专利名称：基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法
技术领域：
本发明属于一种基于磷脂分子修饰纳米金颗粒团聚的生物分析技术，其具体涉及基于磷脂分子修饰纳米金颗粒方法；磷脂分子修饰纳米金颗粒与磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的特异反应；特定磷脂分子的绑定蛋白标记纳米金颗粒；磷脂分子修饰纳米金颗粒与蛋白标记的纳米金颗粒发生的团聚反应引起紫外可见吸收光度的变化，可定量分析检测磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂，及其在实际分析中的应用。
背景技术：
磷酸脂酶及其抑制剂等的快速筛选与检测对于生物学研究、食品与公共安全、药毒物分析、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的酶及其抑制剂的检测方法主要有放射性标记法、荧光标记法以及测定酶蛋白的免疫活性等。这些检测方法或存在反应步骤复杂问题，或灵敏度不高、可靠性差，又或需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，建立了一种基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的生物传感方法。该方法可将磷脂分子直接作用于纳米金表面，操作快速、简单，通用性强，灵敏度高。本发明的技术方案是基于不同磷脂分子修饰的纳米金颗粒，与其相应的磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂发生特异反应，此反应后的纳米金颗粒与特定磷脂分子的绑定蛋白所标记的纳米金颗粒发生团聚反应，引起紫外可见吸收光强度的变化，可定量分析检测磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂。其步骤包括(I)磷脂分子修饰纳米金颗粒；(2)磷脂分子修饰纳米金颗粒与酶及其抑制剂的特异反应；(3)与磷酸分子对应的磷脂分子绑定蛋白标记纳米金颗粒；(4)经步骤(2)特异反应后的纳米金与步骤(3)蛋白标记的纳米金混合反应；(5)定量分析检测酶及其抑制剂。其中，所述的酶及其抑制剂是磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂；其中，所述的磷脂分子为PIP2，PIP3，DPPC等；其中，步骤(I)所述磷脂分子修饰纳米金颗粒是直接合成带有表面活性剂修饰的纳米金颗粒，再将含磷脂分子溶液加入到修饰表面活性剂的纳米金溶液中，于纳米金表面直接形成单分子磷脂层。表面活性剂修饰的纳米金颗粒表面可以直接修饰各种不同的磷脂分子(PIP2，PIP3，DPPC等)形成单分子磷脂层，此时的纳米金颗粒可与磷脂分子对应各种不同的磷酸激酶、去磷酸化酶等(PI3K，PTEN，PLD等)及其抑制剂发生特异反应，产生团聚现象，实现对磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的检测；
其中，步骤(3)中与修饰的不同磷脂分子对应的磷脂分子绑定蛋白直接标记于纳米金颗粒表面。以下对本发明做出进一步说明。I、磷脂分子修饰纳米金颗粒及其与磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的特异反a、冰水浴中新鲜配制的O. IM NaBH4在搅拌状态下加入到4% HAuCl4与O. OlM柠檬酸钠混合物中，制备成种子液备用。4% HAuCl4溶液中加入表面活性剂，搅拌状态下加热制成生长液。将种子液加入到生长液中，搅拌混合，制备成合适尺寸的表面修饰表面活性剂的纳米金溶液。将合成好的纳米金溶液与PB (50mM ；pH = 7. 4)以体积比I : 2的比例混合后，浓缩离心洗漆三次(4°C ；10000r/min ；15min) b、将不同的磷脂分子溶液加入到a溶液中，持续搅拌，使磷脂分子直接修饰到纳米金颗粒上。C、在磷脂分子修饰纳米金溶液加入牛血清蛋白(BSA)于37°C恒温水浴下封闭 IOmin,再将酶及其抑制剂加入此纳米金溶液中，30°C恒温水浴反应。2、与磷酸分子对应的磷脂分子绑定蛋白标记纳米金颗粒a、250ml超纯水中加入2. 5ml I % HAuCl4加热沸腾后，再加入I %新配制的柠檬酸钠，继续加热搅拌至溶液呈酒红色，以制备好裸纳米金溶液。将纳米金溶液与超纯水以
