外显子2靶向U7snRNA多核苷酸构建体的重组腺相关病毒递送的制作方法
【专利说明】外显子2靶向U7snRNA多核苷酸构建体的重组腺相关病毒 递送
[0001] 本申请要求2013年4月20日提交的美国临时专利申请No. 61/814,256的提交日 期的权益，所述美国临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于治疗由DMD外显子2的复制引起的杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy)的多核苷酸的重组腺相关病毒（rAAV)递送。本发明提供rAAV产品 和使用rAAV治疗杜氏肌营养不良症的方法。
[0003] 通过引用并入序列表
[0004] 本申请含有作为公开内容单独部分的计算机可读形式的序列表（文件名： 47699PCT_SeqListing. txt ; 10, 162 字节-ASCII 文本文件，创建于 2014 年 4 月 18 日），其 全部内容以引用的方式并入本文。
[0005] 背景
[0006] 肌营养不良症（MD)是一类遗传性疾病。该类疾病的特征在于控制运动的骨骼肌 的进行性衰弱和退化。一些形式的MD在婴儿期或儿童期发展，而其它形式可能直到中年或 晚年才出现。该病症在肌肉衰弱的分布和程度（一些形式的MD还影响心肌）、发作的年龄、 进展速率和遗传模式方面不同。
[0007] -种形式的MD是杜氏肌营养不良症（DMD)。它是最普通的严重的儿童形式的 肌营养不良症，影响5000名男性新生儿中的1名。DMD由DMD基因的突变引起，所述突 变导致骨骼肌和心肌以及GI道和视网膜中肌养蛋白蛋白（427KDa)的缺乏。肌养蛋白 不仅保护肌纤维膜免于离心收缩，而且还锚固紧密靠近肌纤维膜的多种信号传导蛋白。 DMD的许多临床病例与DMD基因的缺失突变有关联。尽管有许多根据DMD基因的鉴定 的研究方向，但治疗选择仍有限。皮质类固醇类为明确有益的，但是随着行走年数的增 加，益处被长期副作用抵消。20多年以前报道的原始对照、随机化双盲研究证明使用强 的松（prednisone)的益处[Mendell 等，N. Engl. J. Med. ,320:1592-1597(1989)]。随后 的报道显示使用地夫可特（deflazacort)(-种保钠类固醇）的相等功效[Biggar等， J.Pediatr·，138:45-50(2001)]。最近的研究也证明通过外显子跳跃（exon skipping)实 现的功效，即在6MWT中延长步行距离。到目前为止公布的临床研究已经报道仅仅其中通 过跳过外显子51来修复阅读框的突变的益处[Cirak等，Lancet, 378:595-605(2011)和 Goemans等，New Engl. J. Med. 364:1513-1522(2011)]。在唯一的双盲随机化治疗试验的报 道中，使用eteplirsen(-种磷酰二胺吗啉代寡聚物（ΡΜ0))证明了有希望的结果。在所有 这些外显子跳跃试验中，发现的共同特征是在最初适度改善后行走能力的平稳期。
[0008] 还参见2012年3月29日公布的美国专利申请公开No. 2012/0077860 ;2013年3 月21日公布的2013/0072541 ;和2013年2月21日公布的2013/0045538。
[0009] 与缺失突变形成对照，DMD外显子复制造成抗肌萎缩蛋白病 (dystrophinopathy)患者的无偏样本中约5 %的致病突变[Dent等，Am. J. Med. Genet.，134 (3) : 295-298 (2005)]，尽管在一些类型的突变中复制的数目较高[包括由联 合抗肌萎缩蛋白病项目（United Dystrophinopathy Project)出版的 Flanigan 等，Hum. Mutat.，30(12) :1657-1666(2009)，其中其为 11% ]。
[0010] 腺相关病毒（AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长度为约4. 7kb，包 括145个核苷酸的反相末端重复（ITR)。存在多种AAV血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸 序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组提供在GenBank登记号NC_002077 ;AAV-2的完整 基因组提供在 GenBank 登记号 NC_001401 和 Srivastava 等，J. Virol.，45:555-564 {1983); AAV-3的完整基因组提供在GenBank登记号NC_1829 ;AAV-4的完整基因组提供在GenBank 登记号NC_001829 ;AAV-5基因组提供在GenBank登记号AF085716 ;AAV-6的完整基因组提 供在GenBank登记号NC_001862 ;AAV-7和AAV-8基因组的至少部分分别提供在GenBank 登记号 AX753246 和 X753249 (关于 AAV-8 还参见美国专利 No. 7, 282, 199 和 7, 790, 449); AAV-9 基因组提供在 Gao 等，J. Virol.，78:6381-6388(2004) ;AAV-10 基因组提供在]?〇1· Ther.，13(1) :67-76(2006);以及 AAV-11 基因组提供在 Virology, 330(2) :375-383(2004)。 指导病毒DNA复制（rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在AAV ITR中。三种AAV启动子（关于它们的相对图谱位置命名为p5、pl9和p40)驱动编码r印 和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。