一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用，属于肺癌药物研 究领域。
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，发达国家肺癌的5年生 存率约10%~15%，在我国则更低。肺癌患者中80%~85%为非小细胞肺癌，且多数患者初 次诊断时已处于晚期（mb/iv期），失去手术机会。放疗和化疗虽可在一定程度上改善肺癌 的整体治疗水平，但效果并不理想。放疗难以根除浸润转移的肺癌细胞，而化疗无选择性， 在杀伤癌细胞的同时也对正常细胞造成伤害。因此，寻找更为有效和安全的治疗手段成为 当前肺癌研究的一个热点。
[0003] 由于脂质体(liposomes)能够保护药物避免其在血浆中降解、绕开外排转运蛋白， 利于药物靶向入肺部，显著增加肺部药物浓度，从而提高治疗效果并减小全身毒副作用，广 泛用于肺部药物传递的研究。转铁蛋白（transf errin，TF)是一类Π 型跨膜糖蛋白家族，由2 个单体(90 000)经二硫键交联而成。转铁蛋白受体(1:瓜1181^1-^〇6卩1:〇1'1?1〇在分裂活跃 的细胞上表达水平很高，在肿瘤细胞上每个细胞能达到1万~10万个分子，而在非增殖细胞 上很少表达，甚至检测不到。TF/TFR系统在转运抗癌药、蛋白质以及基因治疗药物上显示出 了很大潜能。基于此，有望提供以中方肺靶向脂质体。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用，本法通 过将革G向肺癌的功能基配体TF (转铁蛋白）修饰到脂质体表面，增加脂质体到达肺部的能 力；同时，本发明将紫花牡荆素包载到靶向脂质体中，增强其对肿瘤细胞促凋亡作用，为杀 死肿瘤细胞提供可能，从而防止治疗后因细胞残留而引起肿瘤复发。
[0005] 本发明所提供的靶向脂质体，由脂质体和转铁蛋白组成；
[0006] 所述转铁蛋白连接于所述脂质体的羧基。
[0007] 上述的靶向脂质体中，所述脂质体的羧基可由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG-C00H)提供。
[0008] 上述的靶向脂质体中，所述脂质体具体可由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇（DSPE-PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（DSPE-PEG-⑶0H)制备 得到；
[0009] 各原料的摩尔份数可为：
[0010] 所述卵磷脂80~88份；
[0011] 所述胆固醇7~15份；
[0012] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.2~4.8份；
[0013] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.2~0.7份；
[0014] 各原料的摩尔份数具体可为：
[0015] 所述卵磷脂84份；
[0016] 所述胆固醇11份；
[0017]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.5份；
[0018]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.5份。
[0019]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇具体可为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙 二醇2000(DSPE-PEG2000);
[0020] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基具体可为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚 乙二醇 2000-羧基交连物(DSPE-PEG2000-C00H)。
[0021] 上述的靶向脂质体中，所述转铁蛋白与所述脂质体的质量比可为1:8.1~9.1，具 体可为1:8.6。
[0022]本发明进一步提供了所述靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：在碳二亚胺 (EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下，所述转铁蛋白连接于所述脂质体的所述 羧基上，即得所述靶向脂质体。
[0023]上述的制备方法中，所述脂质体可由所述卵磷脂、所述胆固醇、所述二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺-聚乙二醇与所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基通过硫酸铵梯度法制备 得到。
[0024]上述的制备方法中，所述碳二亚胺与所述转铁蛋白的摩尔比为12~18:1，具体可 为16.5:1;
[0025] 所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为35~40:1，具体可为39.7:1。
[0026] 以所述靶向脂质体为活性成分的药物载体也属于本发明的保护范围。
[0027] 本发明还提供一种载药脂质体，其由所述靶向脂质体包载药物得到。
[0028] 所述载药脂质体中，所述药物具体可为紫花牡荆素（Casticin，CAS)分子式为 C19H18O8,相对分子质量374.35,恪点为186~187°C，纯品为淡黄色晶体。紫花牡荆素学名5， 3 二羟基-3，6，7，4 四甲氧基黄酮，又叫蔓荆子黄素，属于多甲氧基黄酮类化合物。
[0029]所述载药脂质体的药脂比为1:20~40，具体可为1:30;
[0030] 所述药脂比指的是所述药物的质量与所述靶向脂质体中的所述卵磷脂和所述胆 固醇的质量之和的比值。
[0031] 本发明提供的载药脂质体可用于治疗肺癌，所述肺癌可为肺腺癌，具体可为A549 肺腺癌。
[0032] 本发明所述载药脂质体能够诱导肺癌细胞的凋亡，所述肺癌细胞可为肺腺癌细 胞，具体可为A549肺腺癌。
[0033]本发明将TF修饰到脂质体表面，增强肺靶向的能力，同时具有靶向肿瘤细胞的作 用;将抗肿瘤药紫花牡荆素包载到脂质体中，得到靶向功能的靶向肺癌细胞的脂质体，能使 药物到达病灶部位，并预期能有效防止肿瘤复发。本发明为彻底根治肺癌带来了希望，具有 重要的理论意义与临床意义。
【附图说明】
[0034]图1为本发明载药脂质体(TF-CAS-脂质体)的透射电镜照片。
[0035]图2为本发明载药脂质体(TF-CAS-脂质体)的药物释放曲线。
[0036]图3为A549肺腺癌细胞的形态。
[0037]图4为不同载药脂质体对A549肺腺癌细胞的抑制作用。
[0038]图5为激光共聚焦法检测细胞对不同载药脂质体的摄取及其在细胞内的分布行 为，其中，图5(A1)、图5(A2)和图5(A3)表示细胞对游离紫花牡荆素(CAS)的摄取及其在细胞 内的分布行为，图5(B1)、图5(B2)和图5(B3)表示细胞对CAS-脂质体的摄取及其在细胞内的 分布行为，图5(C1)、图5(C2)和图5(C3)表示细胞对TF-CAS-脂质体的摄取及其在细胞内的 分布行为。
[0039]图6为A549肺腺癌细胞对不同载药脂质体的摄取能力，其中，图6(A)表示A549肺腺 癌细胞对空白脂质体的摄取能力，图6(B)表示A549肺腺癌细胞对紫花牡荆素-脂质体的摄 取能力，图6(C)表示A549肺腺癌细胞对TF-紫花牡荆素-脂质体的摄取能力。
[0040]图7为不同载药脂质体对A549肺腺癌细胞的凋亡作用，其中，图7(A)表示游离紫花 牡荆素(CAS)对A549肺腺癌细胞的凋亡作用，图7(B)表示CAS-脂质体对A549肺腺癌细胞的 凋亡作用，图7(C)表示TF-CAS-脂质体对A549肺腺癌细胞的凋亡作用。
【具体实施方式】
[0041 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 下述实施例所用的试剂和仪器如下：
[0044] 1、实验试剂和细胞
[0045] 蛋黄卵磷脂（EPC)购自Germany Lipoid company ,ShangHai local agent ,China; 胆固醇(cholesterol)购自北京双旋微生物培养基制品厂;二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇（DSPE-TOG2000)购自日本油脂株式会社（日本NOF公司）；转铁蛋白（TF)、葡聚糖凝胶 (shephedex G