一种纳米叶酸脂质体及其超临界二氧化碳制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及脂质体药物载体及其制备方法，更具体地讲，涉及一种纳米去叶酸脂 质体及采用超临界二氧化碳制备该纳米叶酸脂质体的方法。
【背景技术】
[0002] 脂质体是磷脂双分子层形成的中空微球体，类似细胞膜结构，能将药物包裹于囊 泡内、磷脂双分子层中，或是吸附于脂质体表面，从而能作为一种药物载体。磷脂是生物体 内固有的成分，在生物体内能经生物转化吸收降解，因此，脂质体具有良好的生物相容性， 有良好的发展前景。
[0003] 另一方面，在癌症靶向治疗领域，脂质体因为EPR效应(增强渗透滞留效应)具有被 动靶向作用。但是，一些低血管通透性的肿瘤细胞(如胰腺癌细胞)无法实现被动靶向，而且 用于被动靶向的纳米粒子载体在反复的血液循环中会被人体清除。因此，我们也需要通过 化学分子实现快速的主动靶向，专一识别癌细胞。在化学小分子靶向配体中，叶酸(维生素 B9)是研究较为广泛的配体。在绝大多数癌细胞表面，会大量表达糖基磷脂酰基醇连接的叶 酸受体，能显著提高对叶酸亲和性，从而使叶酸表现出癌细胞靶向作用。
[0004] 虽然叶酸属于水溶性维生素，但是溶解度很小（25°C下1.6mg/L)，不利于含叶酸 配体的靶向药物在生物体内吸收利用。因此改变叶酸靶向材料的水溶性是人们广泛关注的 技术难点。鉴于此，目前国内外主要采用壳聚糖、脂质体或是人工合成的水溶性聚合物等作 为叶酸的载体，以克服叶酸在水溶性上的不足。
[0005] 以脂质体作为载体，目前，制备脂质体的方法主要有薄膜蒸发法，反相蒸发法，冻 融法，乙醇注入法等。但上述方法存在有机溶剂残留、颗粒单分散性差等缺点。
[0006] 因此，我们需要一种新的纳米叶酸脂质体制备方法，可以克服上述缺点，获得一种 单分散性好、稳定性高、有机溶剂残留量低的纳米叶酸脂质体。
【发明内容】
[0007] 为解决现有技术的不足，本发明提出一种制备纳米叶酸脂质体的超临界二氧化碳 法，以超临界二氧化碳流体作为介质，制备出单分散性好、稳定性高、有机溶剂残留量低的 纳米叶酸脂质体。
[0008] 为实现上述目的，所采取的技术方案是：一种纳米叶酸脂质体，以叶酸-十二胺 衍生物为芯材，以卵磷脂为壁材，所述叶酸-十二胺衍生物与所述卵磷脂的质量比为1: (12 ~20)。
[0009] 在本发明一实施例中，所述叶酸-十二胺衍生物的制备方法如下：室温下将十二 胺与EDC盐酸盐溶于二甲基亚砜后，加入叶酸搅拌分散，然后再加入吡啶，室温反应过夜后 即获得叶酸-十二胺衍生物；其中， 所述十二胺与EDC盐酸盐的质量比为I: (1. 5~2. 5)，所述十二胺与叶酸的质量比为 1: (2~2. 2)，所述吡啶的添加量为：每Img叶酸添加0. 03 ml吡啶。
[0010] 本发明还提供上述纳米叶酸脂质体的超临界二氧化碳制备方法，所述制备方法是 以超临界二氧化碳流体为介质，使纳米叶酸脂质体的混悬液在40~45°C、16~20Mpa下孵化 1小时。需要说明的是，本上述方法16~20Mpa的压力是可以调节，如16、18、20MPa等都可 以，只要该压力和对应温度下二氧化碳呈超临界态即可。
[0011] 在本发明一实施例中，所述制备方法包括以下步骤： (1) 制备芯材叶酸-十二胺衍生物 室温下将十二胺与EDC盐酸盐溶于二甲基亚砜（DMSO)后，加入叶酸搅拌分散，然后再 加入吡啶，室温反应过夜后即获得叶酸-十二胺衍生物；其中， 所述十二胺与EDC盐酸盐的质量比为I: (1. 5~2. 5);所述十二胺与叶酸的质量比为 1: (2~2. 2)，优选1: 2. 2 ;所述吡啶的添加量为：每Img叶酸添加0. 03 ml吡啶；所述室 温反应过夜是指室温下反应12小时； (2) 成膜 将步骤（1)获得的叶酸-十二胺衍生物与卵磷脂溶于氯仿甲醇混合液中，待完全溶解 后，在40~45°C下旋转蒸发成膜并去除有机溶液；其中， 所述叶酸-十二胺衍生物与卵磷的质量比为1: (12~20)， 所述氯仿甲醇混合液中，氯仿与甲醇的体积比为（8~9) : 1; (3) 水化 向步骤（2)获得的混合液中添加重蒸水，磁力搅拌后50°C加热条件下超声分散，获得 叶酸脂质体混悬液；其中， 所述重蒸水与卵磷脂的质量比为（1~1.25) : 1; (4) 超临界二氧化碳流体孵化 使步骤（3)制得的叶酸脂质体混悬液在压力为16~20Mpa的二氧化碳气氛、45~50°C 下孵化1~2小时； (5) 释放 完成步骤（4)的孵化后，缓慢释放反应体系中的二氧化碳至常压，即得纳米叶酸脂质 体。