与单个AAV内含子的差异剪接偶联的两 种rep启动子（p5和pl9)(在核苷酸2107和2227处）引起由rep基因产生四种rep蛋白 (代口78、代口68、代口52和^?40)。1^口蛋白拥有多种最终负责复制病毒基因组的酶促性 质。Cap基因从p40启动子表达并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。可变剪接和非 共有翻译起始位点导致产生所述三种相关衣壳蛋白。单一共有多聚腺苷酸化位点位于AAV 基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学综述于Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129(1992)中。
[0011] AAV拥有独特的特征使其具有吸引力在例如基因疗法中作为用于递送外源DNA至 细胞的载体。培养细胞的AAV感染是非致细胞病变的，并且天然感染人和其它动物是沉默 的并且无症状的。而且，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许可能在体内靶向许多不同的组织。 此外，AAV缓慢地转导分裂细胞和非分裂细胞，并且可作为转录活性核游离体（染色体外元 件）基本上在那些细胞的整个寿命存留。AAV前病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具感染 性，其使重组基因组的构建可行。此外，因为指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包 含在AAV基因组的ITR内，所以基因组的内部约4. 3kb (编码复制和结构衣壳蛋白r印-cap) 的一些或全部可用外源DNA替换。Rep和cap蛋白可以反式提供。AAV的另一重要特征是 它是极其稳定和健壮的病毒。它易于抵挡用于使腺病毒失活的条件（56°C至65°C持续几小 时），从而使AAV的冷藏具有较小危险。AAV甚至可以被冻干。最后，被AAV感染的细胞对 重复感染没有抗性。
[0012] AAV8样AAV，称为rh. 74，递送编码多种蛋白质的DNA。Xu等， Neuromuscular Disorders, 17:209-220(2007)和 Martin 等，Am.J.Physiol. Cell. Physiol.，296:476-488 (2009)涉及针对杜氏肌营养不良症的细胞毒性T细胞GalNAc转移 酶的 rh. 74 表达。Rodino-Klapac 等，Mol. Ther.，18 (1) : 109-117 (2010)描述了通过肢体 血管灌注递送AAV rh. 74后微肌养蛋白（micro-dystrophin)FLAG蛋白标签融合物的AAV rh. 74表达。
[0013] 肌营养不良症是一类无可确认的治疗的疾病，其严重影响个体、家庭和社会。花费 无法估计。个体经受情绪压力和与丧失自尊相关的生活质量下降。由肢体功能丧失引起的 极端的身体挑战造成日常生活中活动艰难。家庭动态经受财务损失和对人际关系的挑战。 受影响的兄妹感觉疏远，并且配偶之间的争吵常常导致离婚，特别是如果肌营养不良症的 原因可能在于其中一方父母。寻求痊愈的负担经常成为损耗和挑战生活各方面的一生的高 度集中的努力。家庭之外，社会通过需要增加的设施在特殊教育、特殊交通和用于反复住院 治疗反复的呼吸道感染和心脏并发症的费用方面适应肌营养不良症群体的不利因素而承 受财务负担。财务责任由国家和联邦政府机关共同分担，从而将责任扩展到纳税群体。
[0014] 因此，本领域仍然需要治疗肌营养不良症，包括DMD。
[0015] 概述
[0016] 本发明提供用于预防、延迟其进展和/或治疗涉及DMD基因的外显子2的复制的 DMD的方法和产品。所述方法涉及使用AAV作为编码U7小核RNA和外显子2靶向反义序列 的多核苷酸构建体"外显子2靶向U7snRNA多核苷酸构建体"的递送载体。例如，将所述多 核苷酸构建体插入rAAV rh. 74的基因组、rAAV6的基因组或rAAV9的基因组。AAV rh. 74 基因组的多核苷酸序列在图7和SEQ ID NO: 1中示出。
[0017] 示例性外显子2靶向反义序列包括但不限于
[0018] U7B TCAAAAGAAAACATTCACAAAATGGGTA(SEQ ID NO :3)；
[0019] U7Along GTTTTCTTTTGAAGATCTTCTCTTTCATcta(SEQ ID NO:4)；
[0020] U7Ashort AGATCTTCTCTTTCATcta(SEQ ID N0:5);和
[0021] U7C GCACAATTTTCTAAGGTAAGAAT(SEQ ID N0:6)〇
[0022] 在一方面，提供改善患者的DMD的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患者 施用rAAV的步骤，其中rAAV的基因组包含外显子2靶向U7snRNA多核苷酸构建体。
[0023] 在另一方面，本发明提供抑制与DMD相关的营养不良病理的进展的方法。在一些 实施方案中，所述方法包括向患者施用rAAV的步骤，其中rAAV的基因组包含外显子2靶向 U7snRNA多核苷酸构建体。
[0024] 在又一方面，提供改善罹患DMD的患者中的肌肉功能的方法。在一些实施方案中， 所述方法包括向患者施用rAAV的步骤，其中rAAV的基因组包含外显子2靶向U7snRNA多 核苷酸构建体。在一些实例中，肌肉功能的改善是肌肉强度的改善。肌肉强度的改善通过 本领域已知的技术确定，所述技术诸如最大自主等长收缩测试（MVICT)。在一些实例中，肌 肉功能的改善是站立和行走时稳定性的改善。稳定性强度的改善通过本领域已知的技术确 定，所述技术诸如6分钟行走