一种兔支气管败血波氏杆菌亚单位疫苗的制作方法

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌亚单位疫苗。

背景技术：

兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发。主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天气突变，兔的抵抗力下降，兔舍卫生不好，空气污浊等情况下，均可引起本病发生。本病的潜伏期7～10d。成年兔表现鼻炎和支气管炎。有多量的浆液性、黏液性鼻液流出。鼻炎长期不愈，鼻腔流出黏液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸困难，不食，消瘦等。仔兔多呈急性经过，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病变为鼻炎、化脓性鼻气管炎、化脓性支气管肺炎，个别的出现败血病变化。鼻腔、气管黏膜充血、水肿。鼻腔内有浆液性、黏液性或黏液脓性分泌物。在肺门支气管周围到肺的边缘见有支气管肺炎病灶。病变多见于心叶、尖叶，严重的病例，波及全肺叶。病变部隆起、坚硬，呈暗红色，褐色，进而为灰黄色。有些病例肺上有大小不等的脓疮。严重的占肺部的90％以上。有的肝脏表面有黄豆至蚕豆大的脓疮。脓疮破后可见黏稠的奶油状乳白色的脓汁。还见有心包炎、胸膜炎、胸腔积脓及肌肉脓肿等。

兔支气管败血波氏杆菌病主要采用生物安全措施和疫苗预防接种。其中生物安全措施主要包括：加强饲养管理，改善饲养环境，做好防疫工作；兔场最好坚持自繁自养；对新引进的兔，必须隔离观察1个月以上，经细菌学与血清学检查为阴性者方可入群。本病常与巴氏杆菌混合感染，兔群一旦发病，必须查明原因，消除外界刺激因素，隔离感染兔，以控制病原传播。兔支气管败血波氏杆菌病较难治愈，需要加强规模化兔场的免疫，目前主要用分离到的支气管败血波氏杆菌制成灭活菌苗，进行预防接种，每只兔皮下注射1mL，每年2次；也有用兔巴氏杆菌—波氏杆菌二联苗或巴氏杆菌—波氏杆菌—兔病毒性出血症三联苗预防接种(杜雅楠等,2006；黄艳艳等,2006)。但兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗容易出现细菌毒素残留问题，常导致免疫兔发病，因此，目前迫切需要一种能够防控该病的安全性、效力好的疫苗，从而弥补现有技术的不足。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种兔支气管败血波氏杆菌亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种兔支气管败血波氏杆菌，为兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(Rabbit Bordetella bronchiseptica QDBb01)，于2016年11月01日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016607。

本发明所筛选的兔支气管败血波氏杆菌用于制备疫苗；

本发明再一个方面提供一种兔支气管败血波氏杆菌亚单位疫苗，其中抗原为从上述的兔支气管败血波氏杆菌中提取的，具有免疫原性的蛋白；

其中蛋白的提取方法如下：将兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株的菌体破碎后，离心去除未破碎掉的细菌菌体和较重的细菌细胞内细胞器；将上清液高速离心后获得沉淀；用缓冲液溶解沉淀后，室温孵育后；再进行高速离心；沉淀溶解以后，用能够截留蛋白分子量在40kDa以上的半透膜透析掉小分子蛋白，透析液中的蛋白即为目的蛋白。

本发明实施例中提供的一种兔支气管败血波氏杆菌亚单位疫苗，其中氢氧化铝胶佐剂；

为了弥补现今兔支气管败血波氏杆菌疫苗的不足，本发明通过通过将分离到的兔支气管败血波氏杆菌进行培养，提供一种兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白的提取方法，并将提取出的抗原蛋白与氢氧化铝胶佐剂乳化混合，制备出了一种能够预防兔支气管败血波氏杆菌病的有效疫苗。

附图说明

图1：本发明的兔支气管败血波氏杆菌的分离及培养图；

图2：玻片凝集试验图；其中左(阳性菌)、中(样品菌)和右(生理盐水)

图3单菌落16S基因、Pm基因和Bb基因的PCR扩增结果图，其中“-”阴性水对照；“+”阳性菌对照。

具体实施方式

实施例1：兔支气管败血波氏杆菌的分离及培养

从山东省潍坊某兔场购进一批1.5～3.0kg兔子做猪瘟脾淋苗试验，出现以发病急、死亡快，口鼻出血，肺脏出血、淤血为特征的疾病，根据发病死亡兔的临床表现、剖检病变，初步怀疑兔巴氏杆菌或兔支气管败血波氏杆菌感染，于是取肺脏组织进行了细菌的分离和培养，进行玻片凝集试验进行验证；对培养单菌落进行16s和巴氏杆菌(Pm)基因或波氏杆菌(Bb)基因的PCR扩增，并克隆、测序，确诊该批兔是由兔支气管败血波氏杆菌感染引起的死亡。

1.1发病情况从山东潍坊购进一批1.5～3.0kg兔子做猪瘟脾淋苗测温试验，该批兔子只免疫过兔瘟疫苗，其它疫苗均未免疫，整体状态良好。

1.2临床及剖检症状一只体重大概2kg左右试验兔子，突然死亡，口鼻喷血，死前一天精神状态、采食和饮水良好，无任何疾病症状，无打斗外伤，发病兔口鼻出血，肺脏出血、淤血，肝脏有一叶成黄白色。

1.3实验室诊断

1.3.1细菌分离和培养

初步怀疑兔巴氏杆菌或兔支气管败血波氏杆菌感染，于是无菌取发病兔肺部组织病料均匀接种于巧克力琼脂平板培养基上，培养24小时形成中等菌落，呈灰白色，表面湿润、光滑，边缘整齐。详见图1。

