一种ZnPc‑UCNP‑PEG‑G纳米复合物的制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体是一种ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物的制备方法。

背景技术：

光动力治疗又称作光化学治疗 (Photodynamic therapy, PDT) 它是指利用特定波长的光照射事先局部或全身注入机体的药物(光敏剂, PS)，光敏剂随之活化并与氧分子作用产生具有细胞毒性的活性氧 (ROS) ，经过直接与间接作用对肿瘤组织产生不可逆的损伤。光动力学治疗不同于传统的治疗肿瘤手段，它对靶组织及损伤程度都具有可选择性，可减少对正常组织的损伤，在人体内能较快代谢，避免对身体其它部位产生毒性，化学稳定性和光稳定性高等优点。但是传统的光动力疗法仍存在一些不足，如光敏剂对肿瘤组织的靶向性不足，同时由于光敏剂的吸收波长较短，其组织穿透能力有限，因此，对体积较大的肿瘤或深层肿瘤的治疗效果不佳。现如今，纳米技术的快速发展为解决光动力治疗中光敏剂的肿瘤靶向性及治疗深度等问题提供了新途径。

分子靶向治疗是指在细胞分子水平上通过已确定的致癌位点(即与肿瘤细胞和肿瘤组织相关的特异性分子靶点，该靶点可能是肿瘤细胞内某一蛋白质分子、某一核酸片段或者某一基因产物)，设计相应配体或抗体与特异性位点相结合，从而有效的抑制基因癌变或者阻断细胞信号传导通路以及肿瘤血管形成，最终导致肿瘤细胞死亡而不会伤害正常细胞的一种全新的治疗模式。与传统的化疗和放疗治疗方式相比，分子靶向治疗有很高的选择性，在对肿瘤细胞高效杀伤的同时还能保证较低损伤正常组织的理想治疗结果。小分子靶向药物吉非替尼是一种选择性表皮生长因子受体 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂，酪氨酸激酶通常表达于上皮来源的实体肿瘤之中，可通过对EGFR酪氨酸激酶活性的抑制来间接抑制肿瘤细胞的生长和血管生成，并加速肿瘤细胞的凋亡。吉非替尼（Gefitinib）在2003年被美国 FDA 批准用于治疗非小细胞肺癌，是首个获得批准上市的用于治疗非小细胞肺癌 (NSCLC) 的口服型小分子靶向药物。临床试验结果显示，吉非替尼对结肠癌、前列腺癌、乳腺癌及头颈部肿瘤等治疗均证实有效。

稀土上转换发光材料 (upconversion luminescence nanoparticles,UCNPs) 是一种能被近红外光 (NIR) 激发而发出可见光的发光材料，即上转换纳米材料可通过多光子机制把长波转换成短波，因此被称之为“上转换”。由于上转换材料的发光过程违背了斯托克斯 (Stokes) 定律，因此又被称为反斯托克斯 (anti-Stokes) 定律发光材料。上转换纳米材料具有稳定且独特的发光性质，对细胞的毒性低，其激发波长处在近红外区(通常为980 nm，位于生物组织的光透过窗口800-1200 nm范围内)，对生物组织的穿透性能力强，且不会对组织、蛋白质等造成光伤害，同时能有效的降低检测的背景自荧光，提高荧光信噪比，因此在生物标记、多模成像、药物运输和光动力治疗等方面有着广阔的应用前景。

在UCNP /光敏剂纳米系统引入分子靶点药，通过制备分子靶向抗癌纳米平台系统，使肿瘤药物治疗的切入点由目前研究的细胞水平提高至分子水平。合成的UCNP/光敏剂/吉非替尼化合物中，UCNP和光敏剂的FRET作用可解决肿瘤治疗深度问题，光敏剂和吉非替尼分子靶点药的协同作用可解决靶向性不强和药物在肿瘤细胞的滞留时间短的问题。这些优点为该设计体系成为新型分子靶向光动力载药平台提供了极大可能。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物的制备及其应用，解决了光动力治疗中药物靶向性不足及治疗深度浅的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物的制备方法，具体步骤如下：

（1）称取0.4 g NaOH于100 mL 反应釜中，再分别加入20 mL去离子水，30 mL乙醇，7.5 mL的油酸和4 mL的正己烷，搅拌混匀为溶液Ⅰ；称取0.8 mmol稀土硝酸盐溶解在5 mL去离子水中，以20滴/min滴入溶液Ⅰ得溶液Ⅱ，再称取3.2 mmol NaF溶解在5 mL去离子水中加入到溶液Ⅱ中，置于180 ℃下反应6 h；反应结束后自然冷却至室温，用30 mL环己烷分三次萃取，收集环己烷层，加入过量乙醇离心收集；再用去离子水和乙醇交替洗3次，最后分散在10 mL 环己烷中待用；

