(6)用布鲁氏菌BH1Abp26AwboA-BL菌株阳性血清（兔血清）标化步骤（5)获得 的抗原，即得到布鲁氏菌BH1Abp26AwboA-BL虎红平板凝集抗原。
[0062] 本发明与现有技术相比，具有如下优点：
[0063] 1、本发明提供的牛种布鲁氏菌活疫苗是以自行从布鲁氏菌阳性的奶样中的分离 的牛种布鲁氏菌菌株为母本菌株经缺失bp26基因和wboA基因后得到的。
[0064] 2、本发明提供的牛种布鲁氏菌活疫苗一方面为粗糙型疫苗，用血清学方法可区分 疫苗免疫和自然流行野生菌株感染，另一方面缺失了bp26基因和wboA基因，可作为分子标 记利用ELISA或胶体金试纸条区分疫苗免疫和自然感染，从而解决了常规的布鲁氏菌疫苗 不能区分人工免疫接种还是野生菌感染的问题。
[0065] 3、本发明提供的牛种布鲁氏菌活疫苗是在临床分离株的基础上经缺失bp26基因 和wboA基因后得到的，其毒力较原有菌株下降，与现有布鲁氏菌病疫苗S2相当。
[0066] 4、本发明提供的牛种布鲁氏菌活疫苗通过保护性抗原L7/L12核蛋白表达量的增 加而加强疫苗的免疫防治效果。
[0067] 5、本发明提供的牛种布鲁氏菌活疫苗通过BLS聚合和放大抗原免疫原性的特性， 相比现有布鲁氏菌S2活疫苗，具有更好的免疫保护效果。
[0068] 本发明提供了一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用。本发明提供的牛种布 鲁氏菌分子标记疫苗株是将布鲁氏菌BH1的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码 基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌 株。通过实验证明：本发明的分子标记疫苗株BH1Abp26Awb〇A-BL对布鲁氏菌病具有良好 的免疫保护效果，毒力更小，安全性显著提高，可用于牛、羊和猪等家畜布鲁氏菌病的免疫 预防，通过免疫学技术能将野生株感染动物与免疫动物区分开来，对布鲁氏菌病的监测、诊 断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用价值。
【附图说明】
[0069] 图1为牛乳中Brucella分离株VirB8-PCR鉴定。其中，泳道1为DNA2000Marker; 泳道2~14为牛乳中布鲁氏菌分离株BH1~BH13 ;泳道15为阴性对照。
[0070] 图2为牛乳中Brucella分离株AMS0-PCR鉴定。其中，泳道1为DNA2000Marker; 泳道2~14为牛乳中布鲁氏菌分离株BH1~BH13 ;泳道15为阴性对照。
[0071] 图3为PUC19-SacB-bp26N/c-BL重组质粒PCR鉴定结果。其中，泳道1为DNA2000 Marker，泳道2为bp26-N片段，泳道3为BL融合片段，泳道4为bp26-C片段，泳道5为 bp26NC-BL片段。
[0072]图 4 为PUC19-SacB-wboAN/c鉴定结果。其中，泳道 1 为DNA2000Marker，泳道 2 为wboA-N片段，泳道3为wboA-C片段，泳道4为wboA-NC片段。
[0073] 图5为布鲁氏菌重组菌BH1Abp26AwboA-BL的PCR鉴定结果。图5A为以bp26_F/ bp26-R为引物PCR扩增产物；图5B为以wboA-F/wboA-R为引物PCR扩增产物。泳道1为 DNA2000Marker;泳道2为布鲁氏菌冊1八匕口26八《13〇4-1^菌株；泳道3为布鲁氏菌冊1菌 株；泳道4为阴性对照。
[0074] 图6为小鼠接种布鲁氏菌BH1Abp26AwboA-BL菌株后细胞因子水平检测。图6A 为INF-y水平的检测结果；图6B为IL-4水平的检测结果。其中，ConA为阳性对照；PBS为 阴性对照。
[0075] 图7为奶牛接种布鲁氏菌BH1Abp26AwboA-BL菌株后细胞因子INF-y水平检 测。
[0076] 图8为小鼠血清的ELISA检测结果。
[0077] 图9为奶牛血清的ELISA检测结果。
[0078] 保藏说明
[0079] 菌种名称：牛种布鲁氏菌
[0080]拉丁名：Brucellaabortus
[0081] 菌株编号：BH1菌株
[0082] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0083] 保藏机构简称：CGMCC
[0084] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0085] 保藏日期：2015年2月13日
