一种用于光动力治疗的靶向探针及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于光动力治疗的靶向探针及制备方法。所述靶向探针包括一种合成的载药微泡和其连接的靶向分子小肽LHRH(促性腺激素释放激素)，以及其包裹的光敏剂ZnPc(酞菁锌)。相对于传统光敏剂，本发明克服了现有光敏剂无靶向性，难以富集达到有效浓度，易团聚，不易递送至肿瘤部位，多局限于表皮或浅组织区域的肿瘤部位的缺点，提供一种靶向性高，组织穿透力强，稳定性好且特异性强的一种用于光动力治疗的同时具有超声信号、光声信号和荧光信号的靶向多模探针。
【专利说明】
一种用于光动力治疗的靶向探针及制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于光动力治疗的可以多模态成像的靶向探针及制备方法，可用于超声成像、光声成像以及荧光成像。
【背景技术】
[0002]与常规的手术、化疗、放疗等常规治疗手段相比，光动力学疗法(PhotodynamictherapyADT)是近20年来兴起的一种新型的恶性肿瘤治疗方法，它是利用光化学反应以及其引发的一系列生理免疫反应达到对恶性肿瘤的治疗目的，具有许多重要的优点:(I)选择性好;光动力学疗法是通过光照激发光化学反应进行治疗，仅在光照范围内有效，因此对光照范围外的正常组织与细胞几乎无损伤。(2)毒副所用小；进入组织的光动力学药物，只有达到一定浓度并受到足量光辐射，才会引发光毒反应杀伤肿瘤细胞。人体未受到光辐照的部分，并不产生光毒反应，故体内造血功能、免疫功能、各脏器功能均不会受到影响。换句话说，光动力学疗法没有放疗、化疗的严重毒性反应。(3)微创性;借助光纤、内窥镜、彩色B超和其他介入技术，可将激光引导到病变组织进行治疗，避免了开胸、开腹手术造成的创伤和痛苦。(4)可协同其他治疗方法同期治疗。(5)可重复治疗；由于光敏剂本身无毒性，肿瘤细胞对光敏剂没有耐药性，因此光动力学疗法可重复使用。
[0003]光动力学疗法的基本原理是光敏剂(Photosensitizer)首先选择性地聚集于肿瘤组织周围，在特定波长的光激发下，光敏剂被激发至激发态。激发态的光敏剂能够激发组织中的溶解氧成为具有高氧化性的单线态氧以及其他形式的活性氧(reactive oxygenSpeCieS，R0S);这类活性氧具有生物毒性，能够破坏蛋白质、核酸等生物大分子，从而导致肿瘤细胞坏死。目前全世界已有数万例患者接受了该疗法的治疗，其治疗的癌症多达数十种，包括食管癌、肺癌、脑瘤、头颈部癌症、眼肿瘤、咽癌、胸壁肿瘤、乳腺癌、胸膜间皮瘤、腹腔肉瘤、膀胱癌、妇科肿瘤、直肠癌、皮肤癌等。
[0004]在光动力疗法的开展中，光敏剂的选择与使用是其核心问题。用于光动力学治疗的光敏剂应该具有以下条件:(I)最大吸收波长在600-800nm之间，并且在400_600nm之间的吸收要尽量小；(2)要有较高的单线态氧产率；(3)光毒性强而暗毒性弱；(4)在恶性肿瘤组织中保留比较高；(5)组分单一；(6)具有水溶性；(7)具有荧光。目前临床用于治疗的光敏剂大多为卟啉类衍生物，如国际上最早批准临床使用的Photofrin系列。卩卜啉类衍生物光敏剂存在着一些局限性，如:组分不确定、在适于治疗的红光范围内摩尔消光系数低、毒副作用大等。与卟啉类衍生物相比，酞菁类衍生物有着下列明显的优势:其最大吸收波长在最适于治疗的600-800nm范围内；并且其摩尔消光系数高，单线态氧量子产率高。因此，酞菁作为第二代光敏剂的典型代表被广泛研究，并在诸多酞菁类化合物中，中间金属为锌的酞菁类化合物经检验具有相对较高的单线态氧产率。同样，酞菁类衍生物也具有其局限性，即水溶性以及对肿瘤细胞的选择性。因此，如何增强酞菁类衍生物的水溶性及其对肿瘤细胞的识别能力是目前光敏剂研究的重点。
[0005]促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH，氨基酸序列为:EHffSYGLRPG)，也被称作黄体生成素释放激素(Luteinizing-hormone-releasing hormone，LHRH)，是一种由下丘脑控制释放的神经激素。促性腺激素释放素在体内调控促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黄体生长激素(luteinizing hormone,LH)的释放。促性腺激素释放素的受体(Luteinizing-hormone-releasing hormone Receptors，LHRHR)是一种G蛋白偶联受体，在乳腺癌(> 50 % )，卵巢癌(>80 % )，子宫内膜癌(>80 % )等性激素调控的恶性肿瘤细胞中大量表达。因此LHRH类似物(Lute ini z ing-hormone-releasing hormone analogue，LHRHA)对于这些表面高表达LHRH受体的细胞具有较好识别能力，常被用作肿瘤细胞的靶向基团。LHRH类似物的衍生物，如LHRH连接的纳米颗粒、细胞毒素、化疗药物等，可通过其LHRH类似物基团与肿瘤细胞相互作用，特异性识别肿瘤细胞并富集于肿瘤细胞周围，以达到治疗效果。而绝大多数正常细胞并不表达该受体，因此，它们在正常细胞周围不富集，减少了对正常细胞的毒副作用。
