一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其 应用。
【背景技术】
[0002] 布氏杆菌病（布病）是由布氏杆菌（Brucella)引起的以流产和发热为特征的人 兽共患传染病，该病传染性强，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。布病在我国流行范 围广泛，危害严重，虽然自新中国成立后对布病开展了全面性的系统防御，但近些年来，该 病的疫情呈明显上升趋势，被列为再度肆虐的传染病，引起国内各地区的高度关注。
[0003]目前用于布鲁氏菌病防控的弱毒活疫苗主要有国外的牛型19号弱毒菌株（S19) 和羊型Rev. 1弱毒菌株，国内自主研制的羊型5号弱毒菌株（M5)和猪型2号弱毒菌株（S2)。 在我国主要使用由S2株（猪型2号苗）制备的弱毒疫苗，该疫苗适用的宿主广泛，毒力弱， 免疫保护持续时间较长，免疫保护效率较高，目前成功地防治了牛、羊、猪等布氏杆菌病；但 该疫苗和其它光滑型布鲁氏菌疫苗一样存在一定缺陷，即免疫动物后，会在动物机体诱导 产生S-LPS抗原"0"链特异性抗体，不能与野生菌株布鲁氏菌感染动物相区分，给布鲁氏菌 病的诊断带来了很大的麻烦，这在一定程度上限制了疫苗的使用。因此，研制一种既具有良 好的免疫保护效果，且安全性高，同时又能区分自然感染和疫苗免疫的标记型布鲁氏菌活 疫苗具有重要的实际意义。
[0004]bp26蛋白，又称为CP28(CytosolubleProtein)或0MP28,具有较强免疫原性，是 一种可以由细胞内向外释放的可溶性外周浆蛋白，在不同种型布鲁氏菌间具有高度保守 性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中检测出针对此抗原的特异性抗体。研究发现， bp26基因的缺失突变对布鲁氏菌的生物学特性和免疫原性几乎没有影响，常被作为布鲁氏 菌血清学检测的靶蛋白，被认为是目前布鲁氏菌最为合适的基因缺失疫苗分子标志之一。 但有研究发现仅缺失布鲁氏菌bp26蛋白分子作为诊断抗原存在假阳性现象，而且，不同宿 主动物对不同毒力菌株bp26基因编码蛋白的免疫原性存在差异，因此，以bp26蛋白作为鉴 别诊断抗原会影响布鲁氏菌基因缺失疫苗的实际应用效果，从而，双基因缺失的布鲁氏菌 减毒活疫苗受到越来越多的关注。
[0005] 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)是布鲁氏菌外膜的主要成分，是一种重要的 毒力因子，由类脂A、核心寡聚糖和0抗原三部分组成。LPS的完整性决定布鲁氏菌表型，对 LPS合成过程中所需酶的编码基因进行突变可导致产生结构不完整的粗糙型LPS，使其毒 力变弱，经常被用作减毒活菌苗候选株进行研究。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相 关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wboA、wz和wbkC。wboA基因编码一种糖基转 移酶，该酶参与布鲁氏菌LPS中0链的形成，该基因的缺失或破坏会影响布氏杆菌光滑型表 型的形成。RB51是由流产布鲁氏菌2308株通过利福平抗性筛选而获得，是一株缺少0-链 的粗糙型菌株，免疫动物后血清中不产生抗0-链抗体，可用于布鲁氏菌病血清学的鉴别诊 断。目前，RB51疫苗已被美国、墨西哥、智利等国家批准应用。
[0006] 布鲁氏菌的残余毒力是评价布鲁氏菌疫苗有效性的一个重要指标。一般疫苗要求 残余毒力不能太强，否则会引起免疫动物病，但也不能太弱，否则不能刺激机体产生保护性 免疫。研究表明，粗糙型布鲁氏菌虽然毒力下降，安全性提高，但可能由于过度弱化，致使免 疫动物不能产生足够的保护力。另外，有些粗糙型菌株免疫动物后，仍能产生微弱地针对 〇-侧链的抗体，从而干扰布病的检测，使粗糙型菌株作为布病疫苗的实际应用价值遭受质 疑。因此，研制既具有免疫保护作用，又能区分疫苗免疫和野生毒株感染的粗糙型布鲁氏菌 标记疫苗已成为布鲁氏菌病疫苗的未来发展方向。
[0007] 在防治布鲁氏菌感染过程中，机体的细胞免疫是控制布鲁氏菌感染的关键。L7/ L12蛋白是布鲁氏菌的一种核糖体蛋白，在菌体合成蛋白质多肽链的过程中通过与延伸因 子（EFs)相互作用发挥功能，在各种生物型布鲁氏菌中较为保守，是布鲁氏菌侵染宿主过 程中的优势抗原。有研究表明，L7/L12蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞，刺激 CD4+Thl淋巴辅助细胞释放IFN-y因子，从而起到增强免疫保护效果的作用。
[0008] 粗糙型布鲁氏菌基因缺失疫苗虽然能够解决目前布鲁氏菌病活疫苗存在的难题， 但可能会存在疫苗的免疫保护作用较弱的缺陷，这为疫苗的广泛使用带来了一定的限制。 利用某些蛋白分子多亚基聚合体的聚合功能，扩展免疫原性分子的免疫原性，达到增强疫 苗免疫保护效果的目的。目前报道的具有聚合和放大抗原免疫原性的多聚体蛋白主要是 2, 4_ 二氧四氢蝶啶合成酶（Lumazinesynthase，LS)〇
