一种单基因缺失粗糙型布鲁氏菌及其疫苗的生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种单基因缺失粗糙型布鲁氏菌及其疫苗的生产方法。该重组菌株通过非抗性基因筛选技术，缺失布鲁氏菌2308株菌WboA基因1-897bp之间的碱基序列，使其失去了光滑型布鲁氏菌细胞壁LPS结构中O链形成的条件，从而由光滑型转变为粗糙型。粗糙型重组菌株的安全性显著提高，但仍保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果，该重组牛种布鲁氏菌被命名为布鲁氏菌r2308-ΔWboA株(CGMCC?No.8885)。以此菌株生产疫苗将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并有效提高现有疫苗的安全性。
【专利说明】一种单基因缺失粗糙型布鲁氏菌及其疫苗的生产方法
[0001]【技术领域】本发明涉及一种单基因缺失粗糙型布鲁氏菌及其疫苗的生产方法，该疫苗为牛、羊和猪对布鲁氏菌病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。
技术背景
[0002]布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。
[0003]根据布鲁氏菌表型的差异，可将布鲁氏菌分为光滑型(S)和粗糙型(R)两类，目前在我国使用的布病活疫苗均为光滑型菌株，其免疫带来的主要问题是使用后无法区分疫苗免疫与自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。
[0004]虽然布鲁氏菌存在两种不同的表型，在凝集类抗体水平上无交叉反应，但却具有良好的交叉保护性，并且不同种来源的布鲁氏菌相互之间同样存在交叉保护能力。如果用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗生产用菌株和野毒株。基于上述原因，人们对粗糙型布鲁氏菌疫苗株的研发从未间断过。到目前为止，成功开发出具有良好免疫原性的粗糙型布鲁氏菌疫苗株却鲜有报道。
[0005]最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过人工诱变的方法获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉美的多个国家广泛使用。但目前该菌株在基因水平与原始菌株之间的的区别尚为完全弄清楚。
[0006]已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。本实验室曾构建了 wbkC和wboA基因缺失的重组布鲁氏菌疫苗株，并比较了它们之间的免疫效果。其后，又进一步构建了 wboA基因不完全缺失株，系统地研究了 wboA基因的不同缺失对重组菌的存活率、免疫保护性以及粗糙型表型等方面的特性，并最终确定了 wboA基因1-897之间的片段为缺失的靶片段。
[0007]虽然有报告通过插入抗性基因获得重组粗糙型布鲁氏菌，但由于抗性基因导致的潜在生物安全隐患限制了其作为疫苗开发的可能。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是通过基因同源重组和蔗糖敏感基因的负筛选技术，构建获得了具有生物安全意义和良好免疫原性的粗糙型布鲁氏菌，以该重组菌制备的布鲁氏菌病活疫苗具有比A19更好的安全性，且该疫苗免疫动物后不干扰布病的临床检测。
[0009]本发明的技术方案
[0010]1.一种单基因缺失粗糙型布鲁氏菌的疫苗生产菌株，该菌株是采用非抗性无痕缺失技术，缺失了布鲁氏菌2308株wboA基因l-897bp之间的序列，构建了能够不干扰布病临床诊断的粗糙型重组布鲁氏菌r2308-AWboA株，用该菌制备的布鲁氏菌病活疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，该重组的牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)r2308-Λ WboA菌株已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为=CGMCCN0.8885。
[0011]2.一种布鲁氏菌病疫苗，该疫苗含有活的布鲁氏菌CGMCC N0.8885株和兽用生物制品常用的冻干保护剂。
[0012]3.如权利要求2所述一种布鲁氏菌病疫苗的制备方法，该疫苗是用胰大豆肉汤作为重组菌的培养基，灭菌后按培养基量的按1%~2%接入布鲁氏菌CGMCC N0.8885株种子菌液，370C，按常规方法发酵培养28~38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为单基因缺失粗糙型r2308-AWboA株布鲁氏菌病疫苗。
[0013]4.一种基因缺失粗糙型布鲁氏菌的鉴别诊断，是用如序列7和序列8所属序列的一对特异性引物，通过PCR方法可以与非重组的原始菌相区分。
[0014]本发明是通过以下步骤实现的:
[0015]1.蔗糖敏感基因转移质粒构建将含有启动子序列的蔗糖敏感基因(SacBK，来自杀质粒pKNGlOl，购自英国NCCB。)通过NdeB酶克隆进pUC18载体中，构建重组质粒pUC-SacB。将WboA基因(I~897位)的上、下游同源臂(L和R)的PCR产物分别克隆进pUC18载体中，构建重组质粒pUC-L-R。通过一对引物，以pUC-L-R为模板，将包含L和R的片段扩增后通过Sal扩和Sma扩克隆进pUC_SacB质粒中，获得重组穿梭质粒pL_R_SacB。将重组穿梭质粒按常规方法电转化进布鲁氏菌2308株的感受态细胞中。
[0016] 2.重组菌的筛选与鉴定利用PUC18载体中的氨苄抗性(AmpK)以及克隆进的蔗糖抗性(SacBK)基因进行筛选。首先用50 μ g/ml Amp筛选出重组菌(第一次同源重组)，重组菌在不含氨苄的TSB培养后，再通过5%蔗糖TSA平板筛选出丢失氨苄抗性基因和蔗糖敏感基因全的重组菌(第二次同源重组)。通过一对PCR引物，鉴定wboA基因缺失的重组菌。对获得的重组布鲁氏菌进行形态学、血清学及基因水平检测，并对重组菌安全性、免疫保护性进行鉴定。
[0017]3.疫苗制备对安全性和免疫原性良好的重组菌，按布鲁氏菌S2株作为生产菌株生产布鲁氏菌活疫苗的常规方法(参照(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，本发明简称《规程》)，接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗。用于预防布鲁氏菌病。
[0018]发明的详细描述
[0019]本发明所涉及基因为与光滑型表型相关的布鲁氏菌WboA基因。本发明所涉及基因重组技术包括:利用含蔗糖敏感基因的穿梭质粒介导，筛选wboA基因缺失的重组布鲁氏菌。
[0020]本发明通过2次同源重组，无痕缺失了光滑型牛种布鲁氏菌2308株的wboA基因第l_897bp之间的序列，最终筛选获得了粗糙型重组牛种布鲁氏菌，命名为牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus) r2308- Δ WboA 株。
[0021]1.重组布鲁氏菌的构建及筛选 [0022]本发明利用同源重组及蔗糖敏感基因的负筛选技术，成功构建了 WboA基因第l-897bp之间的序列缺失的重组牛种布鲁氏菌r2308- Λ WboA株，该重组菌株由光滑型转变为了粗糙型。重组菌在培养基上传20代后，遗传性状稳定。动物试验表明重组菌的安全性不低于目前我国广泛使用牛种布鲁氏菌疫苗株Α19，该重组菌免疫动物后产生的抗体不干扰布病的临床诊断。
[0023]具体操作方法如下:
[0024](I)PCR扩增wboA基因上、下游同源臂
[0025]引物设计:
[0026]上游同源臂引物(序列I和序列2):
[0027]FffboaL 5，-CGCAGAGCTCGCATCCAGATACATTGAAC-3，(含 SacI 位点)；
[0028]Rffboal 5，-CCGTTCTAGAACTGATTTCCCGTGTCAAC-3，(含 XbaI 位点)。
[0029]下游同源臂引物(序列3和序列4):
[0030]Fmioa^f -ATGCTCTAGAGACAAGGAGTATGCGCAGC-3，(含 XbaI 位点);
[0031]Rwt—5’ -CACGGCATGCTGACCTGATAACACGACTA-3’ (含 SphI 位点)。
[0032]用TAKARA(大连宝生物工程公司)的细菌基因组提取试剂盒(Lot:9763)，参照说明书(见附件I)提取牛种布鲁氏菌2308株菌基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板扩增wboA上、下游的基因片断。PCR反应程序为:95°C变性5min ；95°C 50s—54°C 50s—72°C lmin，进行30个循环，72°C延伸lOmin。获得的上游同源臂标注为L，下游同源臂标注为R。
[0033](2)构建用于同源重组的穿梭质粒。
[0034]I) pUC-L-R质粒的构建
[0035]将以上⑴项中PCR获得的左侧同源臂L，用SacI和XbaI酶双酶切后，克隆进同酶处理的PUC18质粒中，按常规方法筛选重组质粒pUC-L ;将其与(I)项中PCR获得右侧同源臂R均用XbaI和SphI双酶切后，连接、转化，筛选重组质粒pUC-L-R。
[0036]2)穿梭质粒pLR-SacB的构建
[0037]设计引物F: 5’ -CGCAGTCGACGCATCCAGATACATTCAAC-3’ (含 SalT 位点，序列 5) ；R:5，-CAAAcccgggTGACCTGATAACACGTCTA-3，(含 SmaI 位点，序列 6)，以 pUC_L_R质粒为模板，扩增出包含上、下游同源臂(LR)的大小为1800bp的序列。将该PCR产物用Sal和Sma酶切后，克隆进同酶处理的PUC-SacB质粒(本实验室构建保存)中，获得重组质粒pLR-SacB。
[0038](3)制备牛种布鲁氏菌2308的电转化感受态细菌
[0039]将单个CFU的2308株菌接种于含100mL TSB培养基中培养瓶中，37 °C培养至对数期中期，将培养瓶转移至冰水中充分冷却。12000r/min离心10min，弃去培养基，再分别用100ml、50ml、10m、5m、2ml灭菌生理盐水各离心洗漆一次。最后将获得的菌体重悬于Iml 10%的甘油水溶液中，此即为待用的感受态细菌。
[0040](4)电转化和筛选
