一种盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药品制剂领域，具体涉及一种盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂的制备方 法，以及通过该方法制备的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂。所述方法操作简单、耗时较少、 质量易控，适合工业化大量生产。
【背景技术】
[0002] 拓扑替康（Topotecan，TPT)是一种新型喜树碱半合成衍生物，对多种肿瘤，如非小 细胞肺癌、肝癌、胃癌、血液淋巴瘤等均具有疗效，是DNA拓扑异构酶I(TopoI)的抑制剂， 拓扑替康与其活性代谢产物通过与DNA-Top0-I复合体的稳定结合引起DNA单链的断裂，使 DNA产生不可逆的损伤而死亡。
[0003]目前，国内上市的产品为盐酸拓扑替康的注射剂，该药抗癌活性强，作为常用的肿 瘤化疗药物，骨髓抑制常见的毒性为3-4度中性粒细胞减少和血小板降低，常见不良反应 为食欲下降、恶心、呕吐、脱发和疲乏等，这些不良反应给患者带了巨大的痛苦，大大限制了 该药在临床上的使用。
[0004] 纳米制剂技术在药物研究中的应用正是基于它能改变药物在制剂中的存在状态 而使药物表现出缓控释性、靶向性，从而提高药物疗效、降低药物的毒副作用等。纳米制剂 技术在药物研究中的应用大致可分为二方面，一是纳米药物粒子的制备，例如纳米结晶技 术、超细粉碎（纳米级）技术等，使药物的粒径在1000 nm以下；二是纳米药物载体的制备， 纳米载药系统（nanoparticledeliverysystem,NDS)，使用于载药的载体尺寸在纳米级。 由于肿瘤血管间隙可达到100_780nm，正常血管内皮细胞之间的间隙通常在2nm左右。静脉 注射给药后，纳米制剂可有效穿透肿瘤区的血管，聚集在肿瘤区，更好发挥疗效，成为国际 药剂学界研究的热点领域。大量的研究表明它在肿瘤治疗领域具有潜在的应用价值。
[0005] 针对拓扑替康治疗肿瘤中出现的问题，已经制备了一种盐酸拓扑替康长循环脂质 体，实现靶向给药，降低游离药物在人体内其他组织部位的分布，降低毒副作用，减少不良 反应，大大提高了药物的治疗效果。
[0006] 但是，盐酸拓扑替康是一种水溶性药物，采用薄膜分散法、乙醇注入法等常规方法 制备脂质体时，药物不易进入脂质体内水相，致使包封率低。由于盐酸拓扑替康是两亲性弱 碱性药物，适合采用离子梯度法制备脂质体制剂，即以离子梯度调节剂为水相制备空白脂 质体，此时脂质体的内水相和外水相都含有等浓度的离子梯度调节剂，然后以去离子水置 换外水相的离子梯度调节剂，造成脂质体内外调节剂的浓度梯度，再将温度提高到脂质体 相变温度以上，依靠离子梯度调节剂浓度梯度的驱动，即主动载药，将盐酸拓扑替康载入脂 质体内，能极大地提高药物在脂质体内的包封率。
[0007] 在如上的制备过程中，一个关键的步骤就是置换外水相的离子梯度调节剂，引起 脂质体内外调节剂的浓度梯度。目前，常用的方法是透析袋透析或葡聚糖凝胶G50洗脱分 离。这两种方法存在的问题是处理量少，会稀释原脂质体的浓度，因此只适合实验室小量的 应用，不适合大规模样品的处理。
[0008]常规过滤或者超滤的方法去除外水相离子梯度调节剂，建立离子梯度时存在随着 过滤的进行，会出现过滤或者超滤效率下降的问题，切向流过滤的过滤方向跟滤液流动方 向垂直，在以多孔膜作为过滤介质的过程中，剪切力抑制了溶质的沉积，保证了截留颗粒或 者分子能够从溶液中分离，该方法受到压力、介质类型、膜材料、PH酸碱度以及粘度等因素 的影响，目前在医药领域主要是应用于细胞收集、蛋白浓缩、蛋白脱盐、抗生素纯化等方面， 本发明将其应用与脂质体外水相离子梯度调节剂的去除，在具有较大创新性的同时，能够 满足工业化生产的要求。
【发明内容】
[0009]为解决现有技术中存在的问题，本发明的发明人进行了广泛深入的研究，最终得 到本发明。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供了 一种制备盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂的 方法，所述方法包括如下步骤：
[0011]a)将磷脂、胆固醇和修饰材料溶于乙醇得有机相，将该有机相注入到含离子梯度 调节剂的水溶液中搅拌，经均质形成空白脂质体；
[0012]b)采用切向流过滤的方法用去离子水将空白脂质体外水相中的离子梯度调节剂 置换出来，形成空白脂质体内外水相的离子浓度梯度；
