羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA及制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA及制备方法与应用。本发明通过以羊布鲁氏菌M5基因组DNA为模板，PCR扩增得到znuA基因的上、下游同源臂；将znuA基因的上、下游同源臂连接，得到片段ΔznuA；将片段ΔznuA克隆至载体pRE112上，得到自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA；将该质粒导入羊布鲁氏菌M5细胞中，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子，再将同源重组单交换子涂布于选择培养基上，得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA。该菌株较M5菌株，具有良好的生长特性和遗传稳定性，毒力小且免疫效果相当，因此，其有望成为新型疫苗进行应用。
【专利说明】羊布鲁氏菌重组菌株M5- Δ znuA及制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于重组细菌疫苗领域，特别涉及一株羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)重组菌株Μ5-Δ znuA及制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，防控该病一直是以应用疫苗进行预防为主。布鲁氏菌疫苗种类较多，传统弱毒苗造价便宜、免疫保护持续时间长、免疫保护效率高，但存在毒性较大易返祖、无法区分人工免疫与自然感染等缺点；重组蛋白疫苗与DNA疫苗具有安全性高、制备工艺简单、方便储藏运输等优点，但也存在免疫效果差、保护性有限的缺点；灭活疫苗虽在使用时较安全，但由于保护期短、制备成本高而难以广泛应用。目前，用于布鲁氏菌病防控的减毒菌株主要有国外的牛型19号弱毒菌株(S19)和羊型ReV.1弱毒菌株，国内研制的羊型5号(M5)弱毒菌株和猪型2号(S2)弱毒菌株,但是弱毒疫苗同样存在缺陷，这些光滑型布鲁氏菌弱毒疫苗免疫动物后，会在动物机体诱导产生S-LPS抗原“O”链特异性抗体，很难与野毒株布鲁氏菌感染相区分从而干扰常规布鲁氏菌病的诊断。若广泛应用这样的疫苗就对该病流行病学调查、探查疫源产生很大的障碍，除此之外，现有的布鲁氏菌的减毒活疫苗都会对动物产生不同程度的副作用，再引起动物轻度流产的同时也会感染人类。所以构建安全性高、无返祖、能区分自然感染与人工主动免疫、保护性能好的布鲁氏菌标记弱毒疫苗是当务之急。
[0003]此外，布鲁氏菌的生存和增殖必须依赖于环境或宿主之中的多种过渡金属离子。尤其锌离子，是布鲁氏菌结构所必须的金属离子，是菌体内催化反应的辅助因子，因此，获得适当程度的锌对细菌来说非·常重要。但是由于宿主体内游离的锌离子含量非常少，为了摄取足够的锌保证细菌自身的新陈代谢，并在宿主体内大量增殖，各种细菌如布鲁菌进化出几种类型的蛋白参与摄取和转运锌离子，这些转运锌离子的蛋白操纵系统被命名为ZnuABC，此系统包括ZnuA、znuB、znuC基因编码的多种蛋白，其中ZnuA是一种细胞周质-溶质结合蛋白，目前对该基因的机理研究仍较少，仅推测该ZnuA蛋白与布鲁菌毒力因子相关。本研究旨在获得一株既能减低毒力、提高安全性，又能维持疫苗的高效免疫原性的布鲁氏菌病弱毒疫苗，我们将表达ZnuA蛋白的基因敲除，以获得一株羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)重组菌株Μ5-Δ znuA及制备方法和应用，为制备更为安全有效的新型基因工程疫苗奠定基础。
【发明内容】
[0004]为了克服上述现有疫苗的缺点与不足，研究布鲁氏菌znuA基因缺失对疫苗菌株的影响。
[0005]本发明的首要目的在于提供一株羊布鲁氏菌重组菌株Μ5-Λ znuA的制备方法。
[0006]本发明另一目的在于提供通过上述制备方法得到的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA。[0007]本发明再一目的在于提供上述羊布鲁氏菌重组菌株M5- Δ znuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用。
[0008]本发明的目的通过下述方案实现:
[0009]一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，包括以下步骤:
[0010](I)自杀性同源重组质粒的构建
[0011]①以羊布鲁氏菌(Brucella melitensis) M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的弓丨物为Pl和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；
[0012]Pl:5/ ~GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC~3/ (横线部分为 KpnI 酶切位点)；
[0013]P2:5/ -TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3'；
[0014]P3:5/ -GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3/ ；
[0015]P4:5/ -AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3'(横线部分为 Sacl 酶切位点)；
[0016]②利用Overlap PCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，Pl和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段AznuA ；
[0017]③用KpnI和Sac I分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段Δ znuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段Λ znuA和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE- Δ znuA ；
[0018](2)羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选
[0019]①将自杀性同源重组质粒pRE-AznuA导入羊布鲁氏菌M5的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子JfPCR鉴定正确的同源重组单交换子在胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉汤培养基(TSB-YE)中培养，松弛质粒抗性；
[0020]②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE- Δ znuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物Pl和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-Λ znuA ;
[0021]步骤(1)①中所述的PCR的条件优选为94°C 2min预变性；98°C 10s,56°C 30s、68°C 1.5min, 30 个循环；68°C 5 ~IOmin 终延伸；