I 2的体积比混合浓缩离心洗涤。洗涤之后以O. ImoVLK2CO3调节溶液pH值至待标记的特定磷脂分子的绑定蛋白的等电点略偏碱。b、将磷脂分子的绑定蛋白融入相应的缓冲液，搅拌状态下，逐滴加入裸纳米金溶液中。完毕后，继续搅拌30min，再将溶液放入4°C冰箱内冷藏老化过夜(避光，备用)。3、磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的定量分析检测a、与磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂反应后的磷脂分子修饰纳米金溶液和磷脂分子绑定蛋白标记纳米金溶液混合反应，于37°C恒温水浴反应lOmin。纳米金表面的磷脂分子与其特定的绑定蛋白发生特异性结合，引起纳米金之间距离发生改变，产生团聚反应。b、将a中反应后的溶液取出于紫外比色皿中进行测量，不同磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的反应浓度与紫外可见吸收光强度的定量关系可用于磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的定量分析检测。
具体实施例方式实施例I :基于PIP2修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测磷酸激酶 (Phosphoinositide 3kinase)及 Phosphoinositide 3 Inhibitor 的生物传感方法一、检测磷酸激酶(Phosphoinositide 3 kinase)的方法与步骤(I)冰水浴中新鲜配制的60uL O. IM NaBH4在搅拌状态下加入到2mL4% HAuCl4 与O. OlM柠檬酸钠混合物中，制备成种子液备用。4% HAuCl4溶液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，搅拌状态下加热制成生长液。将种子液加入到生长液中，搅拌混合，制备成颗径约为IOnm左右的纳米金溶液。将合成好的纳米金溶液与PB(50mM ；pH = 7. 4)以体积比I : 2的比例混合后，浓缩离心洗涤三次(40C ；10000r/min ；15min)。将O. 64mM PIP2加入到CTAB修饰的纳米金溶液中，持续搅拌，使PIP2直接修饰到纳米金颗粒上。在PIP2修饰的纳米金溶液加入1% BSA,于37°C恒温水浴下封闭lOmin。再将Phosphoinositide 3 kinase (2. 4U/g 2. 4X l(T1QU/g)加入此纳米金溶液中，3(TC恒温水浴反应,在酶的作用下产生PIP3修饰的纳米金溶液。(2) 250ml超纯水中加入2. 5ml 1% HAuCl4加热沸腾后，再加入I %新配制的柠檬酸钠，继续加热搅拌至溶液呈酒红色，以制备好裸纳米金溶液。将纳米金溶液与超纯水以 I 2的体积比混合浓缩离心洗涤。洗涤之后以O. ImoVLK2CO3调节溶液pH值至8左右。 将IOul O. 002MPIP3绑定蛋白溶液搅拌状态下，逐滴加入裸纳米金溶液中。完毕后，继续搅拌30min，再将溶液放入4°C冰箱内冷藏老化过夜(避光，备用)。(3)与Phosphoinositide 3 kinase作用后产生的PIP3修饰纳米金溶液和PIP3 绑定蛋白标记纳米金溶液混合反应，于37°C恒温水浴反应lOmin。纳米金表面的PIP3与其绑定蛋白发生特异性结合，引起纳米金团聚，产生紫外信号。不同Phosphoinositide 3 kinase的浓度(2. 4U/g 2. 4X10^10U/g)与紫外可见吸收光强度(400 800nm波长范围) 的定量关系可用于Phosphoinositide 3 kinase的定量分析检测。二、检测磷酸激酶抑制剂(Phosphoinositide 3 Inhibitor)的方法与步骤在检测Phosphoinositide 3 kinase 的步骤(I)中，加入 Phosphoinositide 3 kinase 后，同时再加入 5ul 325uM 的 Phosphoinositide 3 Inhibitor。Inhibitor 的加入阻止了 kinase的作用，纳米金的团聚作用也相应受到阻碍，同样引起紫外可见吸收光强度 (400 800nm波长范围)的相应变化，其定量关系可用于Phosphoinositide 3 Inhibitor 的分析检测。实施例2 :基于PIP3修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测去磷酸化酶(PTEN)的生物传感方法(I)冰水浴中新鲜配制的60uL O. IM NaBH4在搅拌状态下加入到2mL4% HAuCl4与