1.3.2细菌鉴定

1.3.2.1革兰氏、美兰染色鉴定经革兰氏染色并在显微镜下观察确定，革兰氏染色为红色小球杆菌，表明该菌为革兰氏阴性菌；用美蓝染色，镜检，可见多形态、两极染色的小杆菌。

1.3.2.2玻片凝集试验鉴定采用兔支气管败血波氏杆菌阳性血清鉴定该分离样品菌，并用兔支气管败血波氏杆菌阳性菌和生理盐水分别做阳性和阴性对照，具体结果见图2。

1.3.3.3PCR鉴定利用检测原核生物用16S通用引物和巴氏杆菌(Pm)特定引物及设计的波氏杆菌(Bb)特定引物(上、下游引物序列详见表1)对单个菌落进行PCR扩增，并于1％琼脂糖凝胶中电泳，详见图3。

表1引物序列表

1.3.3.4目的基因序列测定将16S和Bb目的基因分别送上海生工测序，测序结果分析表明，该菌为兔支气管败血波氏杆菌，命名为QDBb01株。

1.3.3.5兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)灭活疫苗的制备

将菌种接种于鲍姜氏培养基，37℃摇床内培养48h。用灭菌生理盐水离心洗涤2次，再用生理盐水稀释至含菌数为200亿个/ml，按总体积0.4％加入甲醛，混匀，37℃灭活48小时，每隔6h混匀一次。经检验灭活合格者作为制苗用抗原。与氢氧化铝胶佐剂按体积比＝1：4进行配苗，制备成兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗，相当于成品含40亿个灭活菌/ml。免疫结果表明，本发明筛选的QDBb01株制备的疫苗对兔支气管败血波氏杆菌具有良好的免疫效果。并且，用目前市场上出售的兔支气管败血波氏杆菌疫苗进行免疫，再用本发明筛选的QDBb01株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明QDBb01株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于QDBb01株基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。

实施例2兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)的蛋白的提纯

将分离鉴定保存的兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)进行3％TSB培养，并4000r/min收集菌体，再用PH7.2Tris-Hcl重悬菌体，将重悬菌体超声波破碎，工作1s，间隔时间3s，全程时间12min，总共180次。4000r/min低速离心去除未破碎掉的细菌菌体和较重的细菌细胞内细胞器，取上清液于100000r/min，超速离心20min，去上清。将含外膜蛋白的沉淀用含2％Triton X-100的Tris-Hcl缓冲液溶解，室温下孵育1h去除内膜蛋白，再进行100000r/min超速离心30min，沉淀用缓冲液再重悬，采用能够截留蛋白分子量在40kDa以上(包含主要保护性抗原蛋白)的半透膜透析掉小分子蛋白，分装，置-20℃保存。

实施例3：兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)亚单位疫苗制备

将纯化好的兔支气管败血波氏杆菌蛋白用分光光度法按照以下步骤进行绝对定量：(1)加测蛋白用的PBS 0.15ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中作为对照，进行调零；(2)加测蛋白用PBS 0.14ml、加待测蛋白溶液0.01ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中测出吸光度值y为0.204，通过公式y＝0.152x+0.068得出蛋白浓度x＝0.83mg/ml，即为895μg/ml，以上所用测蛋白用试剂购自TIANGEN公司。将此纯化的蛋白溶液稀释成150ug/ml，与氢氧化铝胶佐剂按体积比＝1：4进行配苗，制备成兔支气管败血波氏杆菌亚单位疫苗，成品相当于每毫升氢氧化铝胶苗中含有蛋白30μg/ml。

实施例4：兔支气管败血波氏杆菌灭活苗和亚单位疫苗效力检验方法

4.1攻毒用菌液的制备将分离鉴定保存的兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)复苏挑取单菌落接种150ml 3％小牛血清鲍姜氏培养基，37℃过夜摇床培养兔支气管败血波氏杆菌，次日早上取出，进行菌落计数：将菌液进行10^-7倍稀释，取0.1ml进行涂板，然后计算菌落数为48个。结果，菌数为4.8×10⁹cfu/ml。

4.2攻毒菌液最小致死剂量(LD₅₀)的确定选择25只兔子，随机分成5组，每组5只，将上述菌液按照10^-1依次稀释成4.8×10⁷cfu/ml、4.8×10⁶cfu/ml、4.8×10⁵cfu/ml、4.8×10⁴cfu/ml四个梯度，以1ml/只的剂量进行攻菌，留1组作为空白对照。连续观察、记录兔子发病死亡情况，解剖观察病变情况，最终确定4.8×10⁵CFU为最小致死剂量。

4.3兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗、亚单位疫苗的攻毒保护试验将制备出的此灭活疫苗和亚单位疫苗成品分别按照1ml/只剂量皮下注射免疫体重1.5kg左右的家兔各10只，留10只作为未免疫对照组。免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(LD₅₀为4.8×10⁵CFU)按照100LD₅₀进行攻毒，攻毒后观察7日，统计家兔的攻毒保护率，以此来判定该疫苗的保护效果。结果，对照组10只全部发病，解剖上呼吸道病变均为支气管败血波氏杆菌典型症状；而亚单位疫苗和灭活苗免疫组攻毒后均健活，均未见发病，保护率均为10/10。但解剖两种疫苗的注射的部位发现，灭活苗吸收不完全，而制备的亚单位疫苗吸收完全，因此，制备的兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)亚单位疫苗较灭活苗具有更好的安全性。而且，与QDBb01株制备的灭活疫苗类似，本发明制备的亚单位疫苗对QDBb01株的免疫效果也在统计学意义上好于市场上的类似疫苗。