[0041 ] I)电转化将3 μ g pLR-SacB质粒加入到50 μ I牛种布鲁氏菌2308株菌感受态细菌中。混匀后转移到电极杯中。电击电压:2.5KV ;电击时间:5毫秒。电击完成后，加入1mlSOC培养基，置37°C摇振培养4h后，将全部菌落涂布到含50 μ g/ml氨苄青霉素的TSA平板上，37°C培养72h。
[0042]2)用于鉴定第二次同源重组成功的PCR引物
[0043]设计如下引物(序列7和序列8):
[0044]F389:5’ -AATGAGCTATTCCCGC-3’ (位于 WboA 阅读框上游-44 到-28 位。)
[0045]R389:5’ -TAGCCGATAAACACGC-3’ (位于 WboA 阅读框下游 1243 到 1258 反向互补位。)
[0046]阳性重 组菌的预期大小为389bp，非重组菌的PCR产物大小为1302bp。
[0047]3)筛选挑取平板上单个菌落(第一次重组菌)，接种到不含氨苄的TSB培养液中，37°C摇振培养6~8h，将菌液用生理盐水进行1:10、1:100和1:1000稀释，每稀释度各取菌液100 μ I涂布含5%蔗糖的TSA平板，37°C培养72h。挑取蔗糖平板上生长的菌落，用鉴定引物进行菌落PCR，筛选阳性重组菌。对PCR筛选获得的阳性菌，进一步用凝集试验验证其粗糙型特性。提取重组菌的基因组DNA，以F389和R389为引物进行PCR，并将PCR产物进行克隆和序列测定，结果证实WboA基因l_897bp之间的序列已经缺失，获得的重组菌命名为布鲁氏菌(Brucellaabortus) r2308_ Δ WboA株,本菌株已于2014年05月日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心CGMCC N0.。
[0048]2.布鲁氏菌r2308_ Λ WboA株的生物学特性
[0049](I)形态和生化特性布鲁氏菌r2308_AWboA株菌为革兰氏染色为阴性。菌体为球杆菌，单个散在，无鞭毛，不形成芽孢和荚膜，大小约0.6~2.5 μ m。生化试验为硫化氢试验阳性。
[0050](2)培养特性重组牛种布鲁氏菌r2308-AWboA株菌，在ρΗ6.4~6.8的胰大豆琼月旨(TAB)或其他适宜培养基(如马丁汤、胰际琼脂、肉肝汤等)上生长良好；静止培养易出现沉淀，振摇后液体浑浊、不透明。
[0051](3)粗糙型特性牛种布鲁氏菌r2308_ AWboA株菌的热凝集试验、Π丫唳黄凝集试验、菌落结晶紫染色试验结果符合粗糙型牛种布鲁氏菌的特点，即热凝集试验阳性，吖啶黄凝集试验阳性，能被结晶紫染色。
[0052](4)血清学特性将牛种布鲁氏菌2308株菌和重组牛种布鲁氏菌r2308_ Δ WboA株菌培养物制成灭活抗原注射小鼠2次，间隔I个月，第二次接种I个月后采血分离血清。布鲁氏菌2308株的抗血清与布鲁氏菌M5株、M28株、A387株和A19株等光滑型布鲁氏菌凝集反应为阳性；与布鲁氏菌r2308-Λ WboA株和Ml 11株等粗糙型布鲁氏菌凝集反应为阴性；而布鲁氏菌r2308- Δ WboA株抗血清与2308株、M5株、M28株、A387株和A19株等光滑型布鲁氏菌凝集反应为阴性，与粗糙型布鲁氏菌Mlll株凝集反应为阳性(见表1)。结果表明布鲁氏菌r2308-AWboA株菌免疫小鼠后，其血清不含有对光滑型布鲁氏菌的凝集类抗体。
[0053]表1布鲁氏菌r2308_ Δ WboA株血清学检查结果[0054]
【权利要求】
1.一种单基因缺失粗糙型布鲁氏菌的疫苗生产菌株，其特征在于采用非抗性无痕缺失技术，缺失了布鲁氏菌2308株WboA基因l-897bp之间的序列，构建了能够不干扰布病临床诊断的粗糙型重组布鲁氏菌r2308-AWboA株，用该菌制备的布鲁氏菌病活疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，本牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)r2308-Λ WboA株已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为=CGMCC N0.8885。
2.一种布鲁氏菌病疫苗，其特征在于该疫苗含有活的布鲁氏菌CGMCC N0.8885株和兽用生物制品常用的冻干保护剂。
3.如权利要求2所述一种布鲁氏菌病疫苗的制备方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为重组菌的培养基，灭菌后按培养基量的按1%~2%接入布鲁氏菌CGMCC N0.8885株种子菌液，370C，按常规方法发酵培养28~38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为单基因缺失粗糙型r2308- Δ WboA株布鲁氏菌病疫苗。
4.一种基因缺失粗糙型布鲁氏菌的鉴别诊断，其特征在于用如序列7和序列8所述序列的一对特异性引物，通过PCR方法可以与非重组的原始菌相区分。
【文档编号】C12R1/01GK104004697SQ201410241278
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】丁家波, 王楠, 李慧娇, 王忠田, 王芳, 蒋卉, 顾进华, 宁宜宝, 张广川, 毛开荣, 戴志红, 李宁, 印春生 申请人:中国兽医药品监察所