O.OlM柠檬酸钠混合物中，制备成种子液备用。4% HAuCl4溶液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，搅拌状态下加热制成生长液。将种子液加入到生长液中，搅拌混合，制备成颗径约为IOnm左右的纳米金溶液。将合成好的纳米金溶液与PB(50mM;pH= 7.4)以体积比 I 2的比例混合后，浓缩离心洗涤三次(4°C;10000r/min ;15min)。将O. 6mM PIP3加入到 CTAB修饰的纳米金溶液中，持续搅拌，使PIP3直接修饰到纳米金颗粒上。(2) 250ml超纯水中加入2. 5ml 1% HAuCl4加热沸腾后，再加入I %新配制的柠檬酸钠，继续加热搅拌至溶液呈酒红色，以制备好裸纳米金溶液。将纳米金溶液与超纯水以 I 2的体积比混合浓缩离心洗涤。洗涤之后以O. ImoVLK2CO3调节溶液pH值至8左右。 将IOul O. 002MPIP3绑定蛋白溶液搅拌状态下，逐滴加入裸纳米金溶液中。完毕后，继续搅拌30min，再将溶液放入4°C冰箱内冷藏老化过夜(避光，备用)。(3)本来PIP3修饰纳米金溶液和PIP3绑定蛋白标记纳米金溶液混合后，由于PIP3 与其绑定蛋白发生特异性结合，引起纳米金团聚，产生紫外信号。但是，如果在PIP3修饰的纳米金溶液加入I % BSA,于37°C恒温水浴下封闭lOmin，再将PTEN(2pM 2aM)加入此纳米金溶液中，30°C恒温水浴反应30min，在PTEN的作用下产生PIP2修饰的纳米金溶液。此时，PIPdf饰的纳米金将不会与PIP3的绑定蛋白发生特异性结合，纳米金则不会发生团聚， 从而引起紫外可见吸收光强度的逆向变化。不同PTEN的浓度(2pM 2aM)与紫外可见吸收光强度(400 800波长范围)的定量关系可用于PTEN的定量分析检测。
权利要求
1.一种基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法，包括如下步骤(1)磷脂分子修饰纳米金颗粒；(2)磷脂分子修饰纳米金颗粒与酶及其抑制剂的特异反应；(3)与磷脂分子对应的磷脂分子绑定蛋白标记纳米金颗粒；(4)经步骤(2)特异反应后的纳米金与步骤(3)蛋白标记的纳米金混合反应；(5)定量分析检测酶及其抑制剂。
2.根据权利要求I所述的基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法，其特征在于，所述的酶及其抑制剂是磷酸激酶、去磷酸化酶及其抑制剂。
3.根据权利要求I或2所述的基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法，其特征在于，步骤(I)所述磷脂分子修饰纳米金颗粒是直接合成带有表面活性剂修饰的纳米金颗粒，再将含磷脂分子溶液加入到修饰表面活性剂的纳米金溶液中，于纳米金表面直接形成单分子磷脂层。
4.根据专利要求I或2所述的基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法，其特征在于，纳米金颗粒表面修饰不同的磷脂分子，与磷脂分子对应的酶及其抑制剂发生特异反应。
5.根据权利要求4所述的基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法，其特征在于，所述的磷脂分子为PIP2、PIP3或DPPC。
6.根据专利要求I或2所述的基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法，其特征在于，步骤(3)中所述的磷脂分子绑定蛋白直接标记于纳米金颗粒表面。
7.根据权利要求I或2所述的基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法，其特征在于，步骤(4)所述的定量分析是利用紫外可见光吸收分析技术对酶及其抑制剂进行定量分析。
全文摘要
本发明建立了一个基于磷脂分子修饰纳米金颗粒团聚的生物分析方法，用于生物学研究、食品检测、环境分析的通用的传感技术平台。此技术包括基于磷脂分子修饰纳米金颗粒方法；磷脂分子修饰纳米金颗粒与酶及其抑制剂的特异反应；特定磷脂分子的绑定蛋白标记纳米金颗粒技术；磷脂分子修饰的纳米金颗粒与蛋白标记的纳米金颗粒发生团聚反应引起紫外可见吸收光强度的变化，定量分析检测酶及其抑制剂。该方法灵敏度高、操作简单、特异性强，可望成为一种用于生物学研究、食品检测、环境分析的通用技术。
文档编号C12Q1/25GK102586400SQ201210073838
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者俞汝勤, 唐丽娟, 文茜, 楚霞, 蒋健晖 申请人:湖南大学