[0086] 保藏中心登记入册编号：CGMCCNo. 10571
【具体实施方式】
[0087] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0088] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0089] 下述实施例中的质粒pKOBEG-SacB在文献"布鲁氏菌自杀载体的改建及其在突变 株构建中的应用，王玉飞等"中公开过，公众可从军事医学科学院微生物流行病研究所获 得。
[0090] 下述实施例中的布鲁氏菌S2活疫苗（S2株）和布鲁氏菌M5活疫苗（M5株）均是 金宇保灵生物制品有限公司的产品。
[0091] 下述实施例中的布鲁氏菌A19活疫苗（A19株）是齐鲁动物保健品有限公司的产 品。
[0092] 下述实施例中的布鲁氏菌强毒株544A在文献"流产布氏杆菌S19株bp26基因标 记疫苗株的构建及免疫原性初步研究"中公开过，公众可从内蒙古自治区农牧科学院动物 传染病所获得。
[0093] 下述实施例中的布鲁氏菌Mill株在文献"基因缺失粗糙型布鲁氏菌rS2_AWboA 株的构建及生物学特性研究"中公开过，公众可从内蒙古自治区农牧科学院动物传染病所 获得。
[0094] 实施例1、牛种布鲁氏菌BH1菌株的分离鉴定
[0095] 1、样品的采集
[0096] 选取来自内蒙古自治区呼和浩特市10个奶牛养殖场的奶牛，共1650头，按常规抽 检进行血清学检测，具体操作参照国标号GB/T18646-2002进行。
[0097] 对SAT检测为阳性（抗体效价1:200~1:800)的35头奶牛用聚维酮碘消毒液 擦洗乳房，然后用75%的酒精擦拭乳头，采样者同时进行手指擦拭消毒，每个乳头先弃去头 2~3把奶样，以排除杂菌的污染，每头奶牛取乳样5mL于无菌试管中，冷藏送至实验室。
[0098] 2、细菌培养
[0099] 将奶样混勾，8000rmp，4°C离心15min，弃去上清，取沉淀悬液300yL分别接种于 布鲁氏菌选择性培养基，置于5%C02、37°C培养箱中培养，每隔12h观察细菌生长情况。培 养4d后，在13个培养基上长出无色、透明、边缘整齐、隆起的露珠状菌落，分别将其命名为 BH1~BH13,对13个菌株进行染色鉴别，结果13个菌株革兰氏染色均呈阴性，柯氏染色均 呈红色，多为单个，有少数双或链状排列。
[0100] 3、PCR鉴定
[0101] 挑取上述13个菌株分别接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基，37°C200rmp培养48h， 采用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明分别提取13个菌株的基因组DNA。
[0102] 采用VirB8_PCR方法对13个菌株进行属的鉴定：分别以上述13个菌株的基因组 DNA为模板，采用Vir8-F和Vir8-R引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经2 %琼脂糖凝胶电 泳检测。其引物序列如下：
[0103]Vir8-F: 5，-GATATGAGCTCGTGTTGTGCGCCTGAAGCGCAAT-3，；
[0104]Vir8-R: 5 ' -CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGAGAAAATTGCTAGCACGAG-3 '。
[0105]PCR反应体系：10XPCRbuffer2. 5y1，dNTP(2. 5mmol/L)2y1，TaqDNA聚合酶 (2. 5U/y1)0. 3y1，引物（10yM)各1y1，模板1y1，用灭菌蒸馏水补至25y1。
[0106]PCR反应条件：95°C预变性5min;95°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸30s，进行 30个循环；72°C延伸lOmin。
[0107] 结果如图1所示：从图中可看出，13株菌株均能扩增出大小为719bp的特异条带， 而阴性对照无目的片段出现，表明13株菌株均属于布鲁氏菌。
[0108] 采用AMOS-PCR方法对13个菌株进行种/型的鉴定：分别以上述13个菌株的基因 组DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。其 引物序列如下：
[0109]IS711-F:5,-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3,；