[0012] 需要说明的是，如无特殊说明（如制备方法的说明)，本发明中提及的试剂均为有 市售的常规试剂。当然，本发明还包括一些常规的提纯步骤。
[0013] 与现有技术相比，本发明的上述方案有以下优点： 1.本发明采用了超临界二氧化碳法制备纳米叶酸脂质体，与常规的制备方法(如薄膜 蒸发法等方法)比较，本发明通过在制备过程中采用超临界二氧化碳流体孵化(步骤4)及缓 慢放气(步骤5)，利用超临界二氧化碳流体高的溶解性溶解有机溶剂将其除去，显著降低叶 酸脂质体中有机溶剂(氯仿）的残留量。
[0014] 2.超临界二氧化碳流体环境可以塑化磷脂分子的结构，这种塑化作用有利于磷 脂分子形成热力学更稳定的构象，使双分子层的排列更加均匀，以达到提高脂质体稳定性 的目的。在本发明的超临界流体环境中，双分子层均匀排列也有助于自组装形成的脂质体 获得更好的单分散性。
[0015] 本发明提出了一种超临界二氧化碳法制备纳米叶酸脂质体的新方法，采用上述方 法在适当的压力、温度、卵磷脂和叶酸质量比、水化时间下制备除了单分散性好、稳定性高、 有机溶剂残留量低的纳米叶酸脂质体。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明的实施例1~3中制得的叶酸-十二胺衍生物的核磁图谱； 图2是本发明实施例1~3中制得的纳米叶酸脂质体的原子力显微镜照片； 图3a是本发明的实施例1~3中制得的脂质体粒径分布； 图3b是应用常规方法(薄膜蒸发法）制得的脂质体粒径分布； 图4是本发明的实施例1~3中制得的脂质体与常规方法(薄膜蒸发法)制得的脂质体的 透射率比较。
【具体实施方式】
[0017] 以下结合实施例对本发明做详细的说明，实施例旨在解释而非限定本发明的技术 方案。
[0018] 实施例1 本实施例提供一种纳米叶酸脂质体及其超临界二氧化碳制备方法，所述方法包括以下 步骤： (1) 制备芯材叶酸-十二胺衍生物 室温下将十二胺与EDC盐酸盐溶于DMSO后，加入叶酸搅拌分散，然后再加入吡啶，室温 反应过夜后即获得叶酸-十二胺衍生物；其中， 所述十二胺与EDC盐酸盐的质量比为1: 2. 3,所述十二胺与叶酸的质量比为1: 2. 2， 所述批陡的添加量为：每Img叶酸添加0. 03 ml批陡； (2) 成膜 将步骤（1)获得的叶酸-十二胺衍生物与卵磷脂溶于氯仿甲醇混合液中，待完全溶解 后，在40°C下旋转蒸发成膜并去除有机溶液；其中， 所述叶酸-十二胺衍生物与卵磷的质量比为1: 17， 所述氯仿甲醇混合液中，氯仿与甲醇的体积比为9 : 1; (3) 水化 向步骤（2)获得的混合液中添加重蒸水，磁力搅拌后50°C加热条件下超声分散，获得 叶酸脂质体混悬液；其中， 所述重蒸水与卵磷脂的质量比为I : 1 ; (4) 超临界二氧化碳流体孵化 使步骤（3)制得的叶酸脂质体混悬液在压力为ISMpa的二氧化碳气氛、48°C下孵化1. 5 小时； (5) 释放 完成步骤（4)的孵化后，缓慢释放反应体系中的二氧化碳至常压，即得纳米叶酸脂质 体。
[0019] 具体来说，本实施例的制备方法如下： 制备叶酸-十二胺衍生物，称取61. 2mg十二胺、143. 8mg EDC盐酸盐，加入7mL DMSO 混合搅拌1小时，完全溶解后加入132. 4mg叶酸和3. 5mL吡啶。常温搅拌12小时过夜。加 入30mL重蒸水，振荡，有大量固体析出。抽滤，固体先用去离子水洗一次除去吡啶，再按乙 醚-乙醇-乙醚的溶剂顺序洗三次，得橙色固体，真空干燥。核磁共振1HMR表征产物，请见 图1。
[0020] 制备叶酸脂质体混悬液，称取25mg卵磷脂、I. 5mg叶酸-十二胺衍生物置于圆底烧 瓶中，加入IOmL氯仿：甲醇=9 :1的混合溶剂，漩涡混合使固体溶解。40°C恒温水浴下在旋 转蒸发仪上成膜，抽真空使有机溶剂完全挥发。移取25mL重蒸水加入烧瓶中，磁力搅拌使 膜脱落，50°C加热条件下超声分散5分钟。将混悬液及磁力搅拌子转移到高压反应釜中，通 二氧化碳气体至18MPa。关闭进气阀，48°C水浴中孵化搅拌1.5小时。孵化结束后，释放二 氧化碳气体将体系压力降至常压，即得纳米叶酸脂质体。
[0021] 实施例2 本实施例提供一种纳米叶酸脂质体及其超临界二氧化碳制备方法，所