[0022]步骤(1)②中所述的Overlap PCR的条件优选为94°C 2min预变性；98°C 10s、56°C 30s,68°C 3min,30 个循环；68°C 5 ~IOmin 终延伸；
[0023]步骤(2)①中所述的导入的方式优选为通过电转化方式导入；
[0024]所述的电转化的条件优选为1mm电极杯，1.8kv，400 Ω ；
[0025]步骤(2)①中所述的氯霉素在所述的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)中的终浓度优选为5 μ g/mL ；
[0026]步骤(2)①中所述的培养的条件优选为37°C、200r/min摇床上培养约18h ；
[0027]步骤(2)①中所述的PCR鉴定为通过引物Pl和P4进行鉴定；
[0028]步骤(2)①中所述的PCR鉴定的条件优选如下:94°C 2min预变性；98°C 10s、56°C 30s,68°C 3min，30 个循环；68°C 5 ~IOmin ；
[0029]步骤(2)②中所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下:胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)+终浓度为质量体积比(g/mL) 7%的蔗糖；
[0030]所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基优选通过如下步骤制备得到:将配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)灭菌后，降温至60~70°C时加入经过滤除菌的浓度为质量体积比(g/mL) 50%的蔗糖，使得其终浓度为质量体积比(g/mL)7%，混合均匀后分装入灭菌平皿内，凝固后4°C保存。
[0031]步骤(2)②中所述的培养的条件优选为37°C培养48~96h ；
[0032]一株羊布鲁氏菌重组菌株M5- Δ znuA,通过上述制备方法得到。
[0033]上述羊布鲁氏菌重组菌株M5- Δ znuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用。
[0034]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果:
[0035](I)本发明提供的羊布鲁氏菌重组菌株Μ5-Δ znuA较亲本株M5具有较低的毒力，接种BALB/c小鼠后，脾脏肿胀程度小、重量指数低、炎性反应弱、脾脏菌数量少且清除出体外的速度快。同时，该菌株保持了良好的免疫原性，产生的抗BLS及L7/L12的抗体水平与亲本株M5相当。
[0036](2)实验证明本发明提供的羊布鲁氏菌重组菌株Μ5-Δ znuA具有良好的遗传稳定性，其生长特性和免疫保护效果与羊布鲁氏菌亲本疫苗株M5相比均无明显差异。
[0037](3)本发明提供的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔZnuA为制备更为安全有效的新型基因工程疫苗奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1是znuA基因的上、下游同源臂基因片段及其上、下游同源臂基因片段OverlapPCR得到的基因片段AznuA的琼脂糖凝胶电泳图，其中:泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为znuA的上游同源臂基因片段，泳道2为znuA的下游同源臂基因片段，泳道3为znuA基因的上、下游同源臂基因片段相连得到的基因片段AznuA。
[0039]图2是pRE-AznuA酶切验证结果的琼脂糖凝胶电泳图，其中:泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为未经酶切的pRE-AznuA质粒，泳道2为使用KpnI和SacI双酶切P RE- Δ znuA质粒后得到的片段。
[0040]图3是羊布鲁氏菌基因缺失株Μ5-Λ znuA同源重组单交换子筛选的琼脂糖凝胶电泳图，其中:泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为pRE- Δ znuA阳性对照，泳道2为M5阳性对照，泳道3~6为M5- Δ znuA株同源重组单交换子；泳道7为空白对照。
[0041]图4是羊布鲁氏菌基因缺失株M5- Δ znuA同源重组双交换子筛选的琼脂糖凝胶电泳图，其中:泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为pRE- Δ znuA阳性对照，泳道2为M5阳性对照，泳道3~20为同源重组双交换子，泳道21为空白对照。
[0042]图5是羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA遗传稳定性的验证结果图，其中:泳道M为DNA分子质量标准，泳道I为pRE- Δ znuA阳性对照，泳道2为M5阳性对照，泳道3~12分别为M5-ΔznuA第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20代菌落，泳道13为空白对照。
[0043]图6是羊布鲁氏菌亲本株M5和重组菌株Μ5-Δ znuA生长曲线的测定结果图。
[0044]图7是羊布鲁氏菌亲本株M5和重组菌株Μ5-Δ znuA免疫小鼠后对小鼠脾脏重量影响的结果图。[0045]图8是羊布鲁氏菌亲本株M5和重组菌株Μ5-Λ znuA免疫小鼠后对小鼠脾脏菌数量检测的结果图。
[0046]图9是羊布鲁氏菌亲本株M5和重组菌株M5-AznuA免疫小鼠8周后小鼠血清特异性抗体的ELISA检测结果图。
【具体实施方式】
[0047]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0048]实施例中所涉及的材料:
[0049]①KOD FX DNA Polymerase高保真酶购自Τ0Υ0Β0公司；限制性内切酶Kpn I,Sac
1、T4DNA连接酶、DNA Marker等购于TaKaRa公司；胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒为Omega公司产品；QIAamp DNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、琼脂粉购于广东环凯微生物科技有限公司；酵母提取物(Yeast Extract，简称YE)购自OXOID公司。
[0050]胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉汤培养基(TSB-YE)通过如下步骤制备得到:胰蛋白胨大豆肉汤30g、YE2g，溶解于1000mL三蒸水中，加热混合均匀，121°C高压灭菌15min，冷却后
置于4°C保存。
[0051]胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)通过如下步骤制备得到:胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)30g、YE2g，溶解于1000mL三蒸水中，加入琼脂粉至终浓度为1.5% (w/v)，加热搅拌均匀后，121°C高压灭菌15min，待冷却至60°C左右分装入灭菌平皿内，凝固后4°C保存。
[0052]含氯霉素的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)通过如下步骤制备得到:将配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)灭菌后，降温至40~50°C时加入氯霉素(终浓度为5μ g/mL)，混合均匀后分装入灭菌平皿内，凝固后4°C保存。