[0110]A-R: 5 ' -GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3 ' ；
[0111]M-R: 5 ' -AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3 ' ；
[0112] 0-R: 5 ' -CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3 ' ；
[0113]S-R: 5 ' -GCGCGGTTTTCTGAAGGTTEAGG-3 '。
[0114]PCR反应体系：10XPCRbuffer2. 5y1，dNTP(2. 5mmol/L)2y1，TaqDNA聚合酶 (2. 5U/y1)0. 3y1，引物（10yM)各1y1，模板1y1，用灭菌蒸馏水补至25y1。
[0115]PCR反应条件：94°C预变性 5min;94°C变性 45s、60°C退火 45s、72°C延伸lmin，进 行30个循环；72°C延伸lOmin。
[0116] 结果如图2所示：从图中可看出，其中有7株菌株（BH1、BH2、BH5、BH7、BH8、BH9、 BH11)能扩增出大小为498bp的特异条带，而其余6株均扩增出大小为731bp的特异条带， 而阴性对照无目的片段出现。
[0117] 4、生化特性鉴定
[0118] 将上述扩增出大小为498bp的菌株（BH1、BH2、BH5、BH7、BH8、BH9、BH11)交叉划线 接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA)平板，挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)培养基， 37°C，200rmp培养48h，以Brucella标准菌株牛种544A为参考菌株，对布鲁氏菌分离株进 行生化特性鉴定。
[0119] 结果如表1所示：7株菌株（BH1、BH2、BH5、BH7、BH8、BH9、BH11)均符合牛种布鲁 氏菌的特性。
[0120] 表1、布鲁氏菌分离株的生化试验鉴定
[0121]
[0122] 5、生物学特性鉴定
[0123] 对上述鉴定的7株布鲁氏菌分离株（BH1、BH2、BH5、BH7、BH8、BH9、BH11)进行生物 学特性鉴定，以标准菌株牛种544A菌株为对照。
[0124] 结果如表2所示：7株菌株（BH1、BH2、BH5、BH7、BH8、BH9、BH11)均符合牛种布鲁 氏菌生物型1的特性，7株菌株均依赖C02，均产生硫化氢，在含硫堇（1:50000)的培养基上 不生长，在含碱性复红（1:50000)的培养基上生长，与A因子血清呈明显凝集反应，与M和 R因子血清无凝集现象。
[0125] 表2、布鲁氏菌分离株的生物学特性鉴定
[0126]
[0128] 6、布鲁氏菌分离株的毒力鉴定
[0129]将上述7株布鲁氏菌分离株（BH1、BH2、BH5、BH7、BH8、BH9、BH11)以1X106CFU/只 剂量接种18~20g雌性Balb/C小鼠，每组5只，腹股沟皮下接种，同时以544A菌株和A19 菌株为对照。于接种后15天剖杀，无菌采集脾脏分别加入lmL无菌生理盐水，制成悬液。用 生理盐水10倍梯度连续稀释，涂布于胰蛋白胨大豆琼脂平板，置于5% C02,37°C温箱培养 5~7天，测定细菌生长数量。
[0130] 结果如表3所示：接种BH1菌株小鼠的脾脏平均载菌量为8.94X 104CFU活菌，远 低于544A菌株和其他菌株的脾脏含菌量，与A19疫苗株相比，稍高于A19疫苗株的脾脏含 菌量。
[0131] 表3、Brucella分离株的小鼠脾脏载菌量测定结果
[0132]
[0133] 将BH1菌株以IX109CFU/只剂量感染250~300g雌性豚鼠，同时以A19疫苗为对 照，每组3只，腹股沟皮下接种。于接种后15天剖杀，无菌采集脾脏，取0.lg分别加入2ml 灭菌生理盐水制成悬液。用生理盐水10倍梯度连续稀释，分别取1:100和1:1000稀释液 涂布于胰蛋白胨大豆琼脂平板，置于5%C02,37°C温箱培养5~7天，根据细菌生长数量计 算每克脾脏含菌量。
[0134] 结果如表4所示：BH1菌株感染的豚鼠每克脾脏含菌量为1. 02X105CFU/g，稍高于 A19疫苗的豚鼠脾脏含菌量，A19疫苗的豚鼠脾脏含菌量为7. 86X104CFU/g。
[0135] 表4、不同菌株免疫的豚鼠脾脏含菌量测定结果
[0136]
[0137] 7、免疫保护性试验
[0138] 将