[0013]C)取盐酸拓扑替康，与在步骤b)中形成的空白脂质体混合，在高于所述磷脂相转 变温度的温度下孵化，得到盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂。
[0014]在所述方法中，所述磷脂优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰乙醇 胺、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰甘油、鞘磷脂、心磷脂、大豆磷 月旨、氢化大豆磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化卵磷脂。
[0015] 步骤a)中的搅拌的转速可以设定在200-600rpm。
[0016]所述离子梯度调节剂用以在空白脂质的内外水相中形成离子梯度实现对盐酸拓 扑替康的主动载药，从而提高盐酸拓扑替康在脂质体纳米制剂中的包封率。本发明中，对离 子梯度调节剂没有特殊要求，只要其是药学上可接受的并可以在内外水相中形成离子梯度 实现对盐酸拓扑替康的主动载药即可。优选地，离子梯度调节剂选自柠檬酸、硫酸铵、硫酸 铜、钙离子载体A23187;优选硫酸铵，硫酸铵实现主动载药的同时，能够在内水相中与盐酸 拓扑替康形成结构稳定的螯合物，使药物不容易泄露出来。所述离子梯度调节剂溶液为水 溶液，其浓度范围为50-400mM，pH为3-6。
[0017]所述修饰材料用于实现脂质体纳米制剂的主动靶向及长循环功能，延长药物在血 液中的循环时间，增加药物在肿瘤部位的蓄积，以进一步提高药效，降低毒性。本发明中，所 述修饰材料优选为分子结构中含有聚乙二醇部分的材料，优选为选自聚乙二醇-二硬脂酰 磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE)，其中聚乙二醇部分的数均分子量优选为1000-5000。
[0018]在所述方法中，涉及各组分的用量优选为盐酸拓扑替康1重量份；磷脂10-30重量 份；胆固醇2-5重量份；修饰材料1-5重量份。进一步优选地，乙醇为1-3重量份，含有离子 浓度调节剂的水溶液为50-150重量份。
[0019]所述磷脂相转变温度是指脂质凝胶态和液晶态之间相互转变时的温度。在高于磷 脂相转变温度的温度下孵育，可使脂质膜通透性增强，盐酸拓扑替康在离子梯度的驱动下 更易透膜，聚集于脂质体的内水相中。
[0020] 在所述方法中，孵化的温度优选为45~70°C。
[0021] 在所述方法中，使用切向流过滤时，优选地，滤膜材料选自聚醚砜树脂（PES)和三 醋酸纤维素（CT)，通过滤膜的流速为20-400ml/min，过滤系统中压力在0-5Bar之间，置换 外水相的去离子水的体积与空白脂质体的体积比为6-15。
[0022] 在所述方法得到的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂中，90wt%以上的盐酸拓扑替康 包载在由磷脂、胆固醇以及修饰材料形成的空白脂质体中，在优选的实施方式中，92wt%以 上的盐酸拓扑替康包载在空白脂质体中，在更优选的实施方式中，95wt%以上的盐酸拓扑替 康包载在空白脂质体中。
[0023] 在所述方法得到的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂中，盐酸拓扑替康脂质体的粒径 在IOOnm以下，在实施方式中，制得的盐酸拓扑替康脂质体的粒径在50-95nm。
[0024] 在制备空白脂质体后，本发明采用切向流过滤的方法置换空白脂质体内水相中的 梯度调节剂，形成空白脂质体内外水相的离子浓度梯度。切向流过滤是一种能分离不同分 子量物质的过滤系统。如图2所示，当两种不同分子量的物质经过膜时，小分子物质透过膜 孔被排除，而大分子物质则不能透过膜孔。由于物质通过方式是切向流，不能透过膜孔的大 分子物质不会堆积在膜表面，而顺着切向流被带走，如此可以循环流动的切向流对膜产生 的压力又能促使小分子物质透膜排除。因此，切向流过滤起能够分离出小分子物质、置换大 分子物质外水相、浓缩大分子物质浓度。
[0025] 与目前经常使用的透析袋透析或葡聚糖凝胶G50洗脱分离比较，切向流过滤处理 500ml空白脂质体，只需2小时，透析袋透析15ml需要24小时，葡聚糖凝胶G50洗脱分离一 次最多处理lml，无法大规模制备。使用切向流过滤，还有如下的优势：
[0026] 本发明的方法采用切向流过滤替换外水相中离子梯度调节剂，能够较彻底地置换 外水相，形成的离子浓度梯度较大。同时过滤循环的速度、置换体积量，可以根据具体情况 调整，实现在最低的投入下，实现最大的