【发明内容】
[0006]本发明主要针对金属酞菁类光敏剂存在的水溶性差、对肿瘤细胞选择性差、肿瘤部位富集浓度低、无法观测以及光动力疗法所采用的荧光成像模式单一等缺陷，提供了一种水溶性好、具有肿瘤靶向性、可以多模态成像的新型光敏剂探针。
[0007]根据本发明一方面，提供了一种用于光动力治疗的靶向探针，包括:
[0008]载药微泡和包裹在载药微泡内部的光敏剂，在载药微泡外壳上连接有靶向分子；
[0009]所述靶向探针能够多模态成像。
[0010]根据本发明第二方面，提供了一种用于光动力治疗的靶向探针的制备方法，包括:[0011 ]形成包裹光敏剂的载药微泡；
[0012]将所述载药微泡与靶向分子连接，制备得到所述靶向探针。
[0013]本发明所述的探针，既可用作超声造影剂和光声造影剂，还可进行荧光成像，进行药物定位释放，具有肿瘤靶向性。相对于传统光敏剂，本发明克服了现有光敏剂无靶向性，难以富集达到有效浓度，易团聚，不易递送至肿瘤部位，多局限于表皮或浅组织区域的肿瘤部位的缺点，提供一种靶向性高，组织穿透力强，稳定性好且特异性强的一种用于光动力治疗的同时具有超声信号、光声信号和焚光信号的革G向多模探针。
【附图说明】
[0014]图1是本发明一种用于光动力治疗的靶向探针的结构示意图。
【具体实施方式】
[0015]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0016]如图1所示，本发明提出了一种用于光动力治疗的可以超声光声和荧光成像的靶向探针，包括载药微泡和包裹在载药微泡内部的光敏剂，在载药微泡外壳上连接有靶向分子。
[0017]所述光敏剂为具有光声信号的光敏剂。其中，在一优选实施例中，所述光敏剂选用ZnPc(酞菁锌)；在另一实施例中，所述靶向分子选用LHRH(促性腺激素释放激素)。
[0018]促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH，氨基酸序列为:EHffSYGLRPG)，也被称作黄体生成素释放激素(Luteinizing-hormone-releasing hormone，LHRH)，是一种由下丘脑控制释放的神经激素。促性腺激素释放素在体内调控促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黄体生长激素(luteinizing hormone,LH)的释放。促性腺激素释放素的受体(Luteinizing-hormone-releasing hormone Receptors，LHRHR)是一种G蛋白偶联受体，在乳腺癌(> 50 % )，卵巢癌(>80 % )，子宫内膜癌(>80 % )等性激素调控的恶性肿瘤细胞中大量表达。因此LHRH类似物(Lute ini z ing-hormone-releasing hormone analogue，LHRHA)对于这些表面高表达LHRH受体的细胞具有较好识别能力，常被用作肿瘤细胞的靶向基团。LHRH类似物的衍生物，如LHRH连接的纳米颗粒、细胞毒素、化疗药物等，可通过其LHRH类似物基团与肿瘤细胞相互作用，特异性识别肿瘤细胞并富集于肿瘤细胞周围，以达到治疗效果。而绝大多数正常细胞并不表达该受体，因此，它们在正常细胞周围不富集，减少了对正常细胞的毒副作用。
[0019]因此，本实施例中通过将LHRH连接载药微泡外壳上，使得所述探针能够靶向表面高表达LHRH受体的细胞，同时由于对光敏剂包裹微泡，可以增加其靶向性和在体内运输能力和滞留时间，将其通过尾静脉注射方式打入活体小鼠体内，用超声成像技术观测探针在活体内部的递送情况，当其到达肿瘤部位时，可以采用高频超声将微泡击破，释放药物。而过一段时间后，其余探针随体内血液流动又会重新向肿瘤部位聚集，此时可以重新采用高频超声击破微泡释放药物。对这一过程重复多次直至光敏剂达到有效浓度。
[0020]所述一种用于光动力治疗的靶向超声光声荧光多模探针的粒径在400-600nm之间，优选为500nmo
[0021]本发明所述探针对LHRHR(促性腺激素释放素受体)高表达细胞表面具有靶向性。
[0022]载药微泡具有EPR效应(即实体瘤的高通透性和滞留效应)，可以自动向肿瘤聚集。
[0023]本发明提出的靶向探针可以实现多模态成像，所述多模态成像包括超声成像、在体光声成像和焚光成像。
[0024]本发明还提出了一种用于光动力治疗的靶向探针的制备方法，其包括:
[0025]在步骤101中，形成包裹光敏剂的载药微泡；
[0026]在步骤102中，将所述载药微泡与靶向分子连接，制备得到所述靶向探针。