（2）量取8 mL 步骤（1）的UCNPs的环己烷溶液，加入12 mL环己烷和10 mL二氯甲烷；再加入25 mg间氯过氧苯甲酸，升温至54 ℃搅拌回流3 h，冷却至室温，加入1.0 g PEG-OH继续反应8 h；反应结束后，减压旋干，再用乙醇和去离子水交替洗3次，-60℃冻干得到UCNP-PEG-OH；

（3）称取3 mg β -ZnPc-COOH和8 mg HOOC-PEG-COOH溶于5 mL DMSO中得到混合液Ⅰ，再称取6 mg N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）和4 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP）分别溶在200 μL的DMSO中，加入到混合液Ⅰ中搅拌1 h，再加入30 mg 步骤（2）产物，室温下反应48 h；离心收集，用DMSO洗3次，-60℃冻干得到ZnPc-UCNP-PEG-COOH；

（4）将步骤（3）产物溶在12 mL DMSO中，加入7 mg DCC和5 mg DMAP搅拌1h，加入化合物G，室温下反应48 h；离心收集，用DMSO洗3次，得到产物ZnPc-UCNP-PEG-G。

所述的稀土硝酸盐为Y(NO₃)·6H₂O和Yb(NO₃) ·5H₂O和Er(NO₃) ·5H₂O以质量比68:30:2混合。

步骤（4）中化合物G的加入量为反应产物总量的5%~20%。

所述化合物G为8-羟基-3,6烷氧杂辛基-吉非替尼。

本发明的有益效果在于：

1）本发明将合成ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物，解决光动力治疗中药物靶向性不足，治疗深度浅的问题。

2）合成的ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物粒径均匀，荧光共振能量转移效率高，在980nm激发下单线态氧产率高，解决了治疗深度浅的问题。

3）合成的ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物表现出优越的光动力活性，在体外光动力治疗过程对细胞的杀伤能力具有一定的剂量依赖性，随着浓度的增加，杀伤能力增强，而在无光照条件下对细胞未表现出明显的杀伤作用。

4) 合成的ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物对癌细胞具有明显的靶向性，而在正常细胞中分布较少，降低了癌症治疗过程中的副作用。

附图说明

图1是 (a)上转换纳米粒子NaYF₄:Yb³⁺,Er³⁺ (UCNPs)的X射线衍射图；

图2是 (a)上转换纳米粒子NaYF₄:Yb³⁺,Er³⁺ (UCNPs)与 (b) UCNP-PEG-OH的TEM图；

图3是UCNPs上转换纳米粒子和UCNP-PEG-OH的红外光谱图；

图4是 NaYF₄:Yb³⁺,Er³⁺ (UCNPs)上转换发光图；

图5中Ⅰ和Ⅱ为UCNPs对应的荧光发射光，Ⅲ和Ⅳ为ZnPc-UCNP-PEG对应的荧光发射光；

图6a 为DPBF, UCNPs, UCNP-PEG, β-ZnPc-COOH, ZnPc-UCNP-PEG, ZnPc-UCNP- PEG-G的Ф比较图；图6b为ZnPc-UCNP-PEG-G不同条件下的Ф比较图；

图7是HepG2细胞 (圆形) 和HELF细胞 (条形) 对ZnPc-UCNP-PEG-G竞争摄取24 h激光共聚焦成像图；

图8是目标物ZnPc-UCNP-PEG-G和对照物ZnPc-UCNP-PEG对HepG2细胞孵育24 h后的荧光统计数据柱状图；

图9a和图9b是ZnPc-UCNP-PEG-G在癌细胞HepG2中的摄取，指示的UCNPs和β -ZnPc-COOH的共同定位在细胞内；

图10无光照下不同浓度ZnPc-UCNP-PEG-G和ZnPc-UCNP-PEG孵育下HepG2细胞存活率图；

图11是有光照下不同浓度ZnPc-UCNP-PEG-G和ZnPc-UCNP-PEG孵育下HepG2细胞存活率图。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此:

实施例1

一种ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物的制备方法，具体步骤为：

1) 称取0.4 g NaOH于100 mL 反应釜中，再分别量取20 mL去离子水，30 mL乙醇，7.5 mL的油酸和4 mL的正己烷，搅拌让其形成均匀的溶液。称取0.8 mmol稀土硝酸盐 （0.2390 g Y(NO₃)·6H₂O，0.1065 g Yb(NO₃) ·5H₂O，0.0069 g Er(NO₃) ·5H₂O）溶解在5 mL去离子水中以20滴/min滴入到上述反应液中，再称取0.1314 g (3.2 mmol) NaF溶解在5 mL 去离子水中加入到反应液中，取出搅拌磁子封装置于烘箱中180 ℃下反应6 h。反应结束后自然冷却至室温，用30 mL 环己烷分三次萃取，收集环己烷层，加入过量乙醇离心收集。再用去离子水和乙醇交替洗3次，最后分散在10 mL 环己烷中待用。

2) 量取8 mL UCNPs的环己烷溶液，加入12 mL环己烷和10 mL二氯甲烷，再称取25 mg 间氯过氧苯甲酸，升温至54 ℃搅拌回流3 h后，冷却至室温，加入1.0 g PEG-OH继续反应8 h。反应结束后，减压旋干，再用乙醇和去离子水交替洗3次，-60℃冻干得到UCNP-PEG-OH。

3) 称取3 mg β-ZnPc-COOH和8 mg HOOC-PEG-COOH溶于5 mL DMSO中，再称取6 mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC) 和4 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)分别溶在200 μL的DMSO中加入到上述反应液中搅拌1 h，活化羧基，加入30 mg UCNP-PEG- OH室温下反应48 h。离心收集，用DMSO洗3次，-60℃冻干得到β -ZnPc-COOH和HOOC-PEG-COOH加载的上转换纳米粒子产物简写为ZnPc-UCNP-PEG-COOH。

4) 将上一步的产物ZnPc-UCNP-PEG-COOH溶在12 mL DMSO中加入7 mg DCC和5 mg DMAP搅拌一小时，活化羧基，加入8 mg化合物G，室温下反应48 h。离心收集，用DMSO洗3次，冻干得到的产物简写为ZnPc-UCNP-PEG-G。

所述化合物G为8-羟基-3,6烷氧杂辛基-吉非替尼。

应用实施例1

通过ZnPc-UCNP -PEG-G纳米复合物单线态氧产率的研究，研究其光的组织穿透能力，为研究治疗深度提供参考，具有较重要的意义。

采用化学探针1,3 二苯基异苯并呋喃(DPBF) 对ZnPc-UCNP -PEG-G纳米体系在980 nm激光照射下单线态氧的产生能力进行检测。具体实验操作方法为：称取少量的DPBF用DMSO充分溶解，然后调节使其在420 nm处的吸光度值为1，同时调整ZnPc-UCNP-PEG-G的DMSO溶液在670 nm处的吸光度值也为1。取1 mL的DMSO溶剂和1 mL的ZnPc-UCNP- PEG-G溶液于比色皿中充分混合，作为参比消除系统误差，再取DPBF和ZnPc-UCNP-PEG-G的DMSO溶液各1 mL混合均匀，测定其在420 nm处的吸光度值，此时为0 s时DPBF的吸光度值，然后用功率密度为1 W/cm²的980 nm的激光器照射比色皿中的混合溶液，每照射30 s测一下吸光度，测10个时间点。分别对DPBF，UCNPs，UCNP-PEG，β -ZnPc-COOH，ZnPc-UCNP-PEG，ZnPc-UCNP-PEG-G溶液的¹O₂进行测量。测试结果如图6a和图6b所示。在比色皿口加一层1 cm厚的组织，用670 nm和980 nm波长的激光分别来测定ZnPc-UCNP-PEG-G的Ф 单线态氧产率，并与未加组织的做比较。

由图6a和图6b实验数据可以看出，加了1 cm的组织覆盖后，用980 nm光照射的单线态氧产率仅下降了40.68 %，而用670 nm光照射的单线态氧产率下降了88.9 %。因此，与用670 nm的光直接激发β -ZnPc-COOH相比，用980 nm的光间接激发β -ZnPc-COOH具有穿透厚组织的优点，进一步凸显了ZnPc-UCNP-PEG-G在实体或深层肿瘤治疗的适用性。

应用实施例2

药物能否有效的杀死肿瘤细胞或者对肿瘤细胞造成一定的损伤跟肿瘤细胞对药物的摄取量有很大的关系，因此，研究细胞对药物的摄取量很有必要

选取处于对数生长期的HepG2细胞，经过PBS洗涤后加胰酶消化处理，再加入培养基将细胞吹打均匀，离心后加入新的培养基将细胞再次吹打均匀，对细胞进行计数，用培养基将细胞稀释至30万cell/mL，在96孔板中每孔加入以100 μL，每个药物设6个复孔，将细胞置于细胞培养箱中过夜生长。贴壁后弃去旧的培养基，每孔加入100 μL药物-培养基溶液(药物母液为64 mg/ mL，溶剂是DMSO；为了保证培养基中DMSO量≤ 1%故最终加药浓度为640 μg/ mL)，置于培养箱中孵育24 h。弃去上层培养基，用PBS洗涤三遍，以彻底除去未摄取的药物，然后向每孔中加入120 μL浓度为1%的SDS裂解液，将其置于37 ^oC摇床摇晃裂解30 min，以相应药物的激发波长的光激发，用多功能酶标仪检测其在最大发射波长处的荧光强度。

同时，做相应药物的标准曲线(8个浓度，2个复孔)：将药物均用SDS为溶剂从325 μg/ mL依次两倍稀释得到八个不同浓度，以相同条件测定各自的荧光强度，用Origin 8.5软件处理，做荧光强度-浓度直线图，即得各自药物的标准曲线。由实验组各孔的荧光强度经药物标准曲线即可得到各孔细胞摄取药物浓度。

利用BCA蛋白定量检测法，计算出各孔的蛋白含量(直接计算结果需扩大6倍，即为各实验组的值)。再以各孔的药物浓度值除以各孔蛋白总量，其比值则为单位蛋白中所含的光敏剂的量。用Graph Pad Prism 5.0统计分析软件对个比值做柱状图(图8)，结果以Mean±SEM表示，相同条件下重复三次平行实验。

连接了聚乙二醇修饰后的靶向分子吉非替尼 (G) 得到的ZnPc-UCNP-PEG-G在HepG2细胞中的摄取量远高于没有连接吉非替尼的ZnPc-UCNP-PEG，说明ZnPc-UCNP-PEG-G对肝癌细胞HepG2具有很好的靶向性。

应用实施例3

细胞毒性测试主要是研究光动力治疗中光的安全性，以及药物对细胞的毒性作用。

取生长状态良好的处在对数期的HepG2细胞，经过洗涤、消化处理后，对细胞进行计数，将计数好的细胞稀释至浓度为10万cell/mL，然后于96孔板中每孔接种100 μL，将细胞培养箱中过夜培养。将ZnPc-UCNP-PEG-G和ZnPc-UCNP -PEG用DMSO溶液配制7个浓度梯度的母液，再用培养基将各个浓度稀释100倍。经PBS洗涤3遍后，取100 μL稀释后的药物溶液加入至96孔板中的每个孔中，实验组设6个复孔。设置空白对照组和细胞对照组和实验组，加药完毕后置于放入细胞培养箱中孵育24 h。

暗毒实验：将之前加药处理过的细胞孵育24 h后，弃去之前旧的培养基，用PBS洗3遍，再向每孔中加入100 μL培养基，置于培养箱中孵育24 h。

光毒实验：孵育24 h后，弃去之前旧的培养基，用PBS洗3遍，再向每孔中加入100 μL新培养基，用980 nm LED灯照射20 min (功率密度为1.0 W/cm²)后，再将96孔板置于37 °C 恒温以及 5% CO₂培养基中继续孵育24 h。

OD值检测：将上述孵育完的细胞每孔加入10 μL已配好的MTT溶液(5 mg/mL)，置于培养箱中孵育4 h，弃去孔板中原来的液体，再在每孔加入100 μL DMSO，置于摇床中震荡半小时左右，待甲瓒完全溶解后，测定96孔板中每孔在570 nm处的OD值。将所得结果用 Graph Pad Prism 5.0 处理，结果以 Mean±SEM 表示。

实验结果表明ZnPc-UCNP-PEG-G纳米复合物对肝癌细胞HepG2具有明显的杀伤作用，并且杀伤能力具有一定的剂量依赖性，随着浓度的增加，杀伤能力增强，图10在无光照条件下ZnPc-UCNP-PEG对HepG2细胞无明显杀伤作用，而ZnPc-UCNP-PEG-G在一定的浓度范围内对HepG2细胞仍具有一定的杀伤作用，这说明吉非替尼的引入在提高了药物靶向性的同时还实现了吉非替尼的化疗作用，实现了靶向PDT和化疗的双重疗效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。