[0009]布鲁氏菌 2, 4_ 二氧四氢蝶啶合成酶（Brucellaspp.Lumazinesynthase，BLS)是 先以二聚体的形式形成稳定的五聚物，再由两个稳定的五聚体形成一个十聚体，因此，BLS 具有更高的热稳定性和更稳定的化学性质，有研究表明，在BLS的氨基末端插入外源性多 肽片段不会改变BLS的三维结构，这为BLS作为提高抗原免疫原性的聚合功能提供了基础 保证；此外，BLS具有较好的佐剂作用，JulianaCassataro等将0mp31的loop区的27个 氨基酸与BLS连接制备重组蛋白，免疫Balb/C小鼠后用绵羊附睾型布鲁氏菌攻毒，其保护 性与ReV. 1疫苗相当。
【发明内容】
[0010] 本发明的第一个目的是提供一种重组菌。
[0011] 本发明提供的重组菌是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编 码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌 株。
[0012] 上述重组菌中，所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基 因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因是将布鲁氏菌 的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基 因，且缺失所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段；
[0013] 所述布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列4的第58-582 位核苷酸分子；
[0014] 所述BLS蛋白的编码基因为序列表中序列2的第504-977位核苷酸分子；
[0015] 所述L7/L12蛋白的编码基因为序列表中序列2的第978-1352位核苷酸分子；
[0016] 所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列5的第1-897 位核苷酸分子。
[0017] 上述重组菌中，所述替换和所述缺失均通过同源重组的方式实现的；
[0018] 所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因 和L7/L12蛋白的编码基因是将含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白编码基因、L7/ L12蛋白编码基因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段导入所述布鲁氏菌中实现同 源重组；
[0019] 所述含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白编码基因、L7/L12蛋白编码基 因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段通过PUC19-SacB-bp26NC-BL重组载体导入 所述布鲁氏囷；
[0020] 所述PUC19-SacB-bp26Ne-BL重组载体为将序列表中序列2所示的缺失突变盒 bp26NC-BL插入pUC19-SacB载体的SacI和PstI酶切位点间，且保持pUC19-SacB载体的 其他序列不变得到的载体；
[0021 ] 所述缺失布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段是将含有wboA蛋白编码基 因上游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段导入所述布鲁氏菌中实现同源 重组；
[0022] 所述含有wboA蛋白编码基因上游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA 片段通过PUC19-SacB_wboAN/e重组载体导入所述布鲁氏菌；
[0023] 所述HJClQ-SacB-wboA^重组载体将序列3所示的缺失突变盒wboA-NC插入到 pUC19_SacB载体中的SacI和PstI酶切识别位点间，且保持pUC19_SacB载体的其他序列 不变得到的载体；
[0024] 所述bp26蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列2中第1-503 位；
[0025] 所述bp26蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列2中第 1353-2117 位；