?0027] 其中，在一实施例中，所述光敏剂选用ZnPc(酞菁锌)；在另一实施例中，所述革巴向分子选用LHRH(促性腺激素释放激素)。
[0028]所述步骤101进一步包括:
[0029 ]取磷脂 DPPA、MAL-PEG、PEG-DSPE、HSPC 和 ZnPc ；
[0030]将磷脂DPPA、MAL-PEG、PEG-DSPE、HSPC和氯仿以第一预定比例如1:2.5:1:18:3溶解在一起；
[0031]将ZnPc与甲醇以第二预定比例如1:2溶解在一起；
[0032]待两份溶液完全溶解后将之混合在一起，放入一定体积的离心管中，如15ml，以第三预定比例如I: I加入水进行离心操作；
[0033]完成离心后去除液体，加入氯仿进行旋转真空蒸发成膜；
[0034]然后加入水化液，震荡洗膜，形成脂质体混悬液；
[0035]加水定容至预定体积如4ml，之后将全氟炳烷灌入，水平震荡预定时间，如45s;
[0036]然后进行转速离心操作，去除液体，冷冻过夜，之后放入冻干机，例如，所述离心操作可以为转速5000rpm的1min离心操作，以形成包裹ZnPc的载药微泡。
[0037]肿瘤细胞体外靶向性及成像效果实验:
[0038]实验选取了4种细胞:无LHRH受体表达的正常人胚肺成纤维细胞HELF、LHRH受体表达量极低的人肝癌细胞HepG2以及大量表达LHRH受体的人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231。具体实验步骤如下:(I)细胞培养条件:HELF和H印G2用含10%胎牛血清的RPM1-1640培养基培养;MCF-7用含10%胎牛血清、0.01mg/mL牛胰岛素的RPM1-1640培养基培养;MDA-MB-231用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。细胞在37°C，5%⑶2条件下培养；(2)体外光动力学实验:实验时将细胞接种于黑底96孔培养板，每孔5 X 104个细胞，37 °C下培养24h使其贴壁生长。待其贴壁后，加药孵育12h，换新鲜培养基，并于37 °C培养24h后，用AlamarBlue检测细胞存活率:即每孔加入10yL新鲜培养基后，再加入1yL AlamarBlue试剂，37°C下培养2h后，用超声成像、光声成像以及荧光成像技术分别成像，对比观察所得图像。
[0039]以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种用于光动力治疗的靶向探针，其特征在于，包括: 载药微泡和包裹在载药微泡内部的光敏剂，在载药微泡外壳上连接有靶向分子； 所述靶向探针能够多模态成像。2.根据权利要求1所述的靶向探针，其特征在于，所述多模态成像包括:超声成像、光声成像和荧光成像。3.根据权利要求1所述的靶向探针，其特征在于:所述靶向探针的粒径在400-600nm之间。4.根据权利要求1所述的靶向探针，其特征在于:所述靶向探针对促性腺激素释放素受体高表达细胞表面具有靶向性。5.根据权利要求1或2所述的靶向探针，其特征在于:所述载药微泡具有EPR效应，能够自动向肿瘤聚集。6.根据权利要求1或2所述的靶向探针，其特征在于:所述光敏剂为ZnPc。7.根据权利要求1-4任一项所述的靶向探针，其特征在于:所述靶向分子为LHRH。8.根据权利要求1所述的一种用于光动力治疗的靶向超声光声荧光多模探针，其特征在于:所述靶向探针进入活体内部后，可通过高频超声击破载药微泡，而定位释放光敏剂。9.一种用于光动力治疗的靶向探针的制备方法，其特征在于，包括: 形成包裹光敏剂的载药微泡； 将所述载药微泡与靶向分子连接，制备得到所述靶向探针。10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述光敏剂为ZnPc，所述靶向分子为LHRH;所述形成包裹光敏剂的载药微泡，包括: 取磷脂 DPPA、MAL-PEG、PEG-DSPE、HSPC 和 ZnPc ； 将磷脂DPPA、MAL-PEG、PEG-DSPE、HSPC和氯仿以第一预定比例溶解在一起； 将ZnPc与甲醇以第二预定比例溶解在一起； 待两份溶液完全溶解后将之混合在一起，放入一定体积的离心管中，以第三预定比例加入水进行离心操作； 完成离心后去除液体，加入氯仿进行旋转真空蒸发成膜； 然后加入水化液，震荡洗膜，形成脂质体混悬液； 加水定容至预定体积，之后将全氟炳烷灌入，水平震荡预定时间； 然后进行离心操作，去除液体，冷冻过夜，之后放入冻干机，以形成包裹ZnPc的载药微泡。
【文档编号】A61K41/00GK105879029SQ201610453781
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】田捷, 朱玉坤, 王坤, 邱晨, 李辉
【申请人】中国科学院自动化研究所