[0053]TSA-YE-Sucrose选择培养基通过如下步骤制备得到:将配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)灭菌后，降温至60~70°C时加入经过滤除菌的浓度为质量体积比(g/mL) 50%的蔗糖，使得蔗糖的终浓度为质量体积比(g/mL) 7%，混合均匀后分装入灭菌平皿内，凝固后4 °C保存。
[0054]②羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)M5株购于新疆天康畜牧生物技术股份有限公司；
[0055]③以下生物材料均已在文献“布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建，中国兽医科学，2011，41 (03):280-286”公开:大肠杆菌DH5 α λ pir (基因型为supE44ΔlacU169 ( Φ801acZΔM15)hsdR17recAlendAlgyrA96th1-relAlλ pi )及 pRE112 自杀质粒(cat, sacB, oriTep4, oriVE6K, MCS)。
[0056]④以下方法均已在专利申请“牛布鲁氏菌重组菌株S19-Abp26_BL及其制备方法与应用，201310153715.6”中公开:BL融合蛋白的制备方法。
[0057]实施例1
[0058](I)自杀性同源重组质粒的构建
[0059]①菌基因组DNA的提取:按照QIAamp DNA抽提试剂盒说明提取羊布鲁氏菌M5株基因组DNA。
[0060]②引物的设计与合成:参考Genbank中羊布鲁氏菌(CP001489.1)的基因序列，根据实验的需求设计引物，如表1所示。其中引物Pl和P2用于扩增znuA基因的上游同源臂、引物P3和P4用于扩增znuA基因的下游同源臂，并分别于引物Pl和P4的5'端引入KpnI和SacI的酶切位点。上述引物均由上海立菲生物技术有限公司合成。
[0061]表1用于扩增不同基因片段的PCR引物序列
[0062]
【权利要求】
1.一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (O自杀性同源重组质粒的构建 ①以羊布鲁氏菌(Brucellame I i tens i s ) M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为Pl和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；
Pl:5/ -GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3/ ；
P2:5/ -TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3'；
P3:5/ -GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3/ ；
P4:5/ -AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3'； ②利用OverlapPCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，Pl和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段Λ znuA ； ③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段ΛznuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段Λ znuA和载体片段PRE112连接，得到自杀性同源重组质粒 pRE- Δ znuA ； (2)羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选 ①将自杀性同源重组质 粒pRE-AznuA导入羊布鲁氏菌M5的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的TSA-YE平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子^fPCR鉴定正确的同源重组单交换子在TSB-YE培养基中培养，松弛质粒抗性； ②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒PRE- Δ znuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物Pl和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA; 所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下:胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+终浓度为质量体积比7%的蔗糖。
2.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于:步骤(1)①中所述的 PCR 的条件为 94°C 2min ；98°C 10s、56°C 30s,68°C 1.5min,30 个循环；68。。5~IOmin终延伸。
3.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于:步骤(1)②中所述的Overlap PCR的条件为94°C 2min预变性；98°C 10s,56°C 30s、68°C 3min,30 个循环；68°C 5 ~IOmin 终延伸。
4.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于:步骤(2)①中所述的导入的方式为通过电转化方式导入。
5.根据权利要求4所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于:所述的电转化的条件为1mm电极杯，1.8kv,400 Ω。
6.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于:步骤(2)①中所述的氯霉素在所述的TSA-YE培养基中的终浓度为5 μ g/mL。
7.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于:步骤(2)①中所述的培养的条件为37°C、200r/min摇床上培养36~48h ； 步骤(2)②中所述的培养的条件为37°C培养48~96h。
8.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于:步骤(2)①中所述的PCR鉴定为通过引物Pl和P4进行鉴定； 所述的PCR鉴定的条件如下:94°C 2min预变性；98°C 10s、56°C 30s,68°C 3min，30个循环；68°C 5 ~lOmin。
9.一株羊布鲁氏菌重组菌株Μ5-Δ znuA,其特征在于:通过上述制备方法得到。
10.权利要求9所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δ znuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用 。
【文档编号】C12R1/01GK103571867SQ201310542575
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】陈金顶, 马思思, 王佳莹, 刘翠翠, 吴云燕, 赵明秋 申请人:华南农业大学