[0026] 所述wboA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3中第1-618 位；
[0027] 所述wboA蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3中第 619-1209 位。
[0028] 上述重组菌中，所述含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白的编码基因、 L7/L12蛋白的编码基因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段为序列表中序列2 ;所 述含有wboA蛋白编码基因上游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段为序列 表中序列3。
[0029] 上述重组菌中，所述pUC19_SacB载体为将序列表中序列1所示的蔗糖敏感基因 (SacBD插入PUC19载体的Ndel酶切识别位点间得到的载体。
[0030] 上述重组菌中，所述布鲁氏菌为牛种布鲁氏菌；所述牛种布鲁氏菌具体为牛种布 鲁氏菌BH1菌株；所述牛种布鲁氏菌BH1菌株的保藏编号为CGMCCNo. 10571。
[0031 ] 本发明的第二个目的是提供牛种布鲁氏菌菌株BH1。
[0032] 本发明提供的牛种布鲁氏菌菌株BH1的保藏编号为CGMCCNo. 10571。
[0033] 本发明的第三个目的是提供一种布鲁氏菌疫苗。
[0034] 本发明提供的布鲁氏菌疫苗的活性成分为上述重组菌。
[0035] 上述布鲁氏菌疫苗是通过皮下、注射、口服或喷雾等方法来免疫动物的。
[0036] 本发明的第四个目的是提供上述重组菌或上述牛种布鲁氏菌菌株BH1的新用途。
[0037] 本发明提供了上述重组菌或上述牛种布鲁氏菌菌株BH1在制备如下1)_6)中的应 用：
[0038] 1)布鲁氏菌疫苗；
[0039] 2)降低动物组织载菌量的产品；
[0040]3)诱发细胞免疫的产品；
[0041] 4)诱发体液免疫的产品；
[0042] 5)预防和/或治疗布鲁氏菌病的产品；
[0043] 6)鉴别或辅助鉴别待测样本为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌 感染样本的产品。
[0044] 本发明的第五个目的是提供上述布鲁氏菌疫苗的新用途。
[0045] 本发明提供了上述布鲁氏菌疫苗在制备具有如下1)_5)中至少一种功能的产品 中的应用也属于本发明的保护范围：
[0046] 1)降低动物组织载菌量；
[0047] 2)诱发细胞免疫；
[0048] 3)诱发体液免疫；
[0049] 4)预防和/或治疗牛布鲁氏菌病和/或羊布鲁氏菌病和/或猪布鲁氏菌病；
[0050] 5)鉴别或辅助鉴别待测样本为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌 感染样本。
[0051] 本发明的最后一个目的是提供一种鉴别待测样本为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本 还是野生型布鲁氏菌感染样本的方法。
[0052] 本发明提供的鉴别待测样本为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌 感染样本的方法包括如下步骤：将待测样本与布鲁氏菌BH1Abp26AwboA-BL虎红平板凝 集抗原混匀，
[0053] 若所述待测样本与所述布鲁氏菌BH1Abp26AwboA-BL虎红平板凝集抗原发生凝 集反应，则待测样本为或候选为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本；
[0054] 若所述待测样本与所述布鲁氏菌BH1Abp26AwboA-BL虎红平板凝集抗原不发生 凝集反应，则待测样本为或候选为野生型布鲁氏菌感染样本。
[0055] 上述方法中，所述布鲁氏菌BH1Abp26AwboA-BL虎红平板凝集抗原的制备方法 具体如下：
[0056] (1)将上述重组菌接种于布氏琼脂培养基，37°C培养48h，用生理盐水洗涤并离 心，收集菌体。
[0057] (2)将120g氢氧化钠溶于2LPH8. 9的碳酸盐缓冲液，然后加入乳酸540mL，并用 PH8. 9碳酸盐缓冲液定容到6L，得到缓冲液。
[0058] (3)将4g虎红染料和396mL蒸馏水混匀，得到虎红染液。
[0059] (4)将步骤（1)的菌体和碳酸盐缓冲液混匀（按每克菌体加入22. 5mL碳酸盐缓冲 液的比例），得到菌悬液；然后将菌悬液与步骤（3)的虎红染液混匀（按每35mL菌悬液加 入lmL虎红染液），离心收集菌体沉淀。
[0060] (5)将步骤（4)收集的菌体沉淀与步骤（2)的缓冲液混匀（按每克菌体加入6mL 缓冲液），得到抗原。
[0061]