Α549肺腺癌的抗增殖作用
[0087]取细胞Α549接种于96孔细胞培养板中，5000个/孔，设三个复孔，置二氧化碳培养 箱中于37°C、相对湿度95%的条件下孵育24h，待细胞贴壁生长。然后分别加入上述配制各 药液1〇μ1到细胞培养孔中，使最终紫花牡荆素浓度梯度为:0.1、0.5、1、5、10、25、50和100μ Μ，另设溶剂对照孔3个复孔。将细胞培养板置二氧化碳培养箱中孵育24h和48h。孵育完毕 后，吸弃培养液，每孔加入1 〇 %三氯乙酸1 〇〇μ1，然后在4 °C冰箱中放置Ih固定细胞。培养板 各孔用去离子水洗涤，以去除三氯乙酸。在空气中干燥后，每孔〇.4%SRB(以1%醋酸配制） 100μ1，室温下放置15min，弃去各孔内液体后用1 %乙酸洗涤5遍，去除未结合染料，空气中 干燥后用lOmmol/L Tris碱(pH 10.5)100μ1溶解，在平板振荡器上振荡20min，置酶标仪中 于540nm波长下测定每孔吸收度OD值，经过给药培养后药物对A549肺腺癌细胞抑制率按照 如下公式计算，即得，并计算出50%抑制浓度(IC50)，计算不同载药脂质体对A549的抑制作 用，如图4。从图4中可以看出：TF-CAS-脂质体对A549的抗增殖作用优于其他载药脂质体组。 从图4中可以看出，游离CAS抗增殖作用较弱；TF-CAS-脂质体经TF修饰后，可能增强A549亲 和力和摄取能力。
[0088]计算抑制率(抑制率=给药组细胞吸光度/对照组细胞吸光度），并使用SPSS计算 50%抑制浓度（IC5q)，IC5q计算结果见表3。从结果中可以看出TF-CAS-脂质体的IC 5q明显低 于其他组，对A549肺腺癌细胞抗增殖作用大大提高，明显高于游离药组和其他载药脂质体。 [0089]表3不同载药脂质体的IC50值
[0091]实施例4、共聚焦显微镜研究不同载药脂质体在A549肺腺癌的分布
[0092]用激光扫描共聚焦法探究A549肺腺癌细胞对转铁蛋白-紫花牡荆素脂质体(TF- CAS-L)、紫花牡荆素脂质体及游离药的摄取及其在细胞内的分布行为。
[0093] 将A549细胞接种于12孔板中，接种密度为2 X IO4个/孔，贴壁生长24h后，观察已有 超过60 %的细胞汇集，转铁蛋白-紫花牡荆素脂质体(TF-CAS-L)、紫花牡荆素脂质体及游离 药(紫花牡荆素终浓度为1〇μΜ)置二氧化碳培养箱中，37°C培养2小时，依次用冷PBS漂洗三 次，4%多聚甲醛固定lOmin，然后用Hoechst33258(激发波长352nm，发射波长461nm)进行细 胞核染色5min。用激光共聚焦显微镜(LSM 510,Zeiss,Germany)以480nm波长的激光束激发 紫花牡荆素（激发波长480nm，发射波长560nm)，以346nm波长的激光束激发H 〇echst33258 (激发波长346nm，发射波长460nm)，然后用Aim Image Examiner软件进行图像分析。
[0094] 结果见图5。图5中，A表示游离CAS，B表示CAS-脂质体，C表示TF-CAS-脂质体，Al-Cl 绿色表示应用载药脂质体或游离CAS，药物在A549细胞内的分布；A2-C2蓝色表示经 Hochest33258染色后的A549细胞的核;A3-C3:A1-C1和A2-C2的叠加图像，显示应用载药脂 质体和游离CAS后，药物在A549肺腺癌细胞的细胞核、细胞质均有分布。结果表明，药物经 A549细胞内吞后主要分布在细胞质中，TF-CAS-脂质体组细胞内紫花牡荆素的分布量最多。 [0095]实施例5、A549细胞及对不同载药脂质体的摄取能力
[0096]取对数生长期的A549细胞，以2 X IO5个/孔消化接种在6孔板上，于37°C二氧化碳 培养箱中，相对湿度95%的条件下孵育24h，待细胞贴壁生长。给药:空白脂质体(A)，紫花牡 荆素-脂质体(B)，TF-紫花牡荆素-脂质体(C)(紫花牡荆素浓度为0.5μΜ)，培养箱中孵育2h。 孵育完毕后，用冷的PBS洗涤细胞三次，经0.25 %胰酶消化收集，再用PBS吹打成细胞悬液， 经流式细胞仪检测。结果见图6,在细胞A549的摄取实验中，和其他各组载药脂质体相比， TF-CAS-脂质体显示出最强的A549细胞及的摄取能力。
[0097]实施例6、载药脂质体体外对A549肺腺癌细胞及凋亡作用研究 [0098] 取对数生长期的六549肺腺癌细胞，以2\105个/孔接种于6孔板中，37°(：，5%〇)2培 养箱中培养。细胞生长24h后，加入游离CASXAS-脂质体、TF-CAS-脂质体(CAS的终浓度分别 为ΙΟμΜ)，每个药物设三个复孔。置培养箱中继续培养24h后，用冷I 3BS漂洗3遍，不含EDTA的 胰酶消化，离心（1000 rpm离心3min)后用I3BS洗涤细胞两次，300yL回流的I 3BS将离心的下沉 细胞吹匀。之后依次加入500yL的Binding Buffer、5yLAnnexin V-TITC、10yL 7-PI，混匀后 于室温避光的条件下反应10min，经流式细胞仪检测。
[0099]实验结果如图7所示，对A549肺腺癌细胞:游离CAS(A)、CAS-脂质体⑶、TF-CAS月旨 质体(C)的凋亡率分别为10.49%、20.82%和51.52%，靶向TF-CAS脂质体对A549肺腺癌细 胞的凋亡百分率最高分别为51.52%，经统计学分析，与其他各组相比具有显著性差异，说 明其促凋亡作用明显强于其他各组。
【主权项】
1. 一种靶向脂质体，其特征在于:所述靶向脂质体由脂质体和转铁蛋白组成； 所述转铁蛋白连接于所述脂质体的羧基。2. 根据权利要求1所述的靶向脂质体，其特征在于:所述脂质体的羧基由二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基提供。3. 根据权利要求2所述的靶向脂质体，其特征在于:所述脂质体由卵磷脂、胆固醇、二硬 脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基制备得到； 各原料的摩尔份数为： 所述卵磷脂80~88份； 所述胆固醇7~15份； 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.2~4.8份； 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基〇. 2~0.7份。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的靶向脂质体，其特征在于:所述转铁蛋白与所述脂 质体的质量比可为1:8.1~9.1。5. 权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：以碳二亚胺作为 连接剂，将所述转铁蛋白连接于所述脂质体的所述羧基上，即得所述靶向脂质体。6. -种药物载体，其活性成分为权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体。7. -种载药脂质体，由权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体包载药物得到。8. 根据权利要求7所述的载药脂质体，其特征在于:所述药物为紫花牡荆素。9. 权利要求7或8所述载药脂质体在制备治疗肺癌的药物中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述肺癌为肺腺癌。
【专利摘要】本发明公开了一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用。本发明提供的靶向脂质体由脂质体和转铁蛋白组成；所述转铁蛋白连接于所述脂质体的羧基，所述脂质体的羧基由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺?聚乙二醇?羧基提供。本发明提供的载药脂质体由所述靶向脂质体包载药物得到，所述药物为紫花牡荆素，所述载药脂质体可用于治疗肺癌。本发明将TF修饰到脂质体表面，增强肺靶向的能力，同时具有靶向肿瘤细胞的作用；将抗肿瘤药紫花牡荆素包载到脂质体中，得到靶向功能的靶向肺癌细胞的脂质体，能使药物到达病灶部位，并预期能有效防止肿瘤复发。本发明为彻底根治肺癌带来了希望，具有重要的理论意义与临床意义。
【IPC分类】A61K31/352, A61P35/00, A61K9/127, A61K47/48
【公开号】CN105708802
【申请号】CN201610172394
【发明人】应雪, 张春春, 王亚华, 轩亚茹, 唐辉
【申请人】石河子大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年3月24日