱技术，检测其指纹图谱，纯化制备差异峰，并对其进行抗菌能力验证和肽序分析，制备得到的差异峰即为抗菌肽。
【权利要求】
1.一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法，其特征在于以细菌膜脂构建模拟细胞膜亲和固定相，再将蛋白进行双酶复合酶解，最后采用模拟细胞膜亲和吸附及高效液相色谱-质谱技术快速筛选鉴定抗菌肽，具体工艺如下: (1)将经三代试管斜面活化培养的细菌转接入液体培养基中培养至对数期，离心弃培养基取得菌体，无菌水清洗菌体数次以除去残留培养基； (2)将步骤⑵中得到的菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液(25mM，pH7.5)中，向此菌悬液中加入氯仿-甲醇(1: 2，V / V)混合溶液，室温下搅拌60~90min后，依次加入等体积氯仿和无菌水，继续搅拌20min~30min,收集氯仿提取物,旋蒸除去氯仿,通氮气除去残留溶剂，得到细菌细胞膜脂； (3)硅胶在20%HCl中回流6~10h，用去离子水洗至中性，110~120°C干燥，制得活化硅胶； (4)将步骤(2)中得到的细菌细胞膜脂溶于氯仿/甲醇(19: Lv / V)中，将步骤(3)中得到的活化硅胶加入到上述溶液中，4°C振摇30~60min，旋转蒸发除去溶剂，通氮气除去残留溶剂，细胞膜脂即包覆在硅胶表面形成干的细胞膜脂薄膜，将其用PH7.2的IOmM磷酸盐缓冲液溶胀6h~10h，细胞膜脂自发形成模拟细胞膜脂质体，上清液离心去除，用磷酸盐缓冲液洗涤包裹有模拟细胞膜的硅胶，至洗涤液中无磷检出为止，离心沉降物即为细菌膜脂源模拟细胞膜亲和固定相； (5)将蛋白以两种蛋白酶进行复合酶解，控制料液比1: 8~1: 20，37~60°C下调节ρΗ2.0~9.0，酶解结束 后，调回pH到6.8~7.0,100°C煮沸灭酶lOmin，随后将其快速冷却至室温； (6)将步骤(5)中所得蛋白酶解液进行离心操作，离心条件为:温度4~25°C，时间10~15min，转速8000~12000r，离心结束后，取上清液，经IOODa透析袋透析，再将其置于预冷温度为-86°C超低温冰箱中预冻，预冻时间为2~6h，随后进行真空冷冻干燥，设置参数为-55~-45°C，压力0.03~0.2mBar，冻干时间为48~72h，冻干粉配成等浓度溶液进行抗菌试验，取抗菌能力最好的组分_20°C保存留用； (7)将步骤(4)中得到模拟细胞膜亲和固定相和抗菌能力最强的蛋白酶解物组分混合置于2~50ml离心管中，25~37°C下保温孵育30~120min，离心后留取上清液，沉淀用缓冲液淋洗6~10次，保留洗涤液，合并洗涤液和上清液，并命名为模拟细胞膜吸附后流出液，利用高效液相-质谱技术检测抗菌能力最强的蛋白酶解物组分和模拟细胞膜吸附后流出液的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积减小的差异峰，并对其进行抗菌能力验证和肽序分析，制备得到的差异峰即为抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的利用细菌膜脂构建的模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法，其特征在于:模拟细胞膜系采用真实细菌的细胞膜脂构建，所用细菌是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌中的一种。
【文档编号】C12Q1/37GK103642896SQ201310664134
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】张晖, 唐文婷, 齐希光, 王立, 钱海峰